青年科学工作者论坛2007年第3期
论著
补钙对12~17岁青少年锌、铁吸收率的影响
尹婧 张倩 王晓燕 杜维婧 王筱桂 李卫东 胡小琪 马冠生[1]
中国疾病预防控制中心营养与食品安全所，北京 100050
摘要：目的 通过代谢平衡实验探讨补钙对中国青春期少年锌、铁吸收率的影响。方法 从320名参加1年补钙实验的4组12~17岁少年中，每组随机抽取男、女生各10人，共80人。采用代谢平衡的方法，收集研究对象10天内摄入的食品、排出的粪便和尿液样品，用电感耦合等离子体发射光谱法测定样品中的钙、铁、锌含量。结果 不同补钙组之间钙摄入量有差异，但铁、锌摄入量差异没有显著性。不同补钙组之间钙、铁、锌的表观吸收率差异无显著性。男生钙、铁、锌的表观吸收率平均为69.4%、12.5%和29.9%，女生的分别为46.4%、20.9%和35.3%。铁的表观吸收率与青春发育水平有关。男生钙摄入量为600~800mg/d时，钙、铁、锌的表观吸收率均处于相对较高水平（75.3%、23.2%和36.4%）。结论 钙摄入量低于1400mg/d时，不影响12~17岁少年锌、铁的吸收率。当男生钙摄入量为600~800mg/d时，更有助于钙、铁、锌的吸收。
中图分类号：R151.42 R153.2 文献标识码：A
Effect of calcium supplementation on absorption rate of zinc and iron in 12-17 years old adolescents
YIN Jing, ZHANG Qian, DU Wei-jing, WANG Xiao-yan, et al.
Institute for Nutrition and Food Safety, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100050, China
Abstract: Objective To study the effect of calcium supplementation on absorption rate of zinc and iron by calcium metabolic balance study. Methods A total of 80 students (12-17 years old) were selected randomly from 320 subjects who had been supplemented with calcium supplementation for one year. 10 boys and 10 girls were randomly selected from each calcium supplementation group to attend a 10-day metabolic balance study. Samples of foods, feces and urine were collected. Calcium, zinc and iron in samples were measured with ICP-AES. Results There were significant differences of calcium intake, but were no differences of iron and zinc intake for 4 groups. The apparent absorption rate of calcium, iron and zinc in boys and girls were 69.4%, 12.5%, 29.9% and 46.4%, 20.9%, 35.3%, respectively. Absorption rates of iron were associated with pubertal stages. There were no significant differences of absorption of calcium, iron and zinc for 4 groups. Apparent absorption rates of calcium, iron and zinc seemed higher (75.3%, 23.2% and 36.4%) when the level of calcium intake were 600-800mg/d in boys. Conclusion There were no significant effects on absorption rate of iron and zinc when the level of calcium intake was 1400mg/d in 12-17 years old Chinese adolescents. Absorption rates of calcium, iron and zinc seemed higher when the level of calcium intake was 600-800mg/d in boys.
Key words: calcium supplementation, zinc and iron absorption rate, adolescent
2002年中国居民营养与健康状况调查发现，中国居民钙摄入量平均为388.8mg/d[1]，远远低于中国的钙膳食参考摄入量（dietary reference intakes，DRIs）。与国外人群相比，中国骨质疏松症的患病率也比较低[2]，因此中国居民的钙需要量可能低于国外其他种族人群的需要量。因此十分有必要依据中国青少年的钙代谢特点，制定中国青少年的钙DRIs。
在制定人体的钙需要量时，不仅要考虑钙摄入量对骨量的影响，也要考虑高钙摄入对其他矿物质元素代谢的影响，如铁和锌是维持人类健康的必需微量元素，他们的缺乏一直是一个全球关注的问题，尤其是发展中国家的妇女和儿童铁和锌的缺乏[3]。膳食中钙、铁、锌等矿物质吸收利用可能存在复杂的相互作用[4]。而目前中国通过人体代谢的方法探讨青少年摄入的多种矿物间相互影响的研究还比较少。本研究通过代谢平衡法，分析了中国12~17岁补钙少年钙、铁、锌的代谢特点，探讨了不同钙摄入水平下，机体对钙、铁、锌的吸收利用状态，为制定符合中国青春期少年代谢特点的钙DRIs提供科学依据。
1 对象与方法
1.1 研究对象及分组
本次钙代谢平衡研究是对研究对象进行1年补钙干预试验后开展。补钙试验将从北京市某中学（15.1±0.8）岁学生抽取的320人随机分为4组，男女各半。补钙干预分组为：第1组（日常膳食组＋碳酸钙63mg/d），第2组（日常膳食组＋碳酸钙354mg/d），第3组（日常膳食组＋碳酸钙660mg/d），第4组（日常膳食组＋碳酸钙966mg/d）。
进行钙代谢平衡实验时，从每个补钙组中随机抽取男、女生各10人，共80人参与钙代谢研究。所有参与者具备以下条件：自愿参加，身体健康，没有患影响骨代谢的肝、肾疾病和骨骼系统疾病。
本研究经中国疾病预防控制中心营养与食品安全所伦理评审委员会同意，并由家长签署了知情同意书。
1.2 问卷调查及体格测量
通过面对面询问调查是否出现首次遗精和月经初潮及出现的时间。由经过培训的调查员采用标准的方法测量身高、体重和Tanner分期。
1.3 代谢实验
共10天，前3天为适应期，后7天为实验期。代谢实验期间，研究对象仍然按照补钙干预的分组服用钙片。收集调查对象10天的饮食（包括三餐、零食和饮用水）、24h粪便和尿样。
1.3.1 实验膳食的给予与收集：以全国大规模营养调查为依据，并结合当地饮食习惯和市场供应时令蔬菜情况，设计3天食谱，实验期内重复使用。每天由经过培训的调查员准确称量和记录每人各种食物的净摄入量。收集每种食物样品，用不锈钢食品打碎机制备均匀样品，置于-20℃冰箱中保存。
1.3.2 现场人体代谢实验和流程：采用集中食宿，受试者不能食用实验提供食物以外的任何食物和饮料。先给实验对象3天的实验膳食适应，然后以3天为1个食谱周期，食用7天的实验膳食。
1.3.3 粪便和尿液的收集：第4天和第11天早餐前分别服用卡红胶囊2粒（200mg）以标记粪便。自粪便出现红色染料（卡红）起，收集每个受试对象的全部粪便，直至D11服用的红色染料在粪便中出现为止。粪便每24h收集1次，记录粪便重量和兑入水的重量，用不锈钢食品打碎机混匀样品后，-20℃保存。收集研究对象实验期每天24h的全部尿液，加入1%盐酸溶液，混匀称量后，-20℃保存。
1.3.4样品的测定：粪便和尿样按照10%的平行样，食物全部取双份样品，以猪肉粉（国家标准物质研究所）为标准物质，经湿法消化后，采用电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-AES）（Optima 3000，美国PE公司）测定样品中的钙、铁、锌含量。
1.4 统计分析
数据录入后进行核对、清理。根据数据类型，采用单因素方差分析或Kruskal-Wallis检验比较补钙组间差异，采用Spearman相关分析吸收率与其他因素的相关性。将钙摄入量和钙、铁、锌的吸收率进行曲线拟合。表观吸收率的计算公式如下：
2 结果
2.1 一般情况
有5名男生和2名女生的代谢样品收集不全，依从性不好，将这7人从总体中剔除。研究对象的年龄为12~17岁，各补钙组之间的年龄、身高、体重、BMI差异无显著性，均衡性比较好。代谢实验时87.7%的研究对象已经历月经初潮或首次遗精，各组间达到Tanner 4期和5期的人数比例没有显著差异。见表1。
表 1 研究对象的一般情况
Table1 The characteristics of the subjects
|
性别
|
组别
|
n
|
年龄
(岁)
|
身高
(cm)
|
体重
(kg)
|
BMI
|
n1(1)
|
|
男生
|
第1组
|
9
|
15.3±0.7
|
167.3±8.6
|
63.6±18.6
|
22.6±6.1
|
7
|
|
第2组
|
10
|
15.5±0.5
|
169.0±5.2
|
57.7±9.2
|
20.2±2.4
|
9
|
|
|
第3组
|
9
|
15.3±0.5
|
170.4±9.8
|
59.8±6.2
|
20.7±2.5
|
5
|
|
|
第4组
|
7
|
15.2±0.7
|
166.4±5.1
|
56.8±13.4
|
20.3±3.5
|
5
|
|
|
P
|
|
0.731
|
0.729
|
0.704
|
0.551
|
0.421
|
|
|
女生
|
第1组
|
10
|
14.6±1.1
|
159.0±5.6
|
53.3±12.1
|
20.9±3.6
|
6
|
|
第2组
|
8
|
14.9±0.8
|
157.9±6.5
|
52.7±10.7
|
21.0±3.1
|
4
|
|
|
第3组
|
10
|
15.0±1.1
|
159.0±6.0
|
52.5±6.3
|
20.7±2.1
|
7
|
|
|
第4组
|
10
|
14.7±0.8
|
159.9±6.1
|
51.1±6.7
|
19.9±1.7
|
4
|
|
|
P
|
|
0.789
|
0.918
|
0.961
|
0.826
|
0.581
|
注：（1）n1：Tanner4期和5期人数，（2）单因素方差分析，χ2检验
2.2 钙、铁、锌的摄入量
由表2可见，通过服用钙片，不同补钙组之间每日总钙摄入量差异有显著性，最低组为352.44mg，最高组为1313.29mg。但不同补钙组之间铁、锌摄入量差异不显著，男生的铁、锌摄入量均高于女生（P<0.05）。
表 2 补钙4组间钙、铁、锌代谢情况的比较
Table 2 Comparison on metabolism of Ca,Fe and Zn between 4 groups of Ca supplementation
|
性别
|
组别
|
摄入量（mg/d）
|
吸收率(%)(1)
|
||||
|
钙
|
铁
|
锌
|
钙
|
铁
|
锌
|
||
|
男生
|
第1组
|
427.1±48.2
|
14.6±4.5
|
9.7±2.2
|
69.3
|
12.1
|
24.8
|
|
第2组
|
723.6±64.6
|
14.9±4.4
|
9.7±2.7
|
75.3
|
23.2
|
36.4
|
|
|
第3组
|
1002.3±46.2
|
13.6±4.1
|
9.1±1.9
|
71
|
10.7
|
34.8
|
|
|
第4组
|
1313.3±80.4
|
14.2±4.3
|
9.1±2.7
|
61.3
|
2.7
|
22.9
|
|
|
合计
|
809.0±357.0
|
9.4±1.6
|
8.0±1.2
|
46.4
|
12
|
30.3
|
|
|
P
|
0.000
|
0.938
|
0.899
|
0.251
|
0.315
|
0.325
|
|
|
女生
|
第1组
|
352.4±51.3
|
9.6±1.6
|
8.4±1.3
|
55
|
22.5
|
43.7
|
|
第2组
|
619.9±40.9
|
8.6±1.5
|
7.3±1.1
|
47.6
|
19.8
|
31.6
|
|
|
第3组
|
965.6±39.1
|
9.9±1.6
|
7.9±0.8
|
43
|
23.2
|
33.4
|
|
|
第4组
|
1260.2±40.8
|
9.2±1.3
|
8.4±1.3
|
40.4
|
18.1
|
31.8
|
|
|
合计
|
838.9±327.9
|
14.3±4.2
|
9.5±2.3
|
68.7
|
20.8
|
34.5
|
|
|
P
|
0.000
|
0.306
|
0.205
|
0.136
|
0.834
|
0.138
|
|
注：（1）单因素方差分析，Kruskal-Wallis检验
2.3 钙、铁、锌的表观吸收率
不同补钙组之间钙、铁、锌的表观吸收率差异无显著性。观察吸收率随钙摄入量的变化趋势图发现，男生钙、铁、锌的表观吸收率随着钙摄入量的增加呈先上升后下降的趋势，钙摄入量为600~800mg/d时，钙、铁、锌的表观吸收率均处于比较高的水平。女生钙的表观吸收率随着钙摄入量的增加整体呈下降趋势，但铁、锌的表观吸收率比较稳定。见表2和附图。
附图 钙、铁、锌的吸收率随钙摄入量的变化
Figure Trend of absorption rate of calcium, zinc and iron followed calcium intakes
2.4 钙、铁、锌的表观吸收率与钙摄入量和青春期发育水平的关系
通过Spearman相关分析发现，钙的表观吸收率与性别（r=0.64，P<0.05）、钙摄入量（r=-0.24，P<0.05）有关，男生的钙表观吸收率高于女生，随着钙摄入量的增加，钙表观吸收率总体呈下降趋势。但铁、锌的表观吸收率与性别、钙摄入量无关。铁的表观吸收率与青春发育水平呈显著正相关（r=0.24，P<0.05）。
3 讨论
在本研究开始前，研究对象已经参与1年的碳酸钙补充实验，各补钙组的钙代谢情况已经比较稳定。不同补钙组之间的BMI水平及青春发育情况无差异，便于进行组间比较。
3.1 铁、锌摄入量与吸收率
2002年中国居民营养与健康状况调查显示，中国14~17岁少年的铁摄入量：男性23.0mg/d、女性20.5mg/d，锌摄入量：男性11.7mg/d、女性10.0mg/d[5]。本次调查的研究对象铁、锌摄入量都没有达到中国的DRIs标准[6]，低于全国水平，其中铁摄入量尤为低。除了研究对象不同，存在地区性差异，更可能的原因是这2项研究对膳食营养素分析的方法不同。全国调查利用的是膳食回顾法、食物称重记帐法和食物频率法，而本研究通过称重法获得研究对象的进食量，并直接测定样品中的钙、铁、锌，得到的钙、铁、锌摄入量相对更准确。
有研究发现4~6岁学龄前儿童代表性膳食中铁的吸收率为6.10%[7]，锌的吸收率为12.94%[8]。24岁丹麦妇女进食一般膳食时，非血红素铁的吸收率为7.4%[9]。通过口服同位素评价藏族18岁青年男子膳食铁的吸收率为13.4%[10]。本研究发现，铁的吸收率与青春发育水平有关，而且低剂量补钙组少年的铁、锌的吸收率比较高，达到23.2%和36.4%，可能由于研究对象多数人出现过月经初潮或首次遗精，正处于青春发育后期，对铁、锌的需要量比较高，而膳食铁、锌摄入量比较低引起的。
3.2 补钙对铁、锌吸收率的影响
食物中带有相似化学结构的营养素在高摄入水平下会相互竞争，影响相互的吸收。在制定改善人群营养状态的策略时，针对某一种微量营养素，需要考虑它对其他微量营养素吸收和利用的影响[11]。综合考虑膳食中多种营养素的生物利用率，有利于充分发挥营养素的价值，避免因营养素间的相互作用而造成浪费。
在制定人体钙DRIs时，因此也要考虑高钙摄入对其他矿物质元素的影响，尽量选择矿物质吸收率较高时的钙摄入量水平。铁、锌的吸收率除了受机体本身的营养状况影响之外，还与多种因素有关，其中最重要的是膳食中其他成分的作用[4]。目前关于钙对铁、锌吸收率的影响一直存有争议。人体内钙含量最高，锌含量与铁相近，3种矿物质可能通过相互作用抑制机体对他们的吸收[12]。动物实验发现，给正常生长发育期的大鼠补充过量钙剂，会降低大鼠血清中的铁蛋白浓度，干扰铁的吸收利用[13]。补钙对美国学龄前儿童的铁吸收没有影响，但降低锌的吸收[14]。长期补钙对12~14岁女孩铁的营养状态没有影响[15]。但也有研究发现，（13.5±1.5）岁女孩钙摄入量增加，会轻度降低血清铁的含量[16]。膳食钙摄入量达到1500mg/d时，不影响少年女生对锌的吸收用[17]。
本研究发现，虽然各补钙组间矿物质的表观吸收率没有显著性差异，但男生钙摄入量为600~800mg/d时，钙、铁、锌的表观吸收率均处于比较高的水平，说明摄入此水平的钙能促进铁、锌的吸收，而摄入更多的钙可能不利于铁、锌的吸收。当钙摄入量达到1000mg/d以上时，钙吸收率仅为10%，铁、锌的吸收率也迅速下降，说明少年男生的钙需要量标准不宜太高，否则可能会影响铁和锌的吸收。钙的摄入在一定范围内可能不会影响少年女生铁和锌的吸收。
参考文献
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作者简介：尹婧，女，博士
1通讯作者
论著
同型半胱氨酸对人血管平滑肌细胞5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因启动子甲基化修饰及mRNA表达的影响
王丽珍 张敬各 王树人[1]
四川大学华西基础医学与法医学院病理生理学教研室，成都 610041
摘 要：目的 探讨同型半胱氨酸（Hcy）对人血管平滑肌细胞（HVSMCs）5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因启动子甲基化修饰及其mRNA表达的影响。方法 正常人脐动脉血管平滑肌细胞体外培养，在培养基中加入临床高Hcy血症相关浓度及极高浓度的Hcy (0、30、100、200、500和1000μmol/L)，并孵育72h，以MS-PCR分析MTHFR启动子区域甲基化状态，采用RT-PCR测定 MTHFR mRNA的表达水平。结果 不同浓度Hcy处理人血管平滑肌细胞后，其MTHFR基因启动子区域出现去甲基化，甲基化水平明显降低。RT-PCR结果显示MTHFR mRNA表达增加。结论 Hcy可促进人血管平滑肌细胞MTHFR启动子区域去甲基化，并使MTHFR mRNA表达增加。
关键词 同型半胱氨酸 5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶 DNA甲基化
中图分类号：R54 Q55 文献标识码：A
Demethylation in the promoter region of MTHFR gene and its mRNA expression in cultured human vascular smooth muscle cells induced by homocysteine
WANG Lizhen, ZHANG Jingge, WANG Shuren
West China college of preclinic Medical Sciences and Forensic Medicine, Sichuan University, Chengdu 610041, China
Abstract:Objective To investigate the effect of homocysteine(Hcy) on the methylation modification of 5,10-Methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR) gene promoter and its mRNA expression in cultured human vascular smooth muscle cells(HVSMCs). Methods HVSMCs from umbulical arteries were isolated and cultured in DMEM/F12 medium, which clinic-relevant and very high homocysteine concentrations (0,30,100,200,500,1000μmol/L) were added for 72h treatment. Methylation-specific polymerase chain reaction(MS-PCR) was performed to catalyze the methylation pattern of the MTHFR promoter region, semiquantitative RT-PCR was used to detect the MTHFR mRNA expression after Hcy treatment. Results The homocysteine induced demethylation in the promoter region of MTHFR gene at all concentrations of Hcy, the methylation pattern in MTHFR gene displayed significant hypomethylation and the MTHFR mRNA expression demonstrated obvious upregulation as well. Conclusion The homocysteine could induce demethylation in the promoter region of MTHFR gene in HVSMCs and upregulate the MTHFR mRNA expression.
Key words:homocysteine, 5,10-Methylenetetrahydrofolate reductase, DNA methylation
近年来表观遗传学(epigenetics)的飞速发展已逐渐揭示出环境因素对基因表达调控的许多重要机制，染色质和DNA序列的乙酰化和甲基化修饰是近年来受到最广泛关注、并被认为是基因表达的主要epigenetic调控方式。除了基因设定程序的自身调控外，营养因素，如叶酸、维生素B6、维生素、B12的缺乏也常可导致高同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）血症和基因组甲基化状态的改变。一般认为，DNA甲基化使基因静默(silence)，而去甲基化使基因活化。成年后基因组甲基化状态的改变通常被认为具致病性[1,2]。
高同型半胱氨酸（Hcy）血症被广泛认为是动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)的一个独立危险因子，其致As的机制包括损伤血管内皮细胞、促进平滑肌细胞增殖、导致氧化应激、激活炎症过程等等[3]。近年来的研究显示，高Hcy血症亦可能干扰基因的甲基化修饰，进而引起某些基因的表达异常而促进As的发生发展[4]。
Hcy为非蛋白质组成氨基酸，系各种转甲基代谢（包括DNA的甲基化修饰）的甲硫氨酸循环的中间产物。既然Hcy是甲硫氨酸循环的重要一环，其异常升高则很可能影响DNA的甲基化过程，并进而影响某些基因的表达而促进疾病的发生发展。YING等报道，人主动脉平滑肌细胞的雌激素受体-α基因启动子区的高甲基化促使其向增殖表型转化，可能参与了As的发生发展[5]。LUND等报道，在apoE缺失的小鼠，其DNA甲基化的多态性变化早于任何As的组织学证据[6]。但迄今为止，有关这些甲基化改变在As发病机制中的作用仍存在诸多争论[7,8]。
5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶（5,10-Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是催化Hcy向甲硫氨酸转化的关键酶，近年来大量的MTHFR多态性分析显示其某些点突变与高Hcy血症相关，并可能促进As的发生、发展[9]。但许多高Hcy血症也可起因于叶酸、维生素B6、B12的摄入不足[10]，Hcy的异常升高是否会反过来对MTHFR基因的甲基化状态产生致病性伤害？本研究希望通过以临床相关的高Hcy浓度直至极高浓度的Hcy处理人血管平滑肌细胞（human vascular smooth muscle cells，HVSMCs），以探讨高Hcy对MTHFR基因的甲基化修饰和基因表达会产生的影响。
1 材料和方法
1.1人血管平滑肌细胞培养
人血管平滑肌细胞取自正常脐动脉，采用组织贴块法获得。简言之，取正常脐带，迅即在无菌操作下取出脐动脉，分离血管中膜,去除外膜及内皮，并剪成约1mm3左右的小块，均匀贴附于25cm²卡式培养瓶中，加入含有20%胎牛血清(杭州四季青)的DMEM/F12培养液(Gibco)于37℃的CO2孵育箱内培养，约十天左右可见平滑肌细胞从组织块周围萌出，待原代培养细胞生长融合至75%~95%培养面用0.125%胰蛋白酶消化传代增殖，选用3~7代细胞作为实验用细胞。
1.2实验分组
对照组：正常生长的平滑肌细胞；Hcy(Sigma)处理组：不同浓度Hcy（0、30、100、200、500和1000μmol/L）作用细胞72h，每24h更换一次培养液，并添加新鲜配制的Hcy。
(30、100、200和500μmol/L为临床高Hcy血症相关浓度，同型半胱氨酸尿症病人的Hcy血浓度可达500μmol/L，1000μmol/L为极高浓度的Hcy)。
1.3 MTHFR mRNA表达的检测
1.3.1细胞总RNA提取 细胞悬液以1×105/ml接种于6孔培养板中，培养72h后胰酶消化，收集各组细胞，用TRIzol总RNA抽提试剂(TIANGEN公司)提取总RNA。
1.3.2逆转录合成cDNA 取RNA模板1μg（DOUPSON RT-PCR试剂盒）0ligo（dT）15 1μl，RNase-free H2O补齐至10μl，70℃放置5min，迅速置于冰上5min，顺序加入M-MLV 5×Buffer 4μl，dNTPS（10mmol/L）1μl，RNase Inhibitor 0.5μl，M-MLV RT 1μl，RNase-free H2O 3.5μl，37℃反应1h，75℃孵育15分钟终止反应，合成的cDNA用于PCR反应。
1.3.3 PCR扩增MTHFR基因 PCR反应体系为cDNA 1μl，10×Taq Buffer 5μl，dNTPs（10mmol/L）1μl，MTHFR上下游引物各0.5μl，内参照(β-actin)上下游引物(均由Invitrogen公司合成)各0.3μl，Taq酶1μl，补水至50μl，PCR反应条件为预变性95℃ 3min，变性95℃ 30s，退火63℃ 45s，延伸72℃1min，循环30轮后延伸10min。MTHFR引物序列正义5’-GTC TGC GGG AGC CGA TTT-3’，反义5’-CGG TTG AGG GTG TAG AAG TGG-3’，产物321bp。PCR产物于1.2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下照相，图像分析处理系统进行灰度扫描，以β-actin作为内参照比较正常对照组和Hcy组MTHFR灰度的比值，β-actin引物序列正义5’-CAC CAC ACC TTC TAC AAT GAG C-3’，反义5’-GTG ATC TCC TTC TGC ATC CTG T-3’，产物695 bp。
1.4 MTHFR基因启动子区甲基化改变的检测
1.4.1 细胞基因组DNA提取及亚硫酸钠处理 各组细胞培养72h，按DNA提取试剂盒（TIANGEN公司）说明抽提各组细胞基因组DNA，各取2μg溶于30μl 双蒸水（ddH2O），加入新鲜配制的10mmol/L氢醌18μl及3mol/L 亚硫酸钠(美国Sigma公司)312μl，pH值为5.0，50℃水浴处理16h，过柱纯化，无水乙醇沉淀并重新溶解于15μl ddH2O。DNA经亚硫酸钠处理后，CpG二核苷酸对中未甲基化的胞嘧啶被转化为胸腺嘧啶(C→T)，而甲基化的5’甲基胞嘧啶则不受亚硫酸钠处理的影响，仍为5’甲基胞嘧啶，可以后续的甲基特异性-聚合酶链反应（MS-PCR）分析其甲基化程度的改变。
1.4.2 MTHFR启动子甲基化检测：采用MS-PCR分析MTHFR启动子区域甲基化状态，以上述处理DNA为模板，分别用两对等位的MTHFR甲基化（MTHFR–M，对应于未受亚硫酸钠处理影响的5’甲基胞嘧啶）和非甲基化（MTHFR-U，对应于已被亚硫酸钠处理转化的C→T）特异性引物（Invitrogen公司）扩增该基因启动子区。引物序列和扩增条件如下表。
表1 MSP引物序列及扩增条件
Table1 PCR primers used for MSP and amplification conditions
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引物名称
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正义引物 5’- 3’
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反义引物5’- 3’
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产物
(bp)
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降落PCR温度
(℃)
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巢式PCR外引物
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GTAGTAGTATTATTTGTAGTA
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ACCATTAAAAATTACACTA
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605
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（63→43）×20循环(-1.0/循环)→43×20循环
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MTHFR-M
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TTTTTAGTTAGGATTTGCGTTTTAC
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GTTAAA AACCGTACCTTTATCGTC
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144
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（65→45）×20循环(-1.0/循环)→45×20循环
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MTHFR-U
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TTTAGTTAGGATTTGTGTTTTATGT
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CATTAAAAACCATACCTTTATCATC
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143
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（65→45）×20循环(-1.0/循环)→45×20循环
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1.5 统计学处理
数据采用x±s表示，应用SPSS12.0软件采用单因素方差分析方法进行统计学分析，P<0.05差异有显著性。
2 结果
2.1 Hcy对HVSMCs MTHFR mRNA表达的影响
图1显示，Hcy可明显上调VSMCs MTHFR mRNA表达水平，其mRNA表达水平在100μmol/L Hcy时达到高峰（0.559±0.0467），直至极高浓度Hcy时仍刺激MTHFR mRNA呈高表达，与对照组相比差异有显著性（P<0.05，P<0.01）。
M：marker；1：Control (0μmol/L Hcy组)；2：30μmol/L Hcy组；3：100μmol/L Hcy组；4：200μmol/L Hcy组；5：500μmol/L Hcy组；6：1000μmol/L Hcy组
图1 不同浓度Hcy刺激HVSMCs MTHFR mRNA RT-PCR扩增产物
Figure 1 RT-PCR products of MTHFR mRNA in HVSMCs induced by Hcy at different concentrations
2.2 MTHFR启动子甲基化状态分析
MS-PCR产物的琼脂糖电泳结果可见(图2)，未经Hcy处理的细胞 (对照组) MTHFR启动子区既有甲基化引物扩增出的特异PCR条带，又有非甲基化引物扩增出的特异PCR条带。经Hcy处理的细胞MTHFR启动子区几乎只有非甲基化特异PCR条带，即Hcy诱导了明显的MTHFR基因启动子区的去甲基化过程。
M：marker；1：Control (0μmol/L Hcy组)；2：100μmol/L Hcy组；3：500μmol/L Hcy组；4：1000μmol/L Hcy组；m：甲基化特异产物；u：非甲基化特异产物
图2 MSP检测不同浓度Hcy对HVSMCs MTHFR启动子区甲基化状态的影响
Figure 2 MSP analysis of the MTHFR promotor methylation status in HVSMCs induced by Hcy at different concentrations
3 讨论
Hcy为非蛋白质组成氨基酸，系在转甲基代谢的甲硫氨酸循环中生成，其在细胞内的代谢过程如下：SAM递出甲基后生成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)，SAH脱腺苷生成Hcy，Hcy可接受N5-甲基四氢叶酸提供的甲基生成甲硫氨酸，后者被活化重新生成SAM，称为甲硫氨酸循环。该循环中向Hcy供甲基的N5-甲基四氢叶酸须由N5,N10－亚甲基四氢叶酸经N5,N10－亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）催化生成。MTHFR是维持甲硫氨酸循环的关键酶之一，若该酶活性不足，则Hcy向甲硫氨酸的再循环受阻，SAM生成不足，转甲基反应因供体缺乏而受阻，而Hcy在血液中聚集。Hcy亦可转而经胱硫醚合酶(CBS)催化，生成胱硫醚进而分解。如图3。
SAM：S-adenomethionine，SAH：S-adenohomocysteine，CBS：cystathionine synthase，MTHFR：5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，THF：methylenetetrahydrofolate
图3 同型半胱氨酸代谢和甲硫氨酸循环示意图
Figure 3 Diagram of the homocysteine metabolism and methionine cycle
已知高Hcy血症是As发病过程中一独立危险因素，ZENG和AU-YEUNG等报导，高Hcy可诱导MCP-1、IL-8的表达和NF-κB的激活等[11,12]，这些都被解释为高Hcy血症致As的可能机制。但高Hcy是否仅仅引起致病性的基因表达改变？且此种基因表达改变是通过何种途径实现的？本实验以Hcy作用于人脐动脉平滑肌细胞，结果显示，高Hcy引起MTHFR基因启动子区的去甲基化，及MTHFR mRNA的明显高表达。由于去甲基化使基因活化，因此，MTHFR mRNA的高表达应系高Hcy引起的MTHFR基因的epigenetic修饰所致。MTHFR系催化Hcy向甲硫氨酸转化的关键酶，MTHFR的高表达显然有助于降低过高的Hcy，这无疑是一种代偿机制，而非高Hcy的损伤效应。目前已有文献报导，增加饮食半胱氨酸可使血浆Hcy浓度升高，同时也使肝分泌MTHFR活性增加[13]。
高Hcy血症可能起因于某些基因的变异，如胱硫醚合酶或MTHFR的基因缺陷可导致显著的同型半胱氨酸尿症和早发的As [14,15]。MTHFR基因多态性分析已经揭示出该酶基因的某些点突变与高Hcy血症可能有关，如FROSST等证实的MTHFR基因677C-T突变导致其氨基酸序列的222位丙-缬氨酸的替代，使MTHFR的热稳定性下降，活性降低，Hcy升高[15]。由于Hcy系DNA转甲基后的代谢产物，产物的过度堆积显然会反馈抑制DNA的转甲基反应，降低DNA的甲基化程度，从而导致基因表达的异常和疾病的发生。
目前已有文献报导，在As病损部位，呈现整个基因组DNA甲基化水平降低和个别基因CpG岛高甲基化，并认为这与As的发病有关[16]。YING等报导，人主动脉平滑肌细胞的雌激素受体-α基因启动子区的高甲基化促使其向增殖表型转化，平滑肌细胞增殖是As发病的重要环节，雌激素可抑制平滑肌细胞增殖，雌激素受体基因启动子区的高甲基化显然抑制雌激素受体的表达，这被认为可能与As的发病有关[5]。但As的独立危险因子-高Hcy是否诱导DNA甲基化修饰的改变？且其诱导的DNA甲基化改变是否皆导致致病性的后果？尚罕有报导。本实验的结果显示高Hcy可导致MTHFR基因启动子区去甲基化，及MTHFR mRNA的明显高表达。本实验室另一组研究则证实，高Hcy引致雌激素受体-α基因启动子区的高甲基化，及雌激素受体的低表达(资料待发表)，后者与YING等所发现的人主动脉平滑肌细胞的雌激素受体-α基因启动子区的高甲基化相一致，而这可能与As病损中的平滑肌增殖有关，应属致病性的epigenetic修饰。同样的Hcy浓度，同样的实验模型，何以使某些基因去甲基化，而使另一些基因高甲基化？同时，是否高Hcy所导致的DNA甲基化改变皆系高Hcy的致病效应？目前尚无合理的结论和解释，但该事实已为许多实验室的研究所证实[6,8]。显然，高Hcy对DNA的epigenetic修饰具有多种模式。
而本研究结果清楚表明的认识是，高Hcy可通过引起DNA甲基化修饰的改变，而改变某些基因的表达；高Hcy对基因甲基化修饰的影响可以是损伤的、致病的，但亦可能是代偿性反应。由于干预DNA甲基化修饰的治疗策略已经成为一个重要的研究领域，因此，阐明在同一影响因素下，何以某些基因去甲基化，而另一些基因高甲基化？哪些DNA甲基化修饰的改变是致病的，哪些是代偿性的？对于合理的制定干预策略无疑具有重要的理论和实践意义。
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