大剂量维生素E、C补充对大鼠生物大分子氧化损伤及细胞功能影响的研究
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徐宏伟 张秀珍 汪求真 薛美兰 孙永叶 马爱国
青岛大学医学院医学营养研究所
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摘要：目的 观察不同剂量维生素Ｅ、Ｃ（ＶＥ、ＶＣ）补充对大鼠生物大分子氧化损伤及细胞功能的影响。方法 采用Ｗｉｓｔａｒ大鼠随机分成８组，４组ＶＥ干预：对照组、ＶＥ１、ＶＥ２和ＶＥ３，对照组给予普通饲料，三个干预组均喂饲添加维生素Ｅ的饲料，剂量分别为５００ ＩＵｋｇ、２０００ ＩＵｋｇ、７５００ ＩＵｋｇ饲料。４组ＶＣ干预：在基础饲料的基础上分别添加不同剂量的维生素Ｃ（分别为０，２０００，５０００，１００００ｍｇｋｇ饲料），实验期为８周。定期称大鼠体重，第６－７周留取尿液；实验结束后腹主动脉取血进行以下指标的检测分析。①采用单细胞凝胶电泳法检测ＤＮＡ自发及诱导氧化损伤的情况；②采用荧光偏振法测定红细胞膜流动性；③采用毛细管电泳法测定尿中Ｏ６－甲基鸟嘌呤的含量；④测定大鼠血清中维生素Ｅ、Ｃ的含量；⑤采用试剂盒测定血清中ＳＯＤ、ＭＤＡ和ＧＳＨ－Ｐｘ以及红细胞膜中的ＭＤＡ和ＧＳＨ－Ｐｘ。⑥采用ＭＴＴ法测定大鼠外周血淋巴细胞增殖活性。结果 三个干预组血浆ＶＥ、ＶＣ水平较对照组明显升高（Ｐ＜０．０５）；①５００ＩＵｋｇ 维生素Ｅ可以增强血清、细胞膜ＧＳＨ－ＰＸ、ＳＯＤ等抗氧化酶的活性，降低血清中脂质过氧化终产物ＭＤＡ水平；同时，补充该剂量维生素Ｅ可降低ＤＮＡ诱发氧化损伤及自发烷化损伤水平；提高大鼠红细胞膜流动性和淋巴细胞转化率。②饲料中维生素Ｅ为２０００ＩＵｋｇ、７５００ＩＵｋｇ时，可降低血清ＳＯＤ活性，并且加重较大剂量过氧化氢诱发的ＤＮＡ氧化损伤；而ＧＳＨ－ＰＸ、ＭＤＡ、红细胞膜流动性等则未见改善；７５００ＩＵｋｇＶＥ可降低淋巴细胞转化率。③补充２０００ｍｇｋｇ饲料的ＶＣ可使大鼠血清ＳＯＤ含量明显增高，使ＭＤＡ含量明显降低，而补充１００００ｍｇｋｇ饲料的ＶＣ可减少大鼠血清ＳＯＤ含量，增加血清ＭＤＡ含量。各ＶＣ剂量组对血清ＧＳＨ－Ｐｘ含量没有影响。④补充２０００ｍｇｋｇ饲料的ＶＣ可明显降低红细胞膜ＭＤＡ的含量，增加大鼠的红细胞膜流动性；补充１００００ｍｇｋｇ饲料的ＶＣ可降低膜ＧＳＨ－Ｐｘ含量。⑤ ５０００、１００００ｍｇｋｇ饲料ＶＣ对ＤＮＡ自发损伤及低和高剂量Ｈ２Ｏ２（５、２５μｍｏｌＬ）诱导的ＤＮＡ损伤无影响。而对中剂量的Ｈ２Ｏ２（１０μｍｏｌＬ）诱导损伤，补充的ＶＣ可加重ＤＮＡ损伤。⑥ 给大鼠补充１００００ｍｇｋｇ饲料的ＶＣ可增加大鼠尿中Ｏ６－甲基鸟嘌呤的含量。⑦补充２０００ｍｇｋｇ饲料的ＶＣ可增加大鼠外周血淋巴细胞的增殖活性。结论 本实验揭示较大剂量维生素Ｅ、Ｃ可提高机体的抗氧化能力，并且改善细胞增殖及膜流动等细胞活性。但是，过大剂量维生素Ｅ、Ｃ未能进一步提高机体的抗氧化能力，改善细胞增殖及膜流动。
关键词：维生素Ｅ；维生素Ｃ ；ＤＮＡ损伤；ＳＣＧＥ；淋巴细胞转化；０６－甲基鸟嘌呤；ＳＯＤ；ＭＤＡ； ＧＳＨ－Ｐｘ；红细胞膜流动性
基金项目：达能膳食营养研究与宣教基金 ＤＩＣ ２００２－１３
Abstract：Objective Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ，Ｃ（ＶＥ，ＶＣ）ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｏｓａｇｅ ｏｎ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｄａｍａｇｅ ｏｆ ｍａｃｒｏｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Methods Ｗｉｓｔａｒ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ８ ｇｒｏｕｐｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ，４ ｇｒｏｕｐｓ ＶＥ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ：ｃｏｎｔｒｏｌ；ＶＥ１；ＶＥ２ ａｎｄ ＶＥ３ ｇｒｏｕｐ． Ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｆｅｄ ｗｉｔｈ ｎｏｒｍａｌ ｒａｔ ｄｉｅｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｔｈｒｅｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｄ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｉｅｔｓ ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｔｅｎｔｅｄ ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ ５００ ＩＵｋｇ；２０００ ＩＵｋｇ；７５００ＩＵｋｇ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． ４ ｇｒｏｕｐｓ ＶＣ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ：Ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｏｓｅ ｏｆ ＶＣ （０，２０００，５０００，１００００ｍｇｋｇｄｉｅｔ）． Ｔｈｅ ｔｒｉａｌ ｌａｓｔｅｄ ８ ｗｅｅｋｓ，Ｕｒｉｎｅ ｗａｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｄ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒｉａｌ ａｎｄ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ ｗａｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｅｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒｉａｌ． ＳＯＤ，ＧＳＨＰｘ ａｎｄ ＭＤＡ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ＧＳＨＰｘ ａｎｄ ＭＤＡ ｉｎ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｗｅｒｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ Ｔｅｓｔ Ｋｉｔ ａｎｄ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｌｕｉｄｉｔｙ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ． ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＳＣＧＥ，Ｏ６ＭｅＧ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｚｏｎｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＭＴＴ． Results Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｐｌａｓｍａ ＶＥ，ＶＣ ｌｅｖｅｌｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐｓ． １． ５００ ＩＵｋｇ ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ ｃｏｕｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ＳＯＤ，ＧＳＨＰｘ，ｄｅｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ＭＤＡ． ＤＮＡ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｄａｍａｇｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｈ２Ｏ２ ａｎｄ ＤＮＡ ａｌｋｙｌ ｄａｍａｇｅ ｗｅｒｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ５００ ＩＵｋｇ ＶＥ． Ａｓ ｔｏ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，５００ ＩＵｋｇ ＶＥ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｌｕｉｄｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． ２． ２０００Ｕｋｇ，７５００ＩＵｋｇ ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｓｅｒｕｍ ＳＯＤ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｎｄ ａｇｇｒａｖａｔｅｄ ＤＮＡ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｄａｍａｇｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｈ２Ｏ２． Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ７５００ＩＵｋｇ ＶＥ． ３． Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ ２０００ｍｇｋｇｄｉｅｔ ＶＣ ｔｏ ｒａｔｓ ｃａｎ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＳＯＤ ｉｎ ｓｅｒｕｍ，ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅ ｓｅｒｕｍ ＭＤＡ． Ｉｔ ｃａｎ ａｌｓｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｌｕｉｄｉｔｙ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＭＤＡ ｉｎ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ． Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １００００ｍｇｋｇｄｉｅｔ ＶＣ ｔｏ ｒａｔｓ ｃａｎ ｒｅｄｕｃｅ ｓｅｒｕｍ ＳＯＤ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＧＳＨＰｘ ｉｎ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｓｅｒｕｍ ＭＤＡ． ４． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｈｉｇｈｄｏｓｅｓ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ ｄｉｄ ｎｏｔ ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ． Ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ ｄｏｓｅ ｏｆ ＶＣ ｗａｓ ５０００ｍｇｋｇ ｄｉｅｔ ｏｒ ｅｖｅｒ ｈｉｇｈｅｒ，ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ １０μｍｏｌＬ Ｈ２Ｏ２ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ． Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ １００００ｍｇｋｇ ｄｉｅｔ ＶＣ ｃｏｕｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ Ｏ６ＭｅＧ ｉｎ ｕｒｉｎｅ． ５． Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ ２０００ｍｇｋｇｄｉｅｔ ＶＣ ｔｏ ｒａｔｓ ｃａｎ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ， ｗｈｉｌｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ ５０００ｍｇｋｇｄｉｅｔ ＶＣ ｏｒ １００００ｍｇｋｇｄｉｅｔ ＶＣ ｈａｄ ｎｏ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｈｉｇｈ ｄｏｓｅ ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ，Ｃ ｃｏｕｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂｏｄｙ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｌｕｉｄｉｔｙ ａｎｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ． Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｏｏ ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ，Ｃ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｉｎｃｒｅａｓｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂｏｄｙ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｌｕｉｄｉｔｙ ａｎｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．
Keywords：ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ；ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ；ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ；ＳＣＧＥ；ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ｏ６ｍｅｔｈｙ ｙｌｇｕａｎｉｎｅ；ＳＯＤ；ＭＤＡ；ＧＳＨＰｘ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ．
自由基造成的氧化损伤被认为是多种疾病的起点，维生素Ｅ（ＶＥ）是一种有效的抗氧化营养素，其推荐摄入量是１５ｍｇ天，但老年人和一些病人的ＶＥ需要量１往往超过该推荐量。已有动物实验２和临床研究３报道大剂量ＶＥ可以对肿瘤、神经退行性疾病等起预防、治疗作用：５００ＩＵｋｇ ｄｉｅｔ ＶＥ可以对肝癌起化学预防作用、每天摄入ＶＥ １２００ＩＵ对迟发性运动障碍患者有治疗作用。但这些研究中大多测定了瘤块大小、肝脏重量、血浆ＳＯＤ等指标，尚未针对细胞活性进行深入研究。
维生素Ｃ作为人体所需的重要营养素，其抗氧化活性已经得到广泛证实４。补充抗氧化维生素Ｃ可减轻诱导的ＤＮＡ氧化损伤，改善细胞功能５，而且有人指出体内试验未发现ＶＣ有明显的致癌和致突变性。但也有体外实验表明：过高剂量的ＶＣ可能增加细胞ＤＮＡ对Ｈ２Ｏ２或其它有害物质损害的敏感性６，甚至有人发现ＶＣ对ＤＮＡ产生多方面的损伤，如阻碍ＤＮＡ修复合成，抑制ＤＮＡ半保留复制，破坏核苷酸，断裂ＤＮＡ，引起基因突变或染色体损伤等。
目前关于大剂量ＶＥ、ＶＣ对遗传物质稳定方面的影响尚无一个系统的认识，且研究多限于体外实验或联合补充抗氧化营养素，而对于在体内单独干预一种维生素观察其不同剂量对机体ＤＮＡ氧化损伤及细胞功能影响的研究较少。因此本研究旨在通过对实验动物分别进行大剂量ＶＥ、ＶＣ的干预，观察其对实验动物ＤＮＡ氧化损伤及细胞功能的影响，并初步探讨其可能的机理，从而为人类合理摄入抗氧化维生素提供一定的指导建议。
１ 材料和方法
１．１ 动物分组及饲养
选择１０２只Ｗｉｓｔａｒ大鼠，体重６０～９０克，由山东大学实验动物中心提供，其中４８只随机分为４组，雌雄各半。饲料中ＶＥ剂量分别为：对照组，饲基础饲料，含ＶＥ７５ＩＵｋｇ；ＶＥ１组，饲料中含ＶＥ５００ＩＵｋｇ；ＶＥ２组，饲料中含ＶＥ２０００ＩＵｋｇ；ＶＥ３组，饲料中含ＶＥ７５００ＩＵｋｇ。
在基础饲料中添加ｄｌα生育酚乙酸酯并充分混匀，低温压制并经循环风自然干燥，饲料制成后立即放入－２０°Ｃ冰箱中保存。各组动物自由饮水，环境温度维持在２３～２５°Ｃ。实验期为８周。
另外５４只随机分为４组，每组１２－１４只，进行大剂量维生素Ｃ的干预。因为大鼠自身可合成维生素Ｃ，其中一组不添加维生素Ｃ，给予基础饲料，作为对照组，其它三组给予合成饲料，在基础饲料的基础上分别添加２０００ｍｇｋｇ饲料、５０００ｍｇｋｇ饲料和１００００ｍｇｋｇ饲料剂量的维生素Ｃ。
１．２ 主要试剂
ＶＥ标准品、ＤＰＨ（１，６Ｄｉｐｈｅｎｙｌ１，３，５ｈｅｘａｔｒｉｅｎｅ）为美国Ｓｉｇｍａ公司产品；低熔点琼脂糖（ＬＭＰ）、ＲＰＭＩ１６４０、小牛血清为ＧｉｂｃｏＢＲＬ公司产品；淋巴细胞分离液由爱普生物技术公司提供。
１．３ 检测指标与方法
１．３．１ 血样采集 实验动物处死前１２小时撤食，以乌拉坦麻醉动物后腹主动脉取血５ｍｌ，留取８００μＬ红细胞，制成红细胞膜备用，并同时分离淋巴细胞。其余全血２０００ｒｐｍ、２０分钟离心，获取血浆置于－２０°Ｃ冰箱中保存待测。
１．３．２ 血浆ＶＥ测定 荧光法，仪器为荧光分光光度计（日本岛津ＲＦ－５４０型）。
血浆ＶＣ测定 ２，４－二硝基苯肼法。
１．３．３ 血浆及膜脂质过氧化指标测定 血浆丙二醛（ｍａｌｏｎｉａｄｅｈｙｄｅ，ＭＤＡ）：硫代巴比妥酸（ＴＢＡ）比色法；膜谷胱甘肽过氧化物酶（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＧＳＨＰｘ）：ＤＴＮＢ 直接法，测定结果以活力单位ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ 表示，膜蛋白质测定按Ｌｏｗｒｙ 法进行；ＭＤＡ、ＧＳＨＰｘ测试盒由南京建成生物工程研究所提供。
１．３．４ 淋巴细胞转化率测定 方法为四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）比色法，仪器为ＥＬＸ８００酶标仪（美国ＢｉｏＴｅｋ公司）。
１．３．５ ＤＮＡ氧化损伤的检测和分析 仪器为低温离心机（德国Ｓｉｇｍａ３Ｋ３０型）；荧光显微镜（日本ＯＬＹＭＰＵＳ ＢＨ２型），方法为碱性单细胞凝胶电泳法（ＳＣＧＥ），又称“彗星”电泳法，是一种较敏感的ＤＮＡ断裂损伤分析技术。
１．３．６ 红细胞膜流动性测定 仪器为ＬＳ５０型荧光分光光度计（美国ＰＥ公司），用低渗一步溶血法提取红细胞膜，ＤＰＨ荧光标记，于激发波长３６２ｎｍ，发射波长４３２ｎｍ时测定荧光偏振度Ｐ，并计算出微粘度η。
１．３．７ Ｏ６甲基鸟嘌呤的测定 采用毛细管电泳仪法
１．４ 统计分析
所有数据均采用ＳＰＳＳ１０．０统计软件进行处理。用单因素方差分析进行显著性检验，用ｑ检验进行两两比较。淋巴细胞转化率测定数据呈偏态分布， 采用秩和检验进行比较。
２ 结果
２．１ 大鼠生长发育状况
饲料中添加大剂量ＶＥ、ＶＣ对大鼠摄食和体重增长没有影响。体重变化曲线见图１、２。
２．２ 血浆中ＶＥ、ＶＣ浓度
２３ 大剂量ＶＥ、ＶＣ对血清ＳＯＤ、ＧＳＨ－ＰＸ及脂质过氧化终产物ＭＤＡ的影响
与对照组相比，５００ ＩＵｋｇ ＶＥ可显著升高大鼠血清ＳＯＤ、ＧＳＨ－ＰＸ活性（Ｐ＜００５）；同时，降低血清ＭＤＡ水平（Ｐ＜００１）。但是，饲料中添加更高剂量的ＶＥ时，血清抗氧化状态发生了变化：ＶＥ２、ＶＥ３组血清ＳＯＤ、ＧＳＨ－ＰＸ活性都较ＶＥ１组显著下降（Ｐ＜００１），同时，ＭＤＡ水平显著上升（Ｐ＜００５）。值得注意的是，２０００ＩＵｋｇ ＶＥ 和７５００ ＩＵｋｇ ＶＥ 会导致血清ＳＯＤ活力较对照组明显下降（Ｐ＜００５，Ｐ＜００１）。
２４ 大剂量ＶＥ、ＶＣ对红细胞膜ＧＳＨ－Ｐｘ及脂质过氧化终产物ＭＤＡ的影响
５００ＩＵｋｇ ＶＥ可显著提高红细胞膜ＧＳＨＰＸ活性（Ｐ＜００５）、但ＶＥ２、ＶＥ３组红细胞膜ＧＳＨＰＸ活性下降，与对照组间无显著性差异（Ｐ＞００５），与５００ＩＵｋｇ ＶＥ相比则明显下降（Ｐ＜００５，Ｐ＜００１），即过高剂量的ＶＥ对红细胞膜ＧＳＨＰＸ活性并无改善作用。与对照组相比，ＶＥ１组ＭＤＡ在数值上下降，ＶＥ２、ＶＥ３组ＭＤＡ在数值上上升，但对照组和干预组总体上方差分析的结果是Ｆ＝２４０４，Ｐ＝００８，按α＝００５的界值，差异无显著性。
２６ 大剂量维生素Ｅ对大鼠外周血淋巴细胞转化的影响：
２７ 大剂量ＶＥ、ＶＣ对ＤＮＡ氧化损伤的影响：
实验组和对照组的ＤＮＡ自发损伤（即Ｈ２Ｏ２浓度为０μｍｏｌｌ）均较低，随着过氧化氢浓度的增加，实验组和对照组ＤＮＡ氧化损伤程度均加重。当不加过氧化氢时，即ＤＮＡ自发损伤，实验组和对照组之间没有显著性差异（Ｐ＞００５），即大剂量ＶＥ对机体ＤＮＡ自发性损伤没有影响。当双氧水浓度为１０μｍｏｌｌ时，ＶＥ１组（５００ＩＵｋｇ ＶＥ）的 ＤＮＡ氧化损伤较对照组显著降低（Ｐ＜００５），提示５００ ＩＵｋｇ ＶＥ 对ＤＮＡ诱发氧化损伤有保护作用。但是，当ＶＥ剂量进一步增高为２０００、７５００ ＩＵｋｇ 时，ＤＮＡ氧化损伤较对照组明显加重（Ｐ＜００５，００１），与ＶＥ１组的差异亦有显著性（Ｐ＜００１）。由此可见，当存在较强外来损伤因素时，过高剂量维生素Ｅ会加重ＤＮＡ氧化损伤，使机体遗传稳定性降低。
２８ 不同水平大剂量ＶＥ、ＶＣ对ＤＮＡ烷化损伤的影响
Ｏ６－甲基鸟嘌呤（Ｏ６－ＭｅＧ）是在ＤＮＡ鸟嘌呤六位氧上发生了甲基修饰，它是烷化损伤的产物。５００ＩＵｋｇ ＶＥ可显著降低大鼠尿中 Ｏ６－ＭｅＧ 含量（Ｐ＜００５），即该剂量可保护ＤＮＡ免于烷化损伤；ＶＥ剂量为２０００ＩＵｋｇ时，Ｏ６－ＭｅＧ在数值上增高，但结果无统计学意义；但当剂量进一步增高至７５００ＩＵｋｇ时，Ｏ６－ＭｅＧ值继续上升，并明显高于ＶＥ１组（Ｐ＜００１），由此可见，５００ＩＵｋｇ ＶＥ可以降低尿Ｏ６－ＭｅＧ水平，但剂量进一步增高则导致Ｏ６－ＭｅＧ含量上升，对ＤＮＡ烷化损伤不产生保护作用。
３ 讨论
尽管已有大量文献报道ＶＥ具有维持生物膜稳定性、改善认知能力、提高机体免疫力等功能，但迄今为止，其最适宜补充剂量仍无定论。因为这一剂量涉及ＶＥ的基础营养需要量、药理学作用剂量以及可能产生的毒副作用１０。ＶＥ是８种具有α－生育酚活性的色酮衍生物的总称，且生物学活性各不相同，因此其剂量最好用国际单位（ＩＵ）表示。通常认为ＶＥ是相对无毒的，成人ＶＥ的ＲＤＡ值及摄入量上限值分别是每天２２ＩＵ、１４７０ＩＵ１１；但近来的一些研究结果使人们日益关注大剂量ＶＥ的安全性，Ｅｄｅｒ Ｋ１０等发现大剂量ＶＥ会降低红细胞中ＳＯＤ、ＣＡＴ等抗氧化酶活力及还原型谷胱甘肽的含量。
根据ＡＩＮ－９３Ｇ，啮齿类动物饲料中ＶＥ的适宜剂量是７５ＩＵｋｇ。本研究中ＶＥ的三个干预剂量分别相当于适宜剂量的７倍、２７倍和１００倍，最低剂量已远超过需要量，而最高剂量是低于ＶＥ的中毒剂量（＞２０００ＩＵｋｇ ＢＷ·ｄ）１２的。研究结果表明，补充ＶＥ８周有效地提高了大鼠血浆ＶＥ浓度。
当补充剂量为需要量的７倍时，外周血淋巴细胞增殖活性显著提高， ＤＮＡ诱发氧化损伤程度明显降低，红细胞膜流动性得到显著改善。同时，血浆ＭＤＡ下降，红细胞膜ＧＳＨ－Ｐｘ活性增高。ＭＤＡ即丙二醛，脂质过氧化终产物之一。一般来说，活性氧损伤加重伴随着ＭＤＡ升高，而抗氧化剂对活性氧的清除作用表现为ＭＤＡ的降低；膜抗氧化酶活性提高也提示氧化应激水平下降。因此，补充该剂量ＶＥ时，体内氧化应激水平下降是细胞功能提高的重要原因之一。另外，ＶＥ可能还通过调节信号传导及基因转录等途径提高细胞活性１３。
但是，当饲料中ＶＥ含量为需要量的２７倍、１００倍时，红细胞膜流动性未见改善，并且，细胞增殖活力及抗ＤＮＡ氧化损伤能力明显下降。ＶＥ通过生育酚侧链与细胞膜上多烯酸残基结合而整合到膜中，并通过两种途径稳定细胞膜：１ 使ＰＵＦＡ不易发生过氧化 ２ 使ＰＵＦＡ不易在磷脂酶作用下发生磷脂水解作用。ＶＥ与多烯酸的这种结合能力可能存在自我调节机制，过大剂量ＶＥ反而无法有效地整合入细胞膜；并且，过大剂量ＶＥ本身可能就具有促氧化性质１４。在打断脂质过氧化链式反应的过程中，过大剂量ＶＥ生成了大量的ＶＥ氧化自由基并且不能完全还原为ＶＥ，因此，堆积的ＶＥ氧化自由基激发了体内过氧化反应。体内活性氧浓度升高造成细胞氧化损伤并攻击ＤＮＡ，导致细胞增殖活性下降、ＤＮＡ氧化损伤加重。
ＶＥ用于治疗绝经后妇女冠状动脉硬化等疾病时的剂量可超过每天５００ＩＵ１５，相当于大鼠饲料中ＶＥ含量达１０００ＩＵｋｇ以上。在本次研究中，饲料中ＶＥ含量达２０００、７５００ＩＵｋｇ时不能改善红细胞膜流动性，并显示出细胞抗ＤＮＡ氧化损伤能力及增殖活性下降等毒副作用。氧化应激、ＶＥ、细胞活性三者间的分子作用机制有待进一步研究。
维生素Ｃ是最主要的细胞外液的抗氧化物，且在细胞内液中也有重要的抗氧化活性１６，显示出有效的清除Ｏ２－、Ｈ２Ｏ２、ＯＨ·、ＬＯＯ·的能力，故它是一种广谱抗氧化物。相反，在某些情况下，如有过渡金属离子（如铁和铜）存在时，抗坏血酸能起还原剂作用并产生Ｏ２－、Ｈ２Ｏ２和ＯＨ·而变为促氧化剂１７。维生素Ｃ的抗氧化能力或促氧化能力是否与其剂量有关目前还没有定论。
本研究通过补充不同高剂量的ＶＣ发现，２０００ｍｇｋｇ饲料的ＶＣ补充组的血清ＳＯＤ含量高于未添加组，血清和红细胞膜ＭＤＡ含量低于未添加组；而１００００ｍｇｋｇ饲料的ＶＣ补充组血清ＳＯＤ含量和红细胞膜ＧＳＨ－Ｐｘ含量低于未添加组，血清ＭＤＡ含量高于未添加组；各组间血清ＧＳＨ－Ｐｘ含量没有显著性差别。说明补充２０００ｍｇｋｇ饲料的ＶＣ可增加机体抗氧化酶ＳＯＤ的活性，降低脂质过氧化，而补充最大剂量的ＶＣ（１００００ｍｇｋｇ饲料）则使抗氧化酶的活性下降，有增强脂质过氧化的作用。
Ｏ６－甲基鸟嘌呤是生物体内ＤＮＡ受到烷化剂及各种细胞毒性药物的甲基化作用后形成的一种代谢产物。实验表明，多种恶性肿瘤如肝癌、肺癌、胰腺癌等病人血清和尿液中Ｏ６－甲基鸟嘌呤的浓度均升高１８。Ｏ６－甲基鸟嘌呤的含量不仅反应了体内细胞ＤＮＡ遭受烷化损伤的程度，还与机体高度专一性ＤＮＡ修复酶—Ｏ６－甲基鸟嘌呤ＤＮＡ甲基转移酶（ＭＧＭＴ）的活性密切相关，后者能有效地修复ＤＮＡ分子中鸟嘌呤Ｏ６位的烷化碱基。补充不同高剂量的ＶＣ，各组大鼠尿中Ｏ６－甲基鸟嘌呤含量差别有高度统计学意义，１００００ｍｇｋｇ饲料的ＶＣ补充组的含量最高，与对照组相比差别有显著性，２０００ｍｇｋｇ饲料的补充组Ｏ６－甲基鸟嘌呤的含量最低，但与对照组比较差别无显著性，而与１００００ｍｇｋｇ饲料的ＶＣ补充组比较差别有高度统计学意义。这表明大剂量维生素Ｃ能够增加体内Ｏ６－甲基鸟嘌呤的含量，分析其原因可能有两个方面。一方面可能是过量维生素Ｃ能够增强烷化剂等有害物质对ＤＮＡ的甲基化作用，从而使体内Ｏ６－甲基鸟嘌呤的生成增多；另一方面也可能因为过量维生素Ｃ可降低Ｏ６－甲基鸟嘌呤转移酶的活性或酶的含量，从而减弱其对Ｏ６－甲基鸟嘌呤的清除作用。
总之，维生素Ｃ在体内对遗传物质发挥的作用的复杂性和多面性使人们对这种普通的维生素产生了越来越浓厚的兴趣。大剂量维生素Ｃ对遗传物质稳定的作用究竟是其对ＤＮＡ的直接损伤还是间接通过其促氧化作用改变抗氧化酶类还没有定论，这一问题的解决无疑会对深入了解ＶＣ，合理摄入ＶＣ提供重要的理论依据。
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作者简介：徐宏伟 |
