学术报告厅

２神经纤维瘤病Ⅰ型、神经纤维瘤蛋白与认知功能
　　神经纤维瘤病Ⅰ型（NF１），也称为Von Reck－ling hausen病，属于常染色体显性遗传病。该病以良性神经纤维瘤及皮肤色素沉着为特点，可出现Lisch结、脊柱侧凸、身材矮小、高血压、癫痫及一系列学习障碍。NF１基因的变异可导致该病。NF１基因定位在１７号染色体，编码神经纤维瘤蛋白；它是一种GTP酶，可通过ras 途径调节信号转导。NF１是一种抑癌基因，编码神经纤维瘤蛋白Ⅰ型和Ⅱ型。神经纤维瘤蛋白Ⅱ型基因敲除小鼠成年后出现空间学习能力、文字辨别以及运动协调能力的损害。研究者认为NF１患者由于神经纤维瘤蛋白Ⅱ型功能紊乱导致学习能力下降。只有了解神经纤维瘤蛋白Ⅱ型及NF１的功能与特性才能寻找治疗该类患者学习障碍的新方法，并从整体上改变其学习记忆过程。

３RAS在学习记忆形成中的作用
　　哺乳动物的ras 基因在细胞增殖与分化中起关键作用。Ha－ras 和Ki－ras 分别是指Harvey和Lcirsten大鼠的肉瘤病毒癌基因；而N－ras 最初是从人成神经细胞瘤中分离得到的。这３种基因均属于ras 基因家族成员。ras 基因编码P２１蛋白，P２１位于血浆细胞膜内表面，与三磷酸鸟苷（GTP）和二磷酸鸟苷（GDP）结合，并具有三磷酸鸟苷酶活性。正常情况下，Ras 蛋白通过与GDP的结合保持无活性状态。受到刺激时，p２１通过结合GDP保持无活性状态、ras 基因的变异使Ras 蛋白稳定在活性状态，并导致肿瘤向恶性转化。来源于胚胎干细胞的小鼠是正常的，其N－ras 基因一直处于无活性状态，提示N－ras 的功能并非小鼠正常生长、发育和繁殖所必需。

　　鸟嘌呤核苷酸释放因子１（GRF１）和２（GRF２）蛋白与ras 鸟嘌呤核苷酸转换因子（GEFs ）具有很强的结构同源性。GRF１基因敲除小鼠表现为生长停滞及长时学习记忆缺失。Grf１敲除小鼠缺乏神经纤维瘤蛋白Ⅱ型，成年后空间学习能力、文字辨别及运动协调能力下降。ras 基因在脑中高表达。神经纤维瘤细胞在神经元、少突胶质细胞和无髓鞘雪旺细胞中含量丰富。ras 和神经纤维瘤蛋白的高含量揭示其在神经系统功能中的重要作用。由于神经纤维瘤与学习能力低下有关，因此ras 及Nf１基因可能在学习记忆中起作用。神经纤维瘤Ⅱ型基因缺失小鼠发育正常，但成年后出现学习记忆缺损，提示Nf１患者学习能力低下可能是神经纤维瘤蛋白Ⅱ型功能破坏所致。神经纤维瘤蛋白可调节ras 三磷酸鸟苷酶激活蛋白和腺嘌呤环化酶活性并能与微管结合。研究表明，ras 在学习记忆的形成中可能是必需的。

　　有细胞外配体诱导产生的众多生长、分化信号可通过适应蛋白Grb２将特异表达的mSos 交换因子（ras －特异性GEFs ）转运至细胞膜，进而激活ras 。mSos 占优势的GEFs 可将GDP－ras 转换成GTP－ras 。mSos 与Grb２的Src同源性结构域相互作用，而Grb２是一种以mSos 为靶、可激活生长因子受体的适应蛋白。mSos 据认为属于GEFs 家族成员，GEFs 包括ras－GRF１和ras－GRF２，因为GEFs 对ras 和rac有双重特异性。rac的活化可改变肌动蛋白细胞支架，导致细胞膜边缘波动细胞和薄片状伪足形成，提示由rac活化的mSos 在生长因子介导的肌动蛋白动力学调节中发挥其功能性作用。
胞浆Ca２＋水平可调节Ras 蛋白的活性，而Ras 蛋白可调节Ca２＋释放和Ca２＋内流过程，提示在细胞内Ca２＋和p２１ras 信号通路之间存在多个汇聚点，以实现两条信号途径的整合。ras－GRF在新生和成年中枢神经系统的神经元中表达，并定位于突触体部位。毒蕈碱M１和M２受体的活化可导致ras－GRF磷酸化，进而增强其自身转换活性，而胞内Ca２＋水平增高可激活神经元内ras/MAPK途径。

　　杏仁核为长时记忆的巩固所必需。杏仁核的损伤可影响提示的获取及恐惧反射的传递，而海马损伤只影响后者。神经元特异性ras－GRF可通过Ca２＋内流及G－蛋白偶联受体的激活诱导ras 信号转导过程，揭示ras－GRF在神经传递和可塑性方面具有重要意义。ras－GRF基因敲除小鼠当完成恐惧相关行为学任务时出现记忆巩固过程削弱及杏仁核电生理损伤。反过来，ras－GRF突变对空间学习任务如水迷宫试验产生较大影响，而该试验需要海马发挥功能５。ras－GRF突变体的海马NMDA受体依赖性LTP正常，同时学习和短时记忆并无任何异常。尽管ras－GRF突变体在海马可塑性或海马依赖性学习功能方面并无异常，但有报道认为在突触传递的某些方面有微小变化。尽管ras－GRF并非为空间学习所必需，ras－GRF突变体为改变海马表型或许会发生突触可塑性其他形式的变化或发生补偿性事件。相反，具有无活性ras－GRF１基因的小鼠在完成运动协调任务时表现正常，但文字辨别、食物选择以及水迷宫的潜在平台观察等海马依赖性学习功能受到损害。由此得出一个结论，即ras－GRF１在海马依赖性学习学习记忆中起作用。
　　长时学习记忆的形成需要RNA及蛋白质合成的更新。应用cDNA微阵列技术（cDNA microarray technique）可以探明参与学习记忆过程的基因，包括与Ca２＋信号转导、ras 活化、激酶级联反应、细胞外基因功能以及神经递质、突触可塑性调节、神经再生等事件密切相关的基因。研究发现，大鼠海马３－磷酸肌醇激酶（phosphoinostide ３－kinasePI３K）受抑制可损害学习记忆的获取、巩固与再现，提示海马PI３K在学习记忆形成中的重要性。这可能是由于PI３K，NMDA受体复合物与ERK－ras 信号通路之间的相互作用所致，因为研究观察到抑制MAPK途径可损害LTP的诱导，而LTP对学习记忆形成是必需的。这有点像小鼠敲除掉神经特异性Ras 调节蛋白（ras－GRF）则发生杏仁核LTP损伤及相应长时记忆的缺失。以上研究证实了ras 及下游事件在记忆形成和巩固中的作用，因为ras 可激活PI３K和ERK（也称为ras－ERK通路）７。

４NO与学习记忆形成
　　NMDA型谷氨酸受体介导的细胞内Ca２＋增加对突触可塑性具有关键性作用，而突触可塑性为学习记忆所必需。而细胞内Ca２＋浓度的增高可激活ras 与ERKs 从而将谷氨酸信号传递至核内。这将导致迟发性神经反应。通过NMDA受体的Ca２＋依赖性神经元NO合酶产生NO。上述结果提示NO可能在诱导分化、神经存活以及突触可塑性这些与学习记忆形成和巩固密切相关的作用中扮演重要角色。

　　当接受一项在水迷宫中进行的隐藏－平台试验时，NF１＋－小鼠空间学习能力出现异常，该试验对海马损伤很敏感。上述实验动物以及人类NF１学习能力低下可能是ras 活性上调所致。NF１－－及K－ras＋－小鼠会在子宫内死亡。当NF１＋－小鼠与K－ras 基因突变体（K－ras＋－）杂合子小鼠交配后，其F１子代活泼且没有发育缺陷。具有NF１和K－ras 基因杂合子突变体小鼠（NF１＋－K－ras ＋－ ）亦无学习缺陷并与野生型小鼠类似。提示NF１＋－ 小鼠学习低下可被K－ras ＋－ 突变体纠正。有重迭功能且与K－ras 有类似表达的N－ras 也可逆转NF１＋－小鼠的空间学习缺失。因此，削弱ras 功能突变体可纠正NF１ ＋－ 小鼠 图２必需脂肪酸的代谢示意图注AA：花生四烯酸；ALA：α－亚麻酸；DGLA：二高－γ－亚麻酸；DHA：二十二碳六烯酸；EPA：二十碳五烯酸；GLA：γ－亚麻酸；LA：顺式－亚油酸；PG：前列腺素。的学习缺失[８] 。γ－氨基丁酸（GABA）可抑制LTP。GABA活性抑制后可使NF１ ＋－小鼠学习缺陷恢复正常。值得注意的是，ras 活性异常升高或降低均可影响学习能力，这表明神经纤维瘤蛋白对ras 的精确调节为学习记忆所必需。ras 对学习记忆的必要性也佐证了上述观点[６]。果真如此，那么NO在学习记忆中的作用又如何解释呢？

　　GABA可抑制NO的合成[９]。在NMDA介导的细胞内Ca ２＋ 增加以及与学习记忆巩固密切相关的LTP、突触可塑性诸因素之间，NO是一个关键因素。因为GABA可抑制NO合成与过高的ras 活性（图１）。对嗅觉的记忆依赖于合成足量的NO[１０]。NO能够介导海马的突触可塑性、影响LTP并促进学习记忆的形成。脑中谷氨酸释放NO，作用于NMDA和２－氨基甲苯乙酸受体。反过来，NO可通过cGMP 电压依赖谷氨酸的释放控制脑中可塑性的变化。NO还可以通过调节cGMP 潜在地促进谷氨酸的释放，并导致神经元细胞突触对谷氨酸敏感性的持久增高。这种正反馈循环与海马LTP有关。实验结果显示，一旦神经元在学习记忆形成后被激活，谷氨酸将通过与自身受体的作用来增加这些细胞的兴奋性，并进而通过GABA的释放加以控制（图１）。只有当正（NO）、负（GABA）反馈控制处于平衡时，LTP及学习记忆的形成才处于最佳状态。NF１患者更倾向于GABA占优势，因而出现学习记忆缺失。那么，将如何解释长链多不饱和脂肪酸（LCPUFAs ）在学习记忆中尤其当ras 、GABA和NO存在时的作用呢？

５LCPUFAs 、ras 、NO、GABA、胰岛素与学习记忆
　　γ－亚麻酸、二高－γ－亚麻酸、花生四烯酸和二十碳五烯酸（EPA）、二十碳六烯酸（DHA）分别是顺式－亚油酸和α－亚麻酸的代谢产物（图２）。顺式－亚油酸、γ－亚麻酸、二高－γ－亚麻酸、花生四烯酸（AA）、α－亚麻酸、EPA和DHA也称为多不饱和脂肪酸；其中二高－γ－亚麻酸、AA、EPA、DHA被称为长链多不饱和脂肪酸（LCPUFAs ）。AA、EPA和DHA为脑发育和学习记忆功能所必需。这些脂肪酸能够调节婴儿的视觉准确性、并促进感觉和神经的发育[１１]。婴儿可通过胎盘转运、母乳喂养以及由顺式－亚油酸内源性合成等途径积累AA。AA可促进大脑皮层星形胶质细胞摄取葡萄糖，因而它在大脑皮层能量代谢的调节中发挥重要作用。AA和DHA还能增加乙酰胆碱的释放、参与LTP和突触可塑性的调节进而提高实验动物的学习能力。由于母乳中含有AA、EPA和DHA，因而母乳喂养可改善儿童认知发育和学习记忆功能[１２]。

　　EPA和DHA具有神经保护作用[１３]。给予含DHA的膳食可减轻增龄性LTP损害及去极化诱导的谷氨酸能神经递质的释放。LCPUFAs 和乙酰胆碱可抑制TNF、IL－１和IL－６的生成并增加内皮细胞NO合成、抑制神经元凋亡、易化学习记忆过程[１１]。大脑中富含AA、EPA和DHA；当神经元细胞膜中这些脂肪酸积累到足够量时，由于膜流动性增加而导致胰岛素受体及各种神经营养因子增多[１１]。脑细胞中胰岛素及胰岛素受体亦与脑认知功能有关。胰岛素可促进LCPU FAs 由其前体的合成；因此，在神经元细胞膜LCPU FAs 含量与神经元胰岛素受体数目之间存在一个反馈控制。另外，AA可通过上述神经元增加葡萄糖的摄取[１４]。Das 认为，胰岛素是内皮细胞NO形成的潜在刺激因子并抑制TNF合成。可见，胰岛素和LCPUFAs 可保护神经元免遭TNF死亡信号攻击、增加葡萄糖摄取并促进记忆的形成[１１１４]。

　　ras 可刺激AA的释放，或许还能通过激活蛋白激酶C使生长因子刺激的细胞释放其他LCPUFAs [１５]。LCPUFAs ，尤其是EPA和DHA，反过来亦可抑制ras 的活化。LCPUFAs 可通过抑制两种Ras 调节蛋白的GTP酶活性来调节C－Ha－Ras 蛋白的GTP酶功能。这两种Ras 调节蛋白分别是全长的神经纤维瘤蛋白以及p１２０GTP酶活化蛋白[１６]。基此，有学者提出LCPU－FAs 改善学习记忆是通过阻断GABA对LTP的抑制作用实现的。EPA及其他LCPUFAs 或许能够增加细胞内Ca ２＋浓度，而胞内Ca ２＋ 水平的增高可增强LTP、记忆形成与巩固。DHA、AA缺乏膳食可使大脑额叶皮层中多巴胺和５－羟色胺的含量降低１７。正常情况下脑中多种神经递质之间保持平衡，因此，多巴胺和５－〖羟色胺浓度的降低将导致GABA产生增多，进而造成学习能力低下。可见，LCPUFAs 、神经纤维瘤蛋白、ras 基因表达、NO形成以及脑中多种神经递质浓度之间存在着密切关系）。

　　神经纤维瘤蛋白Ⅱ型缺失可引起空间学习能力损害、文字辨别能力下降以及其他学习障碍。原因在于神经纤维瘤蛋白Ⅱ型可引起反馈抑制障碍从而导致ras 基因及其蛋白表达增加。ras 活性的增加可促进GABA的形成进而抑制NO的合成。NO合成降低后谷氨酸释放减少，结果导致NMDA受体活化、Ca ２＋释放以及cGMP 形成。这一系列事件最终造成神经纤维瘤患者认知不能。神经纤维瘤患者神经细胞尤其是海马中各种LCPUFAs 含量较低。上述结果是由于δ－６和δ－５去饱和酶活性降低所致。NF１能否调节上述酶活性尚不清楚。无论怎样，补充各种LCPUFAs 将有助于大脑不同区域中这些脂肪酸浓度恢复到正常水平从而改善学习记忆与克服学习障碍。上述假说尚需进一步研究加以验证。需要进一步研究与确认LCPU FAs 对NMDA和２－氨甲基苯乙酸受体、MAPK、ERK、CREB及GABA的影响。至于LCPUFAs 本身是否影响神经元可塑性以及直接调节学习记忆，迄今尚不明确。[１６]

６结语
　　基于上述分析，LCPUFAs 不仅为脑正常生长发育所必需，而且与神经纤维瘤蛋白、ras 、胰岛素及神经营养因子的基因表达、GABA及其他神经递质浓度密切相关。这些链接系统如果出现遗传、结构和功能异常即可诱发学习缺陷。

　　TNFα是一种神经毒素，但生理浓度的TNFα对突触效能是必要的，因为它能通过增强２－氨甲基苯乙酸受体表面的基因表达来提高突触效能[１８]。这有点类似于ras 在学习记忆中的作用：ras 的精密调节为学习记忆所必需[８]。TNFα高浓度时可产生神经毒性，低浓度损害突触强度，而生理浓度则可提高突触效能。
　　ras 可通过抑制p５３介导的细胞凋亡提高神经元的存活率[１９]。ras 还可凭借上调血管内皮生长因子（VEGF ）活性和刺激PI３K促进血管生成。TNFα、NO和LCPUFAs 及其产物也能刺激血管生成[２０]。长时记忆的形成需要RNA和蛋白质的合成的更新，而这些均需要增加血流供应。因此，TNFα、NO、LCPU FAs 、ras 和胰岛素不仅改善记忆，而且促进血管生成。

　　研究发现，低血清DHA水平可能是阿尔茨海默氏症的危险因子，EPA、DHA和AA有益于脑的发育和学习记忆功能，这一发现证实了LCPUFAs 在学习记忆中的作用[２１]

　　可以预计，神经纤维瘤蛋白敲除小鼠及NF１患者组织中尤其是脑组织中各种LCPUFAs 浓度均不正常。因此人们怀着极大兴趣来研究补充LCPUFAs 是否能够通过抑制ras 功能、恢复脑中GABA至正常水平纠正LTP特异性损害来使患者学习能力恢复正常。持反对意见者认为NF１是一种遗传功能紊乱，因此LCPUFAs 并不见效。近年来研究发现，口服LCPUFAs 可使一种膀胱纤维化动物模型（cftr－－ ）的病理损害发生逆转，并改善转基因R６/１小鼠（Hunting ton's病的动物模型）及Hunting ton's患者的功能异[２２２３]。上述研究结果表明，补充LCPUFAs 能够减轻实验动物和人类某些遗传性疾病的临床症状。因此，在脑生长关键时期保持足量LCPUFAs 将能够改善学习记忆，尤其对神经纤维瘤病人而言更是如此。应当进一步深入探讨LCPUFAs 与各种神经发育紊乱疾病脑认知功能异常的关系及其机制。

参考文献：
１． Bernabeu R, Bevilaqua L, Ardeng hi P, et al．In－volvement of hippocampal D１/D５receptor－cAMP sig naling pathways in a late memory consolidation phase of an aversively－motivated task in rats．Proc Natl Acad Sci USA，１９９７，９４∶７０４１－７０４６．
２． Bhalla M， Iyeng ar R．Emerg ent properties of net works of biolog ical sig naling pathways．Science， １９９９，２８３∶３８１－３８７．
３． Lisma JE， Fallon JR．What maintain memo －ries﹖Science，１９９９，２８３∶３３９－３４０．
４． Fernandez －Medarde A，Esteban LM，Nunez A，et al．Targ eted disruption of ras－g rf２shows its dis pensability for mouse g rowth and de－velopment．Mol Cell Biol ，２００２，２２∶２４９８－２５０１．
５． Brambilla R， Gnesutta N， Minichiello L， et al．A role for the ras sig naling pathway in synaptic trans－mission and long －term memory．Nature，１９９７，３９０∶２８１－２８６．
６． Giese KP， Friedman E， Telliez JB， et al．Hip－pocampus－dependent learning and memory is im－paired in mice lacking the ras－g uanine－nucleotide releasing factor １ras－GRF１． Neuropharmacol－og y ，２００１，４１∶７９１－７９５．
７． Xue L， Murray JH， Tolkovsky AM．The ras/phos phatidylinositol ３－kinase and ras ERK path－ways function as independent survival modules each of which inhibits a distinct apoptotic sig naling－path way in sympathetic neurons．J Biol Chem， ２０００，２７５∶８８１７－８８２４．
８． Costa RM， Federov NB， Kog an JH， et al．Mechanism for the learning deficits in a mouse model of neurofibromatosis type １．Nature，２００２，４１５∶５２６－５３０．
９． Hebeiss K， Kilbing er H， Cholinerg ic， and GABAerg ic reg ulation of nitric oxide synthesis in the g uinea pig ileum．Am J Physiol ，１９９９，２７６∶G８６２－８６６．
１０． Kendrick KM， Guevara－Guzman R， Zorrilla J， et al．Formation of olfactory memories mediated by ni－tric oxide．Nature，１９９７，３８８∶６７０－６７４．
１１． Das UN．Long －chain polyunsaturated fatty acids in g rowth and evelopment of brain and memory．Nutrition，２００３，１９∶６２－６７．
１２．
Mortensen EL， Michaelsen KF， Sanders SA， et al．The association etween duration of breast－feed ing and adult intellig ence．JAMA，２００２，２８７∶２３６５－２３７１．
１３．Lauritzen I， Blondeau N， Heurteaux C， et al．Polyunsaturated fatty acids are potent neuropro－tectors．EMBO J，２０００，１９∶１７８４－１７９０．
１４．Das UN．Alcohol consumption and risk of de－mentia．Lancet ，２００２，３６０∶４９０－４９４．
１５．Das UN．Is insulin an anti－inflammatory molecule﹖Nutrition，２００１，１７∶４０９－４１３．
１６．Palakurthi SS， Fluckig er R， Aktas H， et al．In－hi bi tion of translation initiation mediates the anti－cancer effect of the n－３polyunsaturated fatty acid eicos apentaenoic acid．Cancer Res ，２０００，６０∶２９１９－２９２３．
１７．Nabekura J， Nog uchi K， Witt MR， et al．Func－tional modulation of human recombinant γ－aminobutyric acid type A receptor by docosahex－aenoic acid．J Biol Chem，１９９８，２７３∶１１０５６－１１０６１．
１８．Owens SP， Innis SM．Docosahexaenoic and arachidonic acid prevent a decrease in dopamin erg ic and serotoninerg ic neurotransmittersin frontal cortex caused by a linoleic andα－linolenic acid deficient diet in formula－fed pig lets．J Nutr，１９９９，１２９∶２０８８－２０９３．
１９．Beattie EC， Stellwag en D， Morishita W， et al．Control of synaptic streng th by g lial TNFα．Sci－ence，２００２，２９５∶２２８２－２２８５．
２０．Arbiser JL， Moses MA， Fernadez CA， et al．Oncog enic H－ras stimulates tumor ang iog enesis by two distinct pathways．Proc Natl Acad Sci USA，１９９７，９４∶８６１－８６６．
２１．Das UN．Is obesity an inflammatory condi－tion﹖Nutrition，２００１，１７∶９５３－９６６．
２２．Freedman SD， Katz MH， Parker EM， et al．A membrane lipid imbalance plays a role in the phe－notypic expression of cystic fibrosis in cftr-/- mice. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96∶13995-14001.
23. Clifford JJ, Drago J, Natoli AL, et al.Essen-tial fatty acids given from conception prevent to-pogra-phies of motor deficit in a tromsgenic mode of Huntingions disease. Neuroscience, 2002, 109∶81-87