学术报告厅

摘要

　　研究锌对红细胞膜脂、膜蛋白的抗氧化保护作用。实验采用黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶、Fe2+/H2O2两种体系产生的O2、OH·对红细胞膜进行氧化损伤。通过电子自旋标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和化学发光技术从不同侧面研究锌在抗氧化方面的作用及机制。结果OH·和O2可致膜脂质流动性降低、膜蛋白分子交联：适量的锌可以抑制自由基的产生，保护膜脂质和膜蛋白免受自由基的氧化，使膜流动性、膜蛋白的电泳图谱基本恢复正常。研究结果表明锌对自由基的氧化损伤有保护作用。

关键词 锌 红细胞膜 自由基损伤

　　作为一种人体必需微量元素，锌广泛分布于人体，发挥多种生理功能。缺锌对人体尤其是孕妇、胎儿和儿童所造成的危害已引起人们的重视，锌作用机制的研究一直为国际前沿的热门课题。以前的研究认为锌可作为超氧化物歧化酶的辅酶催化超氧离子发生歧化反应，适量的锌还可以诱导体内金属硫蛋白的产生[1]，而金属硫蛋白被认为是一种很好的自由基清除剂。研究还发现锌与某些抗氧化物螯合后其抗氧化作用明显高于抗氧化剂单独作用。自由基所造成的氧化损伤被认为是多种疾病的起点，细胞膜是氧化损伤的主要目标之一。目前锌直接保护细胞膜的报道还不多见。本文主要观察了锌对细胞膜的主要组成成分膜脂、膜蛋白的氧化损伤的保护作用，以进一步探讨和理解锌的作用机制。

材料与方法

材料

　　新鲜人血系来自北京市血站，在一周内使用。

主要试剂

　　硫酸锌，5-DOXYL Stearic acid（5-DOXYL），黄嘌呤，黄嘌呤氧化酶（Grade 1），鲁米诺，十二烷基硫酸钠（SDS），丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，过硫酸胺，考马斯亮兰，溴酚蓝，二硫苏糖醇（DTT），2-巯基乙醇（ME）等。以上试剂均购于Sigma公司。硫酸亚铁铵，双氧水（均为分析纯，系国产）。

红细胞膜的制备[2]及膜蛋白含量的测定：

　　用Lowry法测定膜蛋白。充氮气4℃冰箱保存，一周内使用。

标记分组

　　将红细胞膜（蛋白含量为2.0g/L）分为3组:正常对照组、损伤组、加锌保护组。锌的终浓度为100mmol/L，37℃温育30min。分别用以下两个体系进行损伤：Fe2+/H2O2体系（用2%H2O2+200mmol/L硫酸亚铁铵），黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶体系（黄嘌呤用饱和溶液，黄嘌呤氧化酶为9×105U/L）。

自旋标记[3]

　　5-DOXYL用无水乙醇配成10-2mol，取适量自旋标记物，分别加入各组膜中，使标记物终浓度达10-4mol。37℃温育1h，用PBS洗两次。

ESR波谱测试条件

　　处理好的膜沉淀封入石英毛细管中，在Varian E-109型ESR波谱仪上测试。X-波段，微波动率：20mW，调制：2mT，室温检测。

SDS-PAGE电泳

　　将红细胞膜（膜蛋白含量为2.0g/L）分为正常对照组、损伤组及不同浓度的加锌保护组（10μmol/L、100μmol/L、1000μmol/L）。加锌组在损伤前先与锌37℃温育15min。再用氧化体系Fe2+/H2O2（3% H2O2+300μmol/L Fe2+）损伤，30min后终止反应，进行电泳。电泳方法参照临床生化检验[4]。

化学发光[5]

　　将红细胞膜（膜蛋白含量为2.0g/L）30μl，不同浓度锌15μl，黄嘌呤饱和溶液100μl，1mol/L鲁米诺840μl，5×10-2单位黄嘌呤氧化酶10ml，混合。以加入黄嘌呤氧化酶后开始记时，上FT-632型生物化学光度计测试，记录一分钟的发光值。

　　计算与统计学分析

　　据公式[6,7]计算序参数S和旋转相关时间τ。统计分析采用t检验。

结 果

锌对红细胞膜脂的保护作用

　　脂肪酸自旋标记物5-DOXYL可以插入细胞膜类脂双层骨架中，它主要反映红细胞膜表层脂链的运动状态。提取纯净的红细胞膜（蛋白含量为2.0g/L）分为3组（正常对照组、损伤组、加锌保护组）。分别用Fe2+/H2O2体系和黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶体系产生OH·和O2-对膜进行损伤，ESR测定结果如图（1～4）所示：

锌对红细胞膜蛋白的保护作用

　　经OH·损伤后的细胞膜进行蛋白电泳图谱显示：Fe2+/H2O2氧化体系所产生的OH·对膜蛋白有较强的损伤效果，其中距起始点最近的蛋白带和约在94000、67000的蛋白被降解成部分蛋白片段交联，造成条带模糊或成线状分离不开。加锌对膜蛋白有保护作用，且随浓度的增加，保护作用增强，但100μmol/L组与1000μmol/L组差异并不显著。说明在此损伤浓度下100μmol/L的锌即可充分保护膜蛋白免受氧化损伤。

　　锌对黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶产生的化学发光（CL）的影响

　　化学发光法是检测自由基的灵敏、准确的方法，其原理是鲁米诺被活性氧自由基氧化成激发态的氨基肽盐离子，当其返回基态时放出大量光子，从而对CL起放大作用。自由基产生越多，其发光值就越大，反之亦然。根据发光值的大小可反映系统中自由基的量。

　　化学发光的结果如附表所示：

　　记录1min时的发光值，从结果可以看出，随着锌浓度的增加，其发光值有明显的降低。说明锌对黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶体系所引发的自由基有抑制作用，且抑制作用随浓度增加而增强。

附表 不同浓度的锌对自由基的影响

　　在研究中我们使用了电子自旋标记（ESR）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和化学发光技术在体外分别从红细胞膜脂质过氧化、膜脂流动性和膜蛋白等方面研究了锌的抗氧化作用。

　　当前，大量的研究表明，适当的生物膜流动性是表现生物膜正常功能的必要条件。在本研究中ESR标记结果显示，锌可使OH·和O2-造成的红细胞膜流动性降低基本恢复到正常对照水平。说明锌对由OH·和O2-造成的红细胞膜膜脂的氧化损伤有保护作用。在反应中，铁复合物与氧、过氧化物（如H2O2、ROOH、ROOR等）或其它的电子受体反应可引发自由基的产生。锌可与铁竞争从而抑制脂质过氧化的多个环节，其通过竞争与膜表面结合的位点即配位体，可使Fe复合物产生减少，通过Haber-Weiss反应使OH·水平降低，造成脂类转变为活性氧（RO·，RO2·，ROOH等）的链式反应被抑制。氧化还原反应所产生过氧化物（如H2O2、ROOH、ROOR等）或其它的电子受体减少，致使下面的反应被进一步抑制。此外，在氧化反应中所产生的一些有害的脂质过氧化物比其自由基前体能扩散更远的距离，引发更广泛的损伤，如羟壬烯醇就有很强的细胞毒性[8]，锌可抑制一些有害的脂质过氧化物的产生。这样就从多个方面抑制了氧化损伤的发生，保护了红细胞膜膜脂。

　　SDS-PAGE电泳结果显示锌对Fe2+/H2O2体系引发的红细胞膜的非还原性交联有保护作用。Fe2+/H2O2体系作用于红细胞膜通过Haber-Weiss反应（H2O2+ Fe2+X→OH·+OH-+ Fe3+X）产生了大量的OH·，OH·是一种氧化性很强的自由基，它可直接作用于氨基酸，促进蛋白质的交联，自由基的浓度与氨基酸的破坏程度有关[9]。蛋白交联可以通过脂质过氧化介导，红细胞膜的蛋白骨架与磷脂双分子层周边相连，在脂质过氧化过程所产生的过氧基和烷氧基可引发多肽自由基产生，引起交联[10]。OH·也可能直接攻击红细胞膜的蛋白骨架引发蛋白自由基的交联过程。实验在电泳之前加入了DTT，抑制了巯基之间的交联，反应以非还原性交联为主。电泳图谱显示：锌对反应所引起的交联有抑制作用，且抑制作用随浓度的增加增强。我们认为可能因为锌与铁通过竞争膜表面结合位点，干扰了铁离子的氧化还原，使Haber-Weiss反应中产生的OH·减少，抑制了通过上述两种途径交联的发生。此外，一些有害的脂质过氧化产物如丙二醛（MDA）也可与氨基酸反应生成烯胺，使得氨基酸分子交联。锌对红细胞膜的脂质过氧化有抑制作用，它可使氧化过程所产生的MDA量减少，减少交联的发生。保护了红细胞膜膜蛋白。

　　化学发光强度与膜脂质过氧化水平密切相关。我们应用它来研究脂质过氧化的变化。结果显示，锌对黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶体系所引发的自由基有抑制作用，且抑制力随浓度的增加而增强。这可能是由于锌与红细胞膜结合，抑制了膜脂质过氧化过程中所产生的自由基及其激发态基团，从而降低了反应所产生的自由基对膜的损伤。

　　生物膜的氧化损伤可影响细胞的正常功能，是很多疾病的起点。锌对红细胞膜质和膜蛋白的抗氧化保护作用将对维持膜正常结构和功能，及自由基损伤引起的疾病的防治具有重要意义。

参考文献

1.杨月欣，刘建宇.锌诱导金属硫蛋白体内合成的

实验研究.微量元素与健康，1996,13（1）：1.

2.Dodge JT, Mitchell C, Hanahan DJ.The preparation and chemical characteristics of hemoglobin free ghost of human erythocyte. Action Biochem Biophys， 1963，100:119.

3.赵保路.用脂肪酸自旋标记研究中国地鼠肺正常细胞V79和癌变细胞V79-B1膜的流动性.科学通报，1982，27：686.

4.上海医学化验所主编,临床生化检验. 上海：科学技术出版社，1985：246.

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7.程时，谢一琳，华钥.金属硫蛋白对大鼠红细胞膜受羟自由基损伤保护作用的自旋标记-ESR研究.生物物理学报，1992,8：104.

8.Slater TF. Free radical mechanisms in tissue injury. Biochem J，1984，222:1.

9.Chvapil M, Montgomery D, Ludwig JC et al. Zinc in erythrocyte ghosts. Proc Soc Exp Biol Med， 1979，162:485.

10.邵 洪.氧自由基与蛋白质代谢.国外医学分子生物学分册,1990，12（1）：42.