学术报告厅

王新利 孙江平 叶广俊 北京大学儿童青少年卫生研究所(北京 100083)

　　摘要:目的：探讨β3－肾上腺素能受体（β3－adr）基因突变与汉族儿童单纯性肥胖、血脂及胰岛素水平的关系；分析β3－adr基因突变与肥胖儿童对膳食干预应答差异的关系。方法：在北京城区4所小学中随机选取311名8～11岁健康儿童，其中体重超重肥胖儿童73名，非体重超重儿童243名。所有研究对象均用PCR－RFLP方法检测β3－adr基因中编码多肽链第64位的色氨酸密码子被精氨酸密码子（Trp64Arg）取代突变，并进行身体测量及血脂、胰岛素检测，从体重超重儿童中选出47名单纯性肥胖儿童。将其随机分为两组，第一组36人为膳食干预组，第二组11人为对照组。膳食干预3个月再次进行体格测量。结果：73名体重超重儿童突变频率为018，正常儿童突变频率为017，两组差异无显著性；在修正了年龄、性别后，311名儿童中有基因突变组与无突变组比较，未发现体质指数（BMI）、血压、血脂及空腹胰岛素水平存在显著性差异；膳食干预研究发现，在膳食干预组无β3－adr基因Trp64Arg突变儿童（13名），其体重、BMI增长幅度明显低于非膳食干预组（分别为241±056对443±070，P<005；048±024对155±035， P<005），然而携带有β3－adr基因Trp64Arg突变儿童（23名）经3个月膳食干预，体重及BMI增长幅度与非膳食干预对照组相比无显著性差异（分别为432±069对443±070；147±032 对155±035）。结论：虽然β3－adr基因Trp64Arg突变可能不是影响汉族儿童单纯性肥胖的主要因素，但该突变参与了肥胖的发病，对肥胖儿童的膳食干预效果可能有一定的预测作用。

　　关键词：肥胖；β3－肾上腺素能受体基因；儿童；膳食干预

　　Abstract： objective：to determine if a recently identified mutation in β3－abreneric receptor gene was related to children obesity, dyslipidemia and hyperinsulinemia, and to analyze association of this mutation with response to diet intervention of obesity Methods: 311 health children aged 8～11 years including 73 overweight and 243 non－overweight were selected randomly from 4 primary schools in Beijing A mutation of β3－abreneric receptor gene resulting in the replacement of tryptophan by arginine at position 64 (Trp64Arg) encoding amino acid residues was detected by using the PCR － RFLP for all of them Fasting insulin and lipids were measured and Anthropometry was carried out 47 obesity children were selected randomly from overweight children and were separated into two groups One was diet intervention group (36 subjects); the other was control group (11 subjects) After 3 months diet intervention, the subjects of two groups were carried out anthropometry again Results: Frequency of mutated allele was similar in overweight and normal children (018 and 017, respectively) Moreover, adjusted for age and gender, there was not significant difference in body mess index (BMI) and the levels of fasting lipids and insulin between those with mutation and without mutation among 311 children However, the study of diet intervention in overweight children showed that the increases of weight and BMI were had significantly lower in children without mutation than in control group (241±056 vs 443±070,P< 005；048±024 vs 155±035,P< 005, respectively), but the changes in weight and BMI in children with mutation were close to the results in the control (432±069 vs 443±070；147±032 vs 155±035) Conclusions: The Trp64Arg mutation of β3－abr gene may contribute to the onset of obesity and forecast the result of overweight children with diet intervention to some extent, although the Trp64Arg mutation of β3－abr gene may not be a major factor effecting on weight in Chinese children
　　
　　Key words: obesity; β3－adrenergic－receptor gene; dietary intervention; children

　　肥胖已被认为是影响人类健康和生存质量的一种主要慢性疾病[1]。尽管导致肥胖的直接原因是由于热量的摄入与能量输出失衡，但自20世纪70年代后期开始，所采取的一系列治疗措施的远期疗效均不理想。在接受治疗者中，相当一部分在一段时间后又恢复原有体重[2，3]，因此有关肥胖易感性的研究便成为近年来研究的焦点之一。
　　儿茶酚胺是体内增加能量动员、利用及产热的激素，多种储存于体内的燃料经过儿茶酚胺的作用被动员，儿茶酚胺调节能量代谢的作用通过4种受体来实现[4]。其中β3－肾上腺素能受体主要分布在腹腔内脂肪组织，直接调节腹腔内脂肪组织的脂解过程[5]。在肥胖的啮齿类动物中β3－肾上腺素能受体（β3－adr）表达明显下降[6]，给肥胖的啮齿类动物长期使用选择性β3－adr激动剂治疗，可减少体内脂肪的储存，还可改善由于肥胖引起的胰岛素抵抗现象[7]。近年来国外有研究显示：在人类，β3－adr基因中编码氨基酸序列第64位色氨酸的密码子被精氨酸密码子取代突变（Trp64Arg）与肥胖的易感性及胰岛素抵抗的发生相关，但也有研究不支持这一结果[8～10]。在国内尚未见有关β3－adr基因中这一突变与国人肥胖关系的公开报道。因此本研究的目的：⑴分析汉族儿童β3－adr基因Trp64Arg突变频率，探讨该突变与中国汉族儿童单纯性肥胖、血脂及胰岛素水平的关系；⑵分析β3－肾上腺素能受体基因Trp64Arg突变与肥胖儿童对膳食干预应答差异的关系
　　
1　材料与方法

11　研究对象

　　从北京城区4所小学中采取整群随机抽样法抽取了311名8～11岁健康儿童为研究对象，其中男151名，女160名。以1985年“中国学生体质与健康研究”中制定的身高标准体重法来判断儿童体重超重或肥胖，317名儿童中,体重超重儿童73名，男49名，女24名。从体重超重儿童中选出单纯性肥胖儿童共47名。将其分为两组，第一组36人，为膳食干预组，第二组11人，为对照组。
　　
12　方法

　　体格测量：清晨空腹测量身高、体重、皮褶厚度（肱二头肌、肱三头肌、肩胛下角）、腰围、臀围，计算体质指数（BMI）=体重（kg）/身高2（m2），用儿童专用袖带测量坐位右上肢血压，共测量3次，每次间隔1min，取后二次血压平均值为当时血压。各项指标的测量由专人专项负责，测试人员不知道分组情况。
　　 膳食干预：膳食干预前47名儿童均进行膳食调查，调查方法采用连续3日记帐法（包括一个休息日），膳食指标的计算用北京大有计算机测控技术公司的“膳食调查数据分析”软件在微机上进行。继之膳食干预组按照美国“国家胆固醇教育计划 (NCEP)”膳食控制一级方案(见表1) 执行低胆固醇、低饱和脂肪酸膳食方案，干预期3个月。干预措施主要有营养处方、健康讲座、家访、电话访谈、宣传手册等；非干预对象不采取任何措施。3个月后再次进行膳食调查及体格测量，其方法同前。
表1儿童膳食干预方案
　　　　　 营养素　　　　　　　　　　　　　　 　膳食干预要求
　　 总脂肪（占总热能的％）　　　　　　　　　　　 　　≤30
　　　 饱和脂肪酸（％）　　　　　　　　　　　　　 　　<10
　　　 多不饱和脂肪酸（％）　　　　　　　　　　　 　　≤10
　　　 单不饱和脂肪酸（％）　　　　　　　　　　　 　　10～15左右
　　 胆固醇（mg/d）　　　　　　　　 　　　　　　 　　<300
　　 碳水化物（占总热能的％）　　　　　　　　　　　 　55％左右
　　 蛋白质（占总热能的％）　　　　　　　　　　 　　　10～20左右
　　 总热量　　　　　　　　　　　　　　　　 调节至能促进正常生长发育和达到或维持合适体重
　　
　　体格测量及膳食调查均由专人专项负责，本文作者不参与体格测量及膳食调查，体格测量及膳食调查人员不知道分组情况。
　　 血脂及胰岛素测定：血脂测定由北京医科大学第三临床医院检验科完成，该实验室参加WHO血脂测定质量控制。所用仪器为HITACHI7150自动分析仪。总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）的测定采用酶法，高密度脂蛋白胆固醇（HDL－C）采用磷钨酸－镁沉淀法，低密度脂蛋白胆固醇（LDL－C）按Freidwaids公式计算求得，TC试剂盒为日本第一化学株式会社产品，TG试剂盒为德国Boehringer公司产品，HDL－C试剂盒为北京中生公司产品。胰岛素采用竞争放射免疫分析法测定，试剂盒为中国原子能科学研究院产品，用德国产1260 MULTIGAMMAⅡ计数仪检测，结果由计算机自动打印。
　　 基因分析：常规酚/氯仿抽提外周血基因组DNA，以100ngDNA为模板在总反应体积50μl 内行PCR扩增：上游引物为5'－CGCCCAATACCGCCAACAC－3', 下游引物为5'－CCACCAGGAGTCCCATCACC－3'[9]（由北京赛百盛生物工程公司合成），PCR反应条件：96℃预变性10min；94℃变性40s，复性61℃40s，延伸71℃1min，循环30次, 最后一个循环72℃延伸5min。PCR产物经15％琼脂糖凝胶电泳，紫外线透射灯下进行检测在210bp处出现荧光带，为特异性PCR产物。在PCR扩增产物中加入限制性内切酶BstNI(鼎国生物工程公司)61℃酶切3h，酶切产物直接用3％琼脂糖凝胶电泳进行分离,溴乙啶染色观察结果。
　　 统计分析 ：等位基因频率用基因计数法进行计算，计数资料采用χ2检验，计量资料分析时，为满足正态分布的需要，血清胰岛素水平及脂蛋白（a）均进行了对数（Ln）转换，然后进行多因变量线性模型的方差分析。统计分析用SPSS FOR WINDOWS 80统计软件包进行。
　　
2　结 果

21　β3－肾上腺素能受体等位基因中Trp64Arg突变频率

　　210bp的PCR扩增产物，经限制性内切酶BstNI酶切后结果见图1。Trp64为正常纯合子在99、62、30、12和7bp处出现荧光带；Trp64/Arg64为突变杂合子在161、99、62、30、12和7bp处出现荧光带；Arg64为突变纯合子在161、30、12和7bp处出现荧光带。由于12和7bp片段太小，在3％的琼脂糖凝胶电泳上观测不到这二条荧光带。311位汉族儿童β3－adr Trp64Arg突变频率为0175，其中男生与女生基因型分布比较无统计学差异（见表2）。

Arg64 Trp64Arg Trp64 M PCR
M：分子量标记
图1β3－Adr基因Trp64Arg 突变电泳结果
表2不同性别β3－adr基因Trp64 Arg突变频率比较
　　　　　　 Trp64/Trg64　　　　　　　 　　Trp64/Trg64　　　　　 　 　Trp64/Trg64
　　　　　　 n（％）　　　　　　 　　　 　　n（％）　　　　 　 　 　　　n（％）
男生　　　　100（662）　　　 　 　　　　　48（318）　　 　　　　　　3（20）
女生　　　 109（681）　　　 　　　　　　47（294）　　　 　　　　　4（25）
　　 x2=0281　P=0869　　

22　β3－肾上腺素能受体基因中Trp64Arg突变与肥胖

　　311名儿童中体重超重儿童73名，β3－adr基因 Trp64Arg突变频率为018，肥胖儿童47名，突变频率为019，非体重超重儿童238名，突变频率为017，不论体重超重儿童还是肥胖儿童，其与非体重超重儿童相比，β3－adr基因 Trp64Arg突变频率均无统计学差异（χ2值分别为001和020，P>05）。进一步将311名研究对象根据β3－adr基因型的不同分为3组，结果如表3所示，虽然突变杂合子与纯合子两组总皮褶厚度（肱二头肌、肱三头肌和肩胛下角3处）略高于正常纯合子组，但也无统计学意义。
表3按年龄、性别修正后不同等位基因间体脂分布比较（x±SE）

23　β3－adr基因中Trp64Arg突变与血脂、血压及胰岛素水平关系

　　结果如表4所示：血脂及脂蛋白水平在正常纯合子、突变杂合子及突变纯合子3组间比较不存在统计学差异；收缩压、舒张压和空腹胰岛素水平虽然在突变纯合子组水平最高，收缩压及空腹胰岛素水平在正常纯合子组最低，但3组比较其差异也无统计学意义。
表4按年龄、性别修正后不同等位基因间血脂、血压及胰岛素水平比较（x±SE）

24　47名肥胖儿童膳食调查结果

　　膳食干预前，47名肥胖儿童每日膳食中脂肪供能占总热量的407％，每日胆固醇摄入量在450～760mg。经过为期3个月的膳食干预，干预组儿童脂肪供能由干预前的407％下降到312％（P<005），每日胆固醇摄入量下降为250～500mg (P<005)。对照组两次膳食调查在脂肪供能占总热能的百分比及胆固醇摄入量方面均无统计学差异。
　　
25　β3－肾上腺素能受体基因中Trp64Arg突变与肥胖儿童对膳食干预应答差异的关系

　　36名进行膳食干预的肥胖儿童根据β3－adr基因是否存在Trp64Arg突变又进一步分为突变组与非突变组。对正处于生长发育期的儿童来讲，各种体格测量值均随年龄的增长而发生变化，为了更准确地评价膳食干预的效果，本研究中采用了各种体格测量值的变化值，即每个儿童的第二次体格测量值减去其第一次体格测量值来进行评价。结果如表5所示：在β3－adr基因Trp64Arg突变组，3个月的膳食干预对体重及BMI影响不大，该组儿童体重及BMI增长幅度与非膳食干预对照组相比无统计学差异，但在无β3－adr基因Trp64Arg突变组，其体重、BMI增长幅度均低于有β3－adr基因Trp64Arg突变组和非膳食干预组，且存在统计学差异；而总皮褶厚度及血压的变化幅度，3组比较，虽具有与体重、BMI类似趋势，但无β3－adr基因Trp64Arg突变组与其他两组相无比统计学差异。本研究中身高增长幅度，由表5可见不受膳食干预影响。说明本研究中所采用的膳食干预方案足以满足儿童正常生长发育需要。
　　
3　讨论

　　人β3－adr基因定位于8p111－p12[11]，关于中国汉族人群的β3－adr基因的Trp64Arg突变频率尚未见公开报道。在本研究中对311例8～11岁儿童基因分析得出中国汉族人群该基因的突变频率为0175。近年来，不同种族的人群研究发现β3－adr基因的Trp64Arg突变存在种族差异，Pima 印第安人突变频率最高为031[8]，日本人群的突变频率居中为019[9]，而在法国巴黎及美国的白种人中突变频率较低分别为010和008[8,12]。很显然中国人群中β3－肾上腺素能受体基因的Trp64Arg突变频率明显高于欧洲白种人，与日本人群非常接近。如果该基因突变能导致肥胖的易感性增加，那么是否有理由推测中国人群如果采用完全西式的膳食方案，可能会导致肥胖的发病率急剧增加，并超过欧洲国家的发病率。
　　 但是在本研究中未得出β3－adr基因的Trp64Arg突变与肥胖、体脂分布及血清胰岛素水平相关的结论。1995年Walson等[8]首次报道β3adr基因Trp64Arg突变可能与肥胖和非胰岛素依赖型糖尿病有关，由于β3－adr的Trp64Arg突变正好位于受体的第一个细胞内功能区，基于对膜受体结构与功能的研究，受体的第一个细胞内功能区对维持受体在细胞表面的运动和受体与G蛋白偶联均起到至关重要的作用。因此Walson推测这一突变可能影响了受体的正常功能而致肥胖易感性增加。但随后关于β3－adr基因Trp64Arg突变与肥胖及体脂分布关系的人群研究一直存在矛盾。Hiroko 等[9]对350名日本人的研究不仅发现肥胖者（BMI>26）中β3－adr基因的Trp64Arg突变频率明显增加，而且在正常人群中β3－adr基因Trp64Arg突变纯合子的BMI明显高于非突变者；但是Nagase 等[10]同样是对日本人群进行研究却得出β3－adr基因的Trp64Arg突变与肥胖无关的结论。分析原因，首先可能与肥胖作为一种复杂表现型（complex phenotype）受多基因控制有关，因此表现型不存在基因与表现型之间的一一对应关系，且易受到环境因素的影响。其次研究对象的年龄及肥胖程度也是造成矛盾的原因之一，在重度肥胖者中存在基因异常的可能性要大于轻度肥胖者，此外肥胖易感基因与其他调节内分泌和代谢的基因往往存在有相互影响作用，使得肥胖症状的产生有时需要一定的时间。本研究中的研究对象一方面是儿童，另一方面肥胖儿童中以轻中度肥胖者为主，而且肥胖儿童的样本量偏低，因此有关β3－肾上腺素能受体基因的Trp64Arg突变与体脂分布的关系尚需在重度肥胖者中作进一步研究。
　　 本研究在膳食干预治疗前对47名肥胖儿童膳食调查发现，其膳食结果存在明显不合理，不仅表现为总热量中脂肪供能过高，超过世界卫生组织推荐的脂肪供能标准上限25％～30％，而且总胆固醇摄入量也明显超标。目前关于高脂膳食可以导致肥胖已成定论。人群调查和动物实验都表明肥胖与膳食中脂肪含量呈正相关，与碳水化物及蛋白质呈负相关[13]。本调查结果说明在家长及儿童中普及必要的营养与食品卫生知识是非常必要的。
　　本研究经过为期3个月的膳食干预，再次进行体格测量发现干预组中无β3－adr基因Trp64Arg突变的肥胖儿童体重增长幅度明显低于有β3－adr基因Trp64Arg突变的肥胖儿童和非干预对照组肥胖儿童。由于本研究采用盲法设计，即设计者和基因分析者不参与膳食干预及体格测量，因此研究结果较客观。该研究结果与国外成年人研究结果类似[14，15]，关于儿童尚未见相关报道。以往有关儿童膳食干预失败的原因，多考虑与环境因素有关，如：家长的营养与健康知识水平，父母亲受教育程度以及儿童自身对肥胖的认识程度等。固然环境因素对膳食干预方案的正确实施起到不容忽略的作用，但是本研究结果从遗传基因角度证明，遗传基因提供的对环境因素的抵御能力，同样不容忽视。
　　
参考文献

　　[1]Wickelgren I Obesity: Science ，1998, 280: 1364－1367
　　[2]萧黎，范群中国学校卫生，1995，16（5）：389－390
　　[3]Grodstein F, levine R, Troy L, et al Arch Intern Med，1996， 156: 1302－1306
　　[4]Amer PAm J Clin Nutr ，1992，55: 228s－236s
　　[5]Krief S, Lonnqvist F, Raimbaullt S, et al J Clin Invest ，1993， 91: 344－349
　　[6]Collin S, Daniel KV, Ramkumar V, et al Mol Endocrinol ，1994，8: 518－527
　　[7]Himms－Hagen J, Cui J, Danforth E Jr, et al Am J Physiol ，1994，266: R1371－R1382
　　[8]Walston J, Silver K, Bogardus C, et al N Engl J Med ，1995, 333: 343－347
　　[9]Hiroko K, Yasuda K, Iwamoto K, et al Biochem Biophys Res Commun ，1995, 215: 555－560
　　[10]Nagase T, Aoki A, Yamamoto M, et alJ Clin Endocrinol ＆ Metab, 1997, 82: 1284－1287
　　[11]Comuzzie AG, Allison DBScience，1998, 280:1374－1377
　　[12]Clement K, Vaisse C, Manning BS, et al N Engl J Med ，1995， 333: 352－354
　　[13]Hill JO, Peters JC Science ，1998, 280: 1371－1373
　　[14]Fogelholm M, Valve R, Kukkonen－Harjula K, et al J Clin Endocrinol ＆ Metab，1998, 83(12): 4246－4250
　　[15]Yoshida T, Sakana N, Umekawa T, et al Lancet，1995, 346: 1433－1434