毛德倩 杨晓光 牟维鹏 中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所 摘要：本文描述了采用PCR（聚合酶链式反映） 方法来检测转基因玉米和大豆中GMO（遗传修饰物质）的方法。检测的步骤包括：（1）玉米和大豆基因组DNA的提取；（2）对转入的35s启动子和NOS终止子利用PCR方法进行扩增；（3）对玉米和大豆的特异性基因进行PCR扩增，以确定确实是玉米和大豆；（4）利用琼脂糖凝胶电泳及酶切方法对PCR产物进行描述与确认。
关键词： PCR， Bt-176玉米， Round-up Ready 大豆（RR大豆），基因修饰物质（GMO）
前言： 自FLAVR SAVR西红柿在美国进入市场后，现在已经有许多的转基因作物及其产品进入市场，同时，其安全性问题也越来越引起消费者的重视。在一项调查中，大约有50%的被访人员表示不会食用转基因食品，而只有2%的被访人员表示会无条件的食用。利用标签对转基因食品进行说明是一个解决消费者忧虑的方法，当有135个国家在2000年1月对此已达成协议。如欧盟规定，食品中GMO的含量如果超过1%，就必须在标签上做出标示。，必须对食品中的GMO进行检测。
现在，对食品中的GMO的检测大都采用PCR方法。由于大多的转基因食品的基因都含有CaMV35s启动子和/或NOS终止子，因此，在检测食品中是否含有GMO时，可直接检测CaMV35s 启动子或NOS终止子的存在与否，如果存在， 即可说明其中存在GMO。
1、材用和方法
1.1样品：Bt-176玉米 0%， 0.1%， 0.5% 2%
Round-up Ready大豆 0%, 0.1%, 1% 2%
1.1.1 样品处理：DNA的提取：利用CTAB方法进行DNA的提取，用Promega公司的DNA纯化试剂盒对提取出的DNA进行纯化，最后得到50μl的DNA溶液， 保存于-20℃。
1.1.2 PCR扩增：
引物
35S-1: 5’ –GCT CCT ACA AAT GCC ATC A-3’
35S-2: 5’ –GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA-3’
NOS-1: 5’ –GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG-3’
NOS-4: 5’ –GAT TGA ATC CTG TTG CCG GT-3’
NOS-5: 5’ –GTA ACA TAG ATG ACA CCG CG-3’
NOS-6: 5’ –CCC ATC TCA TAA ATA ACG TC-3’
IVR-1: 5’ –CCG CTG TAT CAC AAG GGC TGG TAC C-3’
IVR-2: 5’ –GAT CGT CAT GCT CTA CAC GGG CTC C-3’
LEC-1: 5’ –TGC CGA AGC AAC CAA ACA TGA TCC T-3’
LEC-2: 5’ –TGA TGG ATC TGA TAG AAT TGA CGT T-3’
(1) 对35s进行扩增：
首先配制反应液，每个反应管45μl反应液，再加入5μl的DNA溶液： PCR扩增条件：预热，98℃，2分；降解，95℃，30秒；退火，54℃，40秒；延伸，72℃，40秒；40个循环，最后延伸，72℃，3分；保存，4℃，15分。
PCR结束后，离心数秒，各取10μl的PCR产物，加入2μl的显色剂，混匀，利用琼脂糖疑胶（2%w/v）电泳进行检测，电泳结果利用紫外成相仪进行观察。
利用限制性内切酶对35s启动子进行酶切，利用琼脂糖凝胶电泳进行检测，对电泳结果利用紫外成相仪进行观察。
（2） 利用雀巢PCR法对NOS终止子进行扩增：
配制第一次PCR的反应液，与CaMV35s的反应液的配制方法相同，只是将引物更换为NOS-4和NOS-5。进行PCR扩增。 配制第二次PCR的反应液，每一管48μl，加入2μl的第一次PCR扩增产物： PCR结束后，离心数秒，各取10μl产物与2μl的显色剂混匀，利用琼脂糖凝胶（2% w/v）电泳进行检测，电泳结果利用紫外成相仪进行观察。
(3) 玉米和大豆特异性检测：
我们所用的基因为IVR基因，是玉米的特异性基因，反应液的配制：与CaMV35s的反应液配制方法节相同，所加引物为IVR-1和IVR-2，最后加入5.0μl的玉米DNA。
PCR结束后，离心数秒。各取10μl，加入2μl的显色剂，混匀，之厅凝胶电泳。
大豆特异性基因为LEC基因，大豆PCR反应液的配制和CaMV35s的反应液配制方法相同，所用引物为LEC-1和LEC-2，最后加入5.0ul的大豆DNA，
PCR结束后，离心数秒，各取10μl，加入2μl的显色剂，混匀，进行凝胶电泳。
2、结果与讨论
PCR是整个程序中的一个必要的部分，PCR方法已经发展的比较成熟，已常规应用于分子生物学，并且已越来越多的应用于食品分析。但每一种检测转基因食品的方法都需要考虑一些特殊的情况，如从食品中提取DNA的效率，可能存在的PCR抑制剂，DNA的降解，可能存在的RNA，以及选择合适的靶序列的引物来保证扩增的成功等。
2.1DNA的提取
DNA的提取是此检测方法中的关键的一步，其效率高低直接决定着后面PCR的成功与否。这种方法已经应用于Bt-176玉米的检测，本方法与它的方法有许多不同之处。在玉米和大豆中存在的大量淀粉及其他形式的多糖，有可能是DNA聚合酶的抑制剂。DNA提取出来以后，采用Promega公司的植物基因组DNA纯化试剂盒进行纯化。
2.2 PCR扩增
Bt-176玉米和RR大豆中的CaMV35s启动子来自于花椰菜病毒，NOS终止子来自于土壤中菌属的胭脂氨酸合酶基因，许多转基因作物都采用CaMV35s启动子来促进转入基因片段的表达，而采用 NOS终止子来结束转入基因的转录。本研究所采用的Bt-176玉米以及RR大豆都含有CaMV35s启动子，而RR大豆还含有NOS终止子，Bt-176玉米不含有NOS终止子。 CaMV35s启动子是一段长195bp的碱基序列，如图l和图2所示，经过PCR扩增以后，在凝胶电泳检测中，其条带位置在200bp左右。图1中2，3，4泳道中RR大豆的含量分别0.1%，1%和2%，条带亮度依次增强；图2中2，3，4泳道中Bt-176玉米的含量分别为0.1%，0.5%，2%，条带亮度依次增强。但两图中0泳道中也都出现了相同的条带，这是CaMV35s启动子扩增时出现的非特异性条带，因此，35s 最终确定需要利用限制性内切酶来进行酶切。 NOS终止子经过雀巢PCR扩增以后，为一段104bp的序列，如图5，其条带在100bp左右。由于NOS终止子采用了雀巢PCR扩增的方法，其特异性很高，因此，可直接判断此条带即为NOS终止子的条带。与CaMV35s启动子一样，2，3，4泳道中条带的亮度也依次增强，而泳道 5 是一未知 RR大豆准确含量的样品。
IVR基因是玉米的特异性基因，是判断所测样品是否是玉米的特异性基因片段，其长度为225bp，如图6，泳道l，2，3，4为玉米，其长度大约在200bp左右；LEC基因是大豆的特异性基因，是判断所测样品是否是大豆的特异性基因片段，其长度为414bp，在图6中，泳道5，6，7，8是大豆条带，大约在400 bp左右。
2.3 限制性内切酶：
由于CaMV35s启动子在进行PCR时会出现非特异性条带，因此，需要利用限制性内切酶进行切割，以确定确实为CaMV35s启动子。限制性内切酶Xmnl的切位点是5’-GAANN▲NNTTC-3’，利用Xmnl可以将CaMV35s启动子切割成两条带，80bp和115bp。
对食品中是否含有转基因成分进行检测基于以下步骤：（l）食品基因组 DNA 的提取；（2）对插入的CaMV35s启动子和NOS终止子进行PCR扩增；（3）对食品的特异性基因进何扩增以确定含有何种成分；（4）利用限制性内切酶和琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行确认与描述。
上面所描述的方法可以作为检测RR大豆和Bt-176玉米的一种方法。在这种方法中，DNA的提取很关键，由于玉米的淀粉含量比较高，提取的DNA的效率较低，因此，PCR产物的量不如大豆的多，电泳图谱的条带的亮度比大豆的低。我们以后的工作将集中于：（1）对玉米的提取方法进一步进行优化，并探索其它形式食品的DNA的提取方法；（2）对转入的目的基因，即靶基因进行PCR检测；（3）对GMO（基因修饰物质）进行定量。
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