达能营养中心第七届学术研讨会论文集
（北京大学公共卫生学院营养与食品卫生学系，北京 100083；*中国医科大学附属第二医院，沈阳 110001）
摘要： 目的：初步探讨蛋氨酸合酶（MS）基因变异与先天性心脏病（CHD）表型的关系。方法：通过出生缺陷登记卡选择辽宁省193名CHD患者（其中男94人，女99人）及其生物学父母（核心家庭）作为病例组，另选取同地区且无出生缺陷病史及家族史的104名正常人（男60人，女44人）及其生物学父母作为对照组，进行MS基因A2756G位点多态性检测（PCR-RFLP法）。结果：正常人群（对照组子代）中存在MS基因A2756G位点杂合突变(+/-),但未检出纯合突变(+/+)基因型，其中(+/-)基因型和(+)等位基因的频率分别为10.7％和5.3％。CHD患者及其母亲的基因型构成和等位基因频率与对照组相比无明显差异（P>0.05），病例组父亲(+)等位基因频率（5.0％）低于对照组（9.1％，P＝0.060），其子代罹患CHD的比值比（OR）为0.53(95％可信区间：0.25～1.09)。两组父母基因型组合差异无显著性。不同类型CHD组与对照组核心家庭成员A2756G位点基因型构成比亦无明显差异；等位基因传递失衡分析显示，突变等位基因(+)在CHD核心家庭中存在遗传失衡现象，即父母将等位基因(+)传给CHD患者的比例低于(-)，其OR值为0.26(95％可信区间：0.11～0.60)。结论：个体MS基因A2756G位点变异与CHD发生无明显关联，有待进一步研究；而亲代MS基因A2756G位点变异与子代CHD的发生相关，其突变等位基因(+)可能降低子代CHD的危险性。
关键词： 蛋氨酸合酶 基因多态性 先天性心脏病 核心家庭
先天性心脏病（Congenital heart disease，CHD）是指胚胎或胎儿在宫内发生的心脏发育异常，是儿科最常见的病种之一，亦是导致孕妇流产、围产儿和婴幼儿死亡的最主要原因之一。目前有关CHD的病因学及发病机理尚不完全清楚，但绝大多数CHD为遗传因素和环境因素共同作用的结果，属多基因病。近年来有关Hcy与出生缺陷的关系受到研究人员的日益关注。大量基础研究以及流行病学调查结果显示高同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）血症是出生缺陷，尤其神经管畸形发生的一项重要的危险因素，而神经管与心脏的发育存在一定关联；动物实验结果显示Hcy可致鸡胚心血管发育畸形【1,3】；遗传流行病学研究也表明Hcy代谢关键酶——亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变是婴儿发生CHD的危险因素【4】。以上结果提示高Hcy血症可能与CHD的发生有关【2】。Hcy是必需含硫氨基酸——蛋氨酸在机体几乎所有组织中的代谢中间产物，它的主要代谢途径之一是再甲基化为蛋氨酸，该过程由蛋氨酸合酶（MS）催化完成。MS基因缺陷可能导致其酶活性的改变，使Hcy再甲基化途径受阻进而引起Hcy蓄积，并与CHD的发生相关。但目前尚未见关于MS基因变异与CHD关系的报道。
核心家庭是指由一个子女及其生物学父母所组成，以子代的两个等位基因为“病例”，以父母的非遗传等位基因为“内对照”，寻找与疾病发病有关的遗传标志。其优点为不必为病例寻找具有相同背景的对照而可以克服遗传因素的种族差异的混杂作用。本研究一方面通过成组匹配的病例－对照设计探讨亲代及子代MS基因型与子代CHD表型的关系；另一方面通过核心家庭内的病例－父母对照研究了解MS等位基因的传递失衡情况。
1 对象与方法
1.1 研究对象
通过出生缺陷登记卡选择辽宁省193名CHD患者（0～31岁，其中男94人，女99人）及其生物学父母作为病例组。CHD类型由专科医生确诊，包括85例（44.0％）单纯室间隔缺损患者、28例（14.5％）动脉导管未闭、19例（9.8%）法乐四联征、16例（8.3％）房间隔缺损、32例（16.6％）其它类型（如肺动脉狭窄、右室双出口、三尖瓣下移、主动脉缩窄等）及13例（6.7%）多种CHD合并的患者。
另选取同地区且年龄、性别匹配，无出生缺陷病史及家族史的104名正常人（0～33岁，其中男60人，女44人）及其生物学父母作为对照组。
1.2 研究方法
1.2.1 血样采集 采集核心家庭成员空腹静脉血3～5毫升，分离血清与血凝块。
1.2.2 MS基因A2756G位点多态性检测
盐析法由血凝块中提取基因组DNA。
聚合酶链反应（PCR）扩增特异片断，引物参照文献设计【6】，序列为上游引物5＇-CAT GGA AGA ATA TGA AGA TAT TAG AC-3＇和下游引物5＇-GAA CTA GAA GAC AGA AAT TCT CTA-3＇。PCR反应体系10μl，其中各成分的终浓度分别为氯化镁2.0 mmol·L1、引物0.5μmol·L1、三磷酸脱氧核糖核苷酸0.25 m mol·L1，Taq DNA聚合酶1.2单位，DNA模板2μl。PCR反应条件为94℃4分钟（预变性），94℃30秒（变性）、55℃30秒（退火）和72℃45秒（延伸）共30个循环，最后延伸72℃7分钟。
PCR扩增产物用6单位HaeⅢ限制性内切酶37℃消化4小时后，以12％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析酶切片段，仅有189bp一个片段为野生型（-/-），有三个片段189bp、159bp、30bp为杂合突变型（+/-），有159bp、30bp两个片段者为纯合突变型（+/+）。
1.2.3 资料整理与分析
采用SPSS和Epi Info统计软件进行数据分析：⑴ 通过χ2检验比较CHD 组与对照组核心家庭MS基因型构成比；⑵ 以CHD患者的两个等位基因作为“病例” ,以父母未传给胎儿的两个等位基因作为“对照”，进行1：1配对的病例对照研究，计算传递失衡指数（Transmitted Disequillibrium Test，TDT）；按成组资料整理数据，计算基于单体型的单体型相对危险度（Haplotype-based Haplotype Relative Risk，HHRR）。
2 结果
2.1 病例组与对照组MS基因A2756G位点基因型构成及等位基因频率比较
本研究正常人群（对照组子代）中存在MS基因A2756G位点杂合突变(+/-),但未检出纯合突变(+/+)基因型；其中(+/-)基因型和(+)等位基因的频率分别为10.7％和5.3％，且无性别差异（χ2＝1.255，P>0.05）。
不同组别分析显示（如表1），病例组与对照组子代基因型构成及等位基因频率无明显差异（P>0.05），分性别分析亦如此。与(-/-)基因型相比，(+/-)基因型罹患CHD的比值比（Odds ratio，OR）为0.84(95％可信区间，0.35～2.01)。
如表2所示，病例组与对照组母亲的基因型分布和等位基因频率无明显差异（P>0.05）。其中病例组父亲(+)等位基因携带者(+/-和+/+基因型)的构成比（10.0％）低于对照组（17.2％，P＝0.084），OR值为0.54(95％可信区间，0.25～1.16)；(+)等位基因频率（5.0％）亦低于对照组（9.1％，P＝0.060），OR值为0.53(0.25～1.09)。
Table 1. Comparison of Genotype Distribution in CHD Patients with Control at MS A2756G Locus
Note. a Compared of genotype frequency with control group by chi-square test, b Compared with control group [OR ＝ 0.85(0.37-1.98) , P = 0.680].
Table 2 Comparison of Genotype Distribution and Allele Frequencies in CHD Parents with Control at MS A2756G Locus
Note. a Compared of genotype frequency with control group by chi-square test, b Compared with control group by chi-square test, Mother: OR ＝ 1.10(0.52-2.40), P ＝ 0.785, Father: OR ＝ 0.53 (0.25-1.09), P ＝ 0.060, Total: OR ＝ 0.76(0.45-1.26) , P ＝ 0.255.
2.2不同类型CHD组A2756G位点基因型构成比较
将伴或不伴其它类型CHD的一类患者作为一组（如室间隔缺损组包括单纯室间隔缺损及室缺合并有其它类型CHD的病例），比较不同类型CHD患者A2756G位点基因型构成，结果显示各组间无明显差异（如表3）。
不同类型CHD组与对照组亲代A2756G位点基因型构成比亦无明显差异（如表4）。
Table 3. Comparison of Genotype Distribution among Different Types of CHD Patients with Control Group at MS A2756G Locus
|
Group |
n |
Genotype n(%) |
OR(95％CI) |
P-value a | |
|
-/- |
+/- | ||||
|
Ventricular septal defect |
91 |
80( 87.9) |
11(12.1) |
1.15(0.44-3.04) |
0.758 |
|
Atrial septal defect |
21 |
19( 90.5) |
2( 9.5) |
0.88(0.00-4.78) |
0.875 |
|
Patent ductus arteriosus |
34 |
32( 94.1) |
2( 5.9) |
0.52(0.08-2.60) |
0.327 |
|
Tetralogy of Fallot |
20 |
20(100.0) |
0( 0.0) |
0.00(0.00-2.02) |
0.126 |
|
Other types |
9 |
9(100.0) |
0( 0.0) |
0.00(0.00-4.94) |
0.302 |
|
Control |
103 |
92( 89.3) |
11(10.7) |
|
|
Note. a Compared with control group by chi-square test.
Table 4. Comparison of Genotype Distribution in Parents among Different Types of CHD with Control at MS-A2756G Locus
|
Group |
Parent |
n |
Genotype n(%) |
OR (95％CI) |
P-value a | |
|
-/- |
+/- and +/+ | |||||
|
Ventricular septal defect |
Mother |
90 |
79(87.8) |
11(12.2) |
1.03(0.40,2.68) |
0.943 |
|
Father |
86 |
77(89.5) |
9(10.5) |
0.56(0.22,1.44) |
0.192 | |
|
Atrial septal defect |
Mother |
19 |
18(94.7) |
1( 5.3) |
0.41(0.01,3.15) |
0.396 |
|
Father |
21 |
19(90.5) |
2( 9.5) |
0.51(0.05,2.46) |
0.521 | |
|
Patent ductus arteriosus |
Mother |
32 |
29(90.6) |
3( 9.4) |
0.77(0.13,3.13) |
0.697 |
|
Father |
36 |
31(86.1) |
5(13.9) |
0.78(0.21,2.45) |
0.649 | |
|
Tetralogy of Fallot |
Mother |
20 |
17(85.0) |
3(15.0) |
1.31(0.21,5.60) |
0.713 |
|
Father |
19 |
18(94.7) |
1( 5.3) |
0.27(0.01,1.96) |
0.299 | |
|
Control |
Mother |
101 |
89(88.1) |
12(11.9) |
|
|
|
Father |
99 |
82(82.8) |
17(17.2) |
|
| |
Note. a Compared with control group by chi-square test.
2.3 病例组与对照组父母基因型组合比较
如表5所示，病例组与对照组父母基因型组合差异无显著性。进一步比较父母至少一方携带(+)等位基因与双方均为野生型组合（-/-和-/-）的家庭数，结果显示亦无明显差异（χ2＝1.060，P＝0.303），OR值为0.74(0.40～1.37)。
Table 5. Comparison of Genotype Combination of CHD Parents with Control
Note. a Compared between two groups by chi-square (P ＝ 0.121).
2.4 CHD核心家庭内等位基因的传递失衡分析
以CHD患者的一对等位基因为病例，以父母未遗传给CHD患者的一对等位基因为对照，进行1:1配对的病例对照研究，计算TDT（表6）；此外按成组匹配的病例对照研究方法整理资料，计算HHRR(表7)。结果显示突变等位基因(+)在CHD核心家庭中存在遗传失衡现象，即由于父母将较大比例的等位基因(-)传给胎儿 ,使胎儿罹患CHD的可能性增高,而(+)等位基因使胎儿发生CHD的可能性降低。
Table 6. Analysis of TDT in CHD Nuclear Families
Note. a TDT(χ2) ＝ 10.028, P < 0.05, OR ＝ 0.29.
|
Group |
n |
Genotype combination of parents a n(％) | ||
|
-/- and -/- |
-/- and (+/- or +/+) |
+/- and (+/- or +/+) | ||
|
Case |
172 |
135(78.5) |
33(19.2) |
4(2.3) |
|
Control |
96 |
70(72.9) |
26(27.1) |
0(0.0) |
Table 7. Analysis of HHRR in CHD Nuclear Families
|
Allele without transmission from parents |
Allele number of CHD patients a |
Total | |
|
+ |
- | ||
|
+ |
1 |
28 |
29 |
|
- |
7 |
280 |
287 |
|
Total |
8 |
308 |
316 |
Note. a HHRR(χ2) ＝ 12.66, P = 0.000, OR ＝ 0.26(95%CI:0.11-0.60).
3 讨论
MS的主要生化功能是催化Hcy再甲基化为蛋氨酸，是Hcy代谢途径的关键酶。MS基因定位于染色体1q43，已知的人类MS基因突变有十余种，其中第2756位碱基A→G（A2756G，相当于密码子919D→G）在西方人群中较为常见，并可能导致血清Hcy水平的改变。本研究正常对照人群中杂合突变基因型(+/-)构成比为10.7％，未检出纯合突变(+/+)基因型；(+)等位基因的频率为4.6％。据报道白种人中A2756G位点杂合子检出率为30％，纯合子为4％左右【10】；日本人(+)等位基因频率为17％【11】；中国正常人群杂合子为17％，纯合子1％，(+)等位基因频率为9.5％【6】。由于遗传变异存在种族差异和地区差异，该结果提示本研究人群A2756G位点变异频率明显低于白种人和日本人，甚至低于其它研究报道的中国人群频率。考虑到遗传变异差异性的客观存在以及样本的代表性，有关中国人群MS基因A2756G位点多态性问题还有待进一步研究。
本研究进一步分析了MS基因A2756G位点变异与CHD的关系，结果显示CHD患者与对照组的基因型构成及等位基因频率无明显差异（P>0.05），杂合突变子(+/-)的OR值为0.84(95％可信区间：0.35～2.01)。分性别分析及不同类型CHD患者与对照组基因型构成差异亦无显著性（P>0.05），OR值介于0～1.15之间。由于亲代基因变异一方面可能通过将突变基因遗传给子代造成子代表型改变，另一方面也可能引起宫内高危环境从而影响子代胎儿期的发育。因此了解亲代基因型与子代表型之间的关联，对于出生缺陷的早期筛查和防治具有重要的意义。本研究分析了先心病患者亲代MS基因变异情况，结果显示病例组与对照组母亲的基因型分布及等位基因频率无明显差异，而病例组父亲(+)等位基因频率（5.0％）低于对照组（9.1％，P＝0.060），其子代罹患CHD的OR值为0.53(0.25～1.09)。该结果提示亲代（尤其父亲）携带突变等位基因(+)可能使子代发生CHD的危险性降低。
有关MS基因多态性与CHD发生的关系目前尚未见报道，已有研究多集中于MS基因变异与神经管畸形的关联【12】，但研究结果并不一致，尚不能完全证明MS基因突变是否与神经管畸形有关【13】。前已述及，MS是Hcy代谢途径中的关键酶，而MS基因2756A→G变异可导致919位密码子D→G的缺失突变，使编码的天冬氨酸置换为甘氨酸。由于该密码子编码的氨基酸位于酶活性区域，因此推测该位点突变可能通过改变蛋白质的二级结构，使MS活性上升或减弱，从而影响体内Hcy水平，以及进一步干扰胚胎期心血管和神经等多个器官、系统的发育【10】。有研究表明Hcy水平在(-/-)、(+/-)及(+/+)基因型间呈递减趋势【10,5】，也有研究表明A2756G位点变异与Hcy水平无明显相关或变异导致Hcy升高【8,9】。本研究结果显示亲代携带突变等位基因(+)可降低子代CHD危险性，这提示MS基因变异可能使酶活性增加，进一步导致Hcy水平下降，以及与之相关的出生缺陷危险性降低。因此本研究下一步将进行Hcy水平的测定，以验证A2756G位点突变与Hcy的关系，为进一步明确MS基因变异与CHD的关联架设桥梁。
以父母为对照的病例对照研究本质上是一种配对研究，这种方法的实质是以患儿的两个等位基因作为“病例”，以父母未传给胎儿的两个等位基因作为“对照”，最大的优点是不必为病例寻找具有相同遗传背景的对照而可以克服遗传因素的种族差异的混杂作用【7】。本研究结果显示突变等位基因(+)在CHD核心家庭中存在遗传失衡现象，即父母传给胎儿等位基因(-)的比例大于(+)，因此等位基因(-)使胎儿罹患CHD的可能性增高，而突变等位基因(+)则使胎儿发生CHD的危险性降低，其OR值为0.26(95％可信区间：0.11～0.60)。这与前述结果一致。因此本研究可初步认为亲代MS基因A2756G位点变异与子代CHD的发生相关，其突变等位基因(+)可能降低子代CHD的危险性。
致谢:本研究由国家重点基础研究发展规划“973”项目（G1999055904）和法国达能膳食营养与宣教基金（DIC2002－08）资助。
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Polymorphism of Methionine Synthase Gene in Nuclear Families of Congenital Heart Disease
ZHU Wen-li，CHEN Jun，DAO Jing-jing，et al.
Department of Nutrition and Food Hygiene, School of Public Health, Peking University, Beijing 100083, China
Objective To investigate the relations of methionine synthase (MS) gene variation with congenital heart disease (CHD) phenotype. Methods 193 CHD patients (94 male and 99 female) and their biological parents (nuclear families) in Liaoning province were selected as case group, and another 104 normal population (60 male and 44 female) and their parents without family history of birth defects as control group. For all subjects the polymorphism of MS gene A2756G locus was examined by PCR-RFLP method. Results In offspring of control group the frequencies of MS genotype (+/-) and allele (+) were 10.7% and 5.3%, without existence of homozygote. The MS genotype distribution and allele frequencies of CHD patients and their mothers were not significantly different with control (P > 0.05). The frequency of allele (+) in case fathers (5.0 %) was apparently lower than control (9.1%, P = 0.060), and the odds ratio (OR) was 0.53 (95% CI: 0.25-1.09). There was no difference in parents’ genotype combination between two groups and either no difference in genotype distribution among different types of CHD. The analysis of genetic transmission indicated that the mutation allele (+) existed transmission disequilibrium in CHD nuclear families. The percentage of allele (+) transmitted from parents was lower than allele (-) with OR 0.26 (95% CI: 0.11-0.60). Conclusion The study showed that the MS gene variation in parents was associated with occurrence of CHD in offspring, and the mutation allele (+) in parents might be related with the decrease of CHD risk in offspring.
Key words: Methionine synthase; Gene polymorphism; Congenital heart disease; Nuclear family