达能营养中心第九届学术研讨会论文集

摘要： 目的探讨不同浓度硫辛酸对视网膜色素上皮细胞氧化损伤的保护作用。方法在培养的ARPE19细胞中预先加入不同浓度的硫辛酸，然后换成含一定浓度的丙烯醛，测定其对细胞生存率、线粒体膜电位及细胞内氧化和抗氧化能力的影响。结果：与50μM丙烯醛组比较，预先在ARPE-19细胞中加入100μM LA和300μM LA 48h能明显提高细胞存活率和线粒体膜电位，增加细胞内SOD和GSH-Px活性，降低ROS含量；而预先加入1-10μM LA没有这种保护作用。结论一定浓度硫辛酸对50μM丙烯醛造成的ARPE-19细胞氧化损伤有明显的保护作用。
关键词：硫辛酸；丙烯醛；视网膜色素上皮细胞；氧化损伤

老年黄斑变性 (agerelated macular degeneration, AMD) 是一种随年龄增加而发病率上升并导致双眼中心视力进行性下降的疾病，它是西方国家55岁以上人群的主要致盲眼病［1］。随着我国经济发展，人口老龄化已经成为主要的社会问题，AMD将成为我国老年人口中的常见病和多发病。最近来自上海某地区的调查表明，在被调查的50岁以上人群中，AMD的患病率为155%［2］。由于AMD具体病因和发病机制尚不清楚，目前尚无有效的治疗方法，因此，预防AMD的发生是非常重要的。许多研究表明，氧化应激在AMD的发生和发展中起重要作用［3,4］，因此，有关氧化应激、视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial, RPE）细胞氧化损伤与AMD发生关系的研究成为当前的热点之一，同时寻找有效的抗氧化剂也成为研究AMD的另一个新热点。本实验将使用丙烯醛(Acrolein)作为氧化剂，硫辛酸（аlipoic acid, LA）作为抗氧化剂研究其对RPE细胞的损伤与保护作用，为探讨AMD的发生机制，寻找预防AMD发生和发展的新方法提供参考资料。
1 材料与方法
11 主要试剂和仪器
丙烯醛(Sigma)，а硫辛酸（德国Klaus Wessel赠送），培养液：DMEM-F12（Sigma，含10%胎牛血清，100U／mL 青霉素和100 (g／ml链霉素）；胰蛋白酶EDTA（Sigma），分光光度扫描仪和荧光光度扫描仪（美国奥克兰研究所营养与代谢中心Ame-s实验室）。其它所有试剂除特殊标志外，均为Sigma公司。
12方法
121 药品配制LA和丙烯醛分别溶于PBS中，а硫辛酸配成储备液，保存在4℃冰箱中，丙烯醛于每次实验使用前现配制。
122 细胞培养及分组人类ARPE19细胞系（Dr Nancy J Philp赠送），分别按05×106、0.05×106和0.1×106的细胞密度种植于100mm2培养皿、96孔和6孔细胞培养板中，置37℃、5%CO2培养箱内。在培养过程中，每3~4天换培养液一次，倒置显微镜下观察，选生长状况良好并贴满培养瓶或培养板底部80%左右的细胞，施加以下处理因素同时分组如下。实验组：将不同浓度丙烯醛（0、1、10、25、50、100 μmol／L）分别加入ARPE19细胞培养液中培养24h。干预组：将不同浓度LA（0、1、10、100、300μmol／L）预先加入到ARPE19细胞培养液中，培养48h后，再换成含丙烯醛（浓度为50μmol／L）的培养液培养24h。以上实验每个浓度组均设3个平行样，且每个实验至少重复2-3次。
123 细胞存活率测定：实验结束后，96孔培养板每孔加入20μl (5mg／ml) MTT溶液，继续培养3小时后，弃去培养液，加入100μl的DMSO，37℃下放置10min，混匀后555nm下测量OD值。
124 细胞线粒体膜电位测定［5］：实验结束后，96孔培养板每孔加入100μlJC1（浓度为2μg／ml，Molecular Probes公司）继续培养30min，然后用细胞培养液冲洗二次，再每孔加入100μl细胞培养液，用多孔荧光计数仪（Wallac 1420; PerkinElmer Life Sciences, Wellesley, MA) 分别在485nm 激发光和535nm、590nm 发射光下测定红、绿色荧光强度，以红／绿荧光比值代表细胞线粒体膜电位。
125 细胞内ROS测定：6孔培养板培养的ARPE19细胞，在实验结束后，每孔加入25μM DCFHDA(2'-7'-dichlorofluorescin, DCFH)1ml，37℃放置30min，然后用冰凉的PBS冲洗三次，加入裂解液在冰浴上放置15min，收集细胞并低温（4℃）离心（15000g）10min，在485 nm激发光和535nm发射光下测定上清液荧光强度，细胞内ROS水平以相对DCF荧光值／μg蛋白质（(BCA 方法测定)来表示。
126 细胞内SOD和GSHPx测定：6孔培养板培养的ARPE19细胞，在实验结束后，用冰凉的PBS冲洗三次，分别按试剂盒(Cayman Chemical公司)要求收集细胞，破碎细胞，-70℃储存备测。
2 结果
21 不同浓度丙烯醛对ARPE-19细胞生存率和线粒体膜电位的影响不同浓度丙烯醛（0、1、10、25、50、100μM）分别与ARPE-19细胞作用24h后，通过MTT和JC1分析结果显示：与对照组比较，0.25μM丙烯醛对ARPE-19细胞的存活率和线粒体膜电位没有影响，但50μM和100μM丙烯醛使细胞存活率分别下降到154%和110% (P＜0.01，图1)；使线粒体膜电位分别下降了65.6%和68.7%（P＜0.01，图2）。

22 LA对ARPE19细胞氧化损伤的保护作用含不同浓度LA的培养液预先与ARPE19细胞作用48h后，再换成含50μM丙烯醛的培养液作用24h，通过MTT和JC1分析结果显示：0300μM LA对ARPE19细胞没有影响，但100300μM LA对50μM丙烯醛造成的细胞存活率下降和线粒体膜电位下降有明显的保护作用（P＜001），110μM LA却没有显示这种保护作用(P＞005，见图3，图4）。

23 LA和丙烯醛对ARPE19细胞氧化和抗氧化能力的影响与对照组比较，50μM丙烯醛与ARPE19细胞作用24h后，能明显引起细胞内ROS增高（P＜0.01），抗氧化酶SOD和GSHPx活性下降（P＜0.01）。100-300μM LA能明显拮抗50μM丙烯醛对ARPE19细胞造成的氧化损伤作用，即降低ROS水平（P＜0.01），提高SOD和GSHPx活性（P＜0.01）。虽然1.10μM LA有拮抗丙烯醛造成的ARPE19细胞GSHPx下降的能力（P＜0.01），但对丙烯醛造成的ARPE19细胞氧化损伤没有显示明显保护作用 (P＞0.05，见表1)。

3 讨论
ARPE19细胞是人类二倍体RPE细胞系，在体外能很好的表达RPE细胞的许多特性，因此在眼病研究中被广泛使用［5］。由于RPE细胞含有大量的光敏感物质，经常暴露于阳光下，尤其是每天需要吞噬含有大量不饱和脂肪酸的光感受器外段膜片，因此RPE细胞对氧化应激非常敏感。随着年龄增高，机体和RPE细胞抗氧化能力下降，与 RPE细胞氧化损伤有关的老年眼病发病率也逐年增高。
目前认为AMD发生机制的一个假设是氧化应激对RPE细胞造成的氧化损伤。有文献报道：不同氧化剂引起的RPE细胞损伤类型不同，因此不同的抗氧化剂也显示了对RPE细胞的不同保护能力［3］ 。本实验结果显示：50μM丙烯醛与ARPE19细胞作用24h，可以使细胞存活率和线粒体膜电位明显下降，细胞内ROS水平增高，SOD和GSHPx活性下降。预先在ARPE19细胞中加入100μM LA和300μM LA 48h能明显拮抗丙烯醛对细胞产生的氧化损伤作用，实验结果显示，LA的这种保护作用主要通过提高ARPE19细胞内SOD和GSHPx活性，降低ROS水平实现的。而预先加入110μM LA却没有这种保护作用，虽然110μM LA也能提高GSHPx活性，但对SOD活性没有明显的影响，因此，对丙烯醛引起的细胞内ROS水平增高也没有降低作用。提示：在丙烯醛引起的ARPE19细胞氧化损伤中SOD起重要作用，推测丙烯醛造成ARPE19细胞氧化损伤中以超氧阴离子（O2-）为主。

线粒体膜电位下降被认为是细胞凋亡的早期指标之一。本实验结果显示：50μM丙烯醛能引起ARPE-19细胞线粒体膜电位明显下降，细胞存活率明显降低，提示：丙烯醛造成细胞死亡可能是通过引起ARPE19细胞线粒体损伤进行的。线粒体是细胞中最容易受到氧化损伤的细胞器。许多研究表明，线粒体氧化损伤在衰老和与年龄有关的神经退行性疾病的发生和发展中起重要作用［7］。最近研究指出，与正常同龄人相比，AMD患者RPE细胞线粒体数量降低、体积减小、嵴丢失、基质密度下降、并且线粒体的这种改变伴随着明显RPE细胞内脂褐质增多［8］。体外试验指出，丢失线粒体功能的RPE细胞、可以使与脂质转运功能有关、与炎症和氧化应激有关的核基因表达上调，因此加速了脂褐质在RPE细胞内的堆积以及RPE细胞的氧化损伤［9］。由于RPE细胞内脂褐质堆积是AMD发生的早期病理现象之一，提示RPE细胞线粒体功能障碍在早期AMD发生中起重要作用。丙烯醛是烟草中主要氧化物质之一，大量流行病学调查表明，吸烟是导致AMD发生和进一步恶化的最主要危险因素［10］。通过本实验提示，与吸烟有关的AMD发生机制可能与吸烟造成RPE细胞线粒体氧化损伤有关。
LA是线粒体靶抗氧化剂和线粒体营养素［11］，本实验结果显示：LA在100μM -300μM范围内对ARPE19细胞存活率和线粒体膜电位均没有产生任何影响，但对丙烯醛造成的ARPE-19细胞氧化损伤却有明显的保护作用，也进一步表明RPE细胞线粒体氧化损伤可能在AMD发生中起重要作用。
参考文献
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