达能营养中心第九届学术研讨会论文集

摘要：目的观察摄入不同剂量硫辛酸对D半乳糖致过氧化损伤小鼠海马细胞DNA的影响。方法清洁级雌性昆明种小鼠按体重随机分为五组，除空白对照组外，其余四组用D-半乳糖颈背部皮下注射，，每日一次，连续6周，其中一组为模型组，余三组为硫辛酸干预组，经口给予不同浓度硫辛酸，空白组、模型组给予同体积溶剂，同时，模型对照组和硫辛酸干预组继续给予相同剂量的D-半乳糖颈背部皮下注射。连续8周。干预结束后，采用单细胞凝胶电泳法检测和评价各组小鼠海马细胞DNA损伤。结果模型组小鼠海马彗星细胞尾长、尾矩、Olive尾矩均最大，对照组的均最小，对照组和模型组比较有统计学意义（P＜0.05），干预组各指标均小于模型组（P＜0.05）,有统计学意义。
关键词：硫辛酸；小鼠；D-半乳糖；DNA损伤；单细胞凝胶电泳

1965年Harman提出衰老的自由基理论认为衰老是细胞成分积累性氧化损伤的结果，是由自由基反应引起的，自由基反应参与环境、疾病和遗传控制的衰老过程有关的衰老性改变。〔1］对机体有较好的抗氧化作用有数百种抗氧化剂，但是似乎只有五种是网络抗氧化剂：维生素C(VC)、维生素E(VE)、辅酶Q10(CoQ10)、硫辛酸(LP)和谷胱甘肽(GSH)。机体不能产生VC 和VE，必须从食物中获得。机体可以自行产生GSH、LP和CoQ10，但体内这些抗氧化剂的水平随着年龄的增长而下降。〔2］
硫辛酸天然存在于大多数原核、真核微生物及动植物体内，因此人群膳食中大多含有硫辛酸，其富含于高代谢率的动物组织如心、肝、肾，非动物性组织中含量高的有菠菜、甘蓝、西红柿、豌豆等。〔3］在体内硫辛酸是一种辅酶，和碳水化合物的氧化利用有关，是线粒体生产ATP过程中必不可少的，在线粒体内被降解为二氢硫辛酸，抗氧化功能更强大。〔4］
关于硫辛酸的研究内容目前已从能量代谢方面转向其抗氧化功能及在多种疾病中的防治作用。我国对硫辛酸的研究不多，本研究以单细胞凝胶电泳［5］为手段观察硫辛酸对D半乳糖致过氧化损伤小鼠海马神经元细胞DNA断裂修复的影响效应。为其在氧化损伤相关疾病中的应用提供科学依据。
1 材料与方法
11 仪器与主要试剂：DYY—III型电泳槽(北京市六一仪器厂)；DYY—11B型三恒电泳仪(北京市六一仪器厂)；BH—2型荧光显微镜(OLYMPUS)；数码相机(Nikon)，低熔点琼脂糖，正常熔点琼脂糖，溴化乙锭等（Sigma），其余均为优级纯。
12 实验方法
121 实验动物及处理：18-22克清洁级雌性昆明种小鼠50只（购于福建医科大学动物实验中心）按体重随机分为五组，除空白对照组外，其余四组用D半乳糖100mg／kg BW颈背部皮下注射，注射量为0.1ml／10g，每日一次，连续6周，其中一组为模型组，余三组为硫辛酸干预组，经口给予不同浓度硫辛酸（50mg／kg BW 100mg／kg BW 200mg／kg BW），空白组、模型组给予同体积溶剂(市售菜子油,经高温及无水乙醇处理 0.05ml／10gBW)，同时，模型对照组和硫辛酸干预组继续给予相同剂量的D半乳糖颈背部皮下注射。连续8周。
122 单细胞悬液的制备：小鼠最后一次处理后禁食24小时，然后脱颈处死，于冰台上取脑之后立即剥离海马，用预冷生理盐水小心洗去浮血，和预冷的PBS缓冲液（1ml）混合用匀浆器轻轻将组织磨碎制得海马细胞悬液，立即与预温37℃的0.7％。低熔点琼脂糖以1：1例混匀。
123 制胶片：分作2层．第l层为正常熔点琼脂糖层，取自制微电泳槽，将预热45℃的0.8％正常熔点琼脂糖的PBS滴在槽内，每槽0.1ml，放入4℃冰箱固化15分钟后取出，将0.1ml含细胞的低熔点琼脂糖均匀滴在槽内即制好第二层，再放入4℃冰箱固化15分钟。
124 细胞裂解：微电泳槽从冰箱取出后水平浸入当天配制的4℃细胞裂解液中1h。
125 DNA碱解旋：微电泳槽取出，置于水平电泳槽中,新配制的碱性电泳缓冲液覆盖玻片，放置20分钟。
126 电泳：电压25V，电流300mA,电泳20分钟。
127 中和：电泳结束后取出放入干净平皿，缓缓加入HCl(PH7．5)缓冲液，将，将微电泳槽淹没15分钟，冰箱保存，中和两次。
128 脱水：吸去中和液，缓缓加入无水乙醇，将微电泳槽淹没10分钟，取出，放干燥处过夜，第二天收起保存［6］。
129 染色与观察：在胶面上滴2—3滴EB水溶液，10分钟后，用双蒸水浸泡漂洗掉胶面上的EB染液，每个样本随机选择30个彗星细胞拍照。
13 图像分析：用CASP软件［7］逐个分析细胞，取尾长、尾矩（从彗星头的右边界到彗星尾部末端的距离与尾部DNA含量的乘积、Olive尾矩（从头光密度重心到尾光密度重心的距离与尾部DNA含量的乘积）这三个指标进行统计分析。
14 统计学处理：用SPSS11-5软件进行方差分析。
2 结果
21 各组小鼠海马彗星细胞各指标平均值见下表，可见模型组小鼠海马彗星细胞尾长、尾矩、Olive尾矩均最大，对照组的均最小，对照组和模型组比较有统计学意义（P＜0.05），干预组各指标均小于模型组（P＜0.05）,有统计学意义。
22 各组彗星细胞图像：

3讨论
适当浓度的自由基在信号传导途径中扮演着重要角色，高浓度的自由基及其衍生物对机体有很大的危害性，它们损伤所有的细胞组分，对蛋白质，核酸，脂质等大分子进行氧化攻击，已证实过度的自由基牵涉到如下疾病的致病机理：癌症、糖尿病、动脉粥样硬化、神经退行性疾病、风湿性关节炎、缺血再灌注损伤、阻塞性睡眠呼吸暂停等。上述疾病多是老年慢性相关疾病，Harman认为衰老的机制至少有部分是有自由基引起的［1］。

随着年龄的增加，线粒体功能衰退，细胞呼吸过程产生的自由基增多，对线粒体本身及细胞的破坏加剧。同时，机体的抗氧化系统效率降低，进一步导致能量代谢障碍和氧化损伤。所有老年性机体有必要补充抗氧化剂以增加内源性抗氧化剂效率，阻止自由形成或猝灭自由基。
D半乳糖致小鼠过氧化损伤可能是通过羰氨反应,形成交联产物,通过羰基毒化机制致使小鼠体内蛋白质功能丧失,进而引起一系列的病理改变。交联产物进一步降解可生成丙二醛等不饱和醛酮中间产物,因而小鼠各主要脏器细胞质或线粒体丙二醛浓度升高［8］。本研究用D半乳糖成功的造成了小鼠海马细胞过氧化损伤（对照组和模型组比较个指标均有统计学意义），三个干预组和模型组比较各指标均有统计学意义，证实硫辛酸是一种有效的抗氧化剂，能对小鼠海马细胞DNA损伤进行修复，参照国内外研究，结合本次研究结果，笔者推测硫辛酸的抗氧化机制有以下几方面：1直接发挥抗氧化作用；2再生其它抗氧化剂如维生素C，谷胱甘肽，辅酶Q10等［9－10］；3鳌合铜铁等金属离子［11］；4增加葡萄糖吸收利用率，增强胰岛素敏感性［12］；5修饰氧化蛋白等［3］。
机体的肝脏和其它组织可合成硫辛酸，在某些疾病如糖尿病，人体内硫新酸含量比正常人少［13］，但其它病理状态下的机体体内硫辛酸的变化情况尚不清楚，硫辛酸是否可以用于一切氧化损伤相干疾病还需要大量的科学研究来证明。
参考文献
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