达能营养中心第九届学术研讨会论文集

摘要：目的探讨糖尿病小鼠肝组织氧化损伤。方法给雄性昆明种小鼠喂养高脂饮食一周后随机分成两组，正常对照组和糖尿病组，其中一组经小剂量链脲佐菌素(STZ)注射后诱导成糖尿病小鼠，继续喂养高脂饮食，6周后测量两组小鼠末期肝组织中脂质过氧化物丙二醛（MDA），谷胱甘肽（GSH），抗氧化酶（SOD，GSHPx, CAT）以及肝脏组织一氧化氮（NO），一氧化氮合酶（NOS）、肝脏脏器系数及组织形态学观察。结果试验结束时，糖尿病组小鼠一般情况较差，体重，肝脏脏器系数与正常组比较，显著低于正常组（P＜001）；糖尿病组小鼠肝脏组织中MDA、GSHPX、NO显著高于正常组（P＜005或P＜001）, GSH，CAT，NOS显著低于正常组（均P＜001），SOD与正常组没有明显差异。光镜下糖尿病组肝脏表现：部分细胞水肿、空泡样变，脂肪滴增大融合。结论本研究表明糖尿病小鼠肝脏存在氧化损伤。
关键词：糖尿病；氧化损伤；肝脏；小鼠

A study of liver oxidative injury in diabetic mice
JiaoShirong12  WangBo1HuangChengyu1YuShuang1YinWenya1
(1School of public health,Sichuan university,Chengdu 610041,China;
2School of Bioengineering of Xihua University，Chengdu 610039, China；

Abstract: ObjectiveTo observe the relation between liver oxidative injury of mice and diabetes mellitus. MethodsMale kunming mice were feed high fat dietary in a week and divided into 2 groups at random by weight. One of two groups was induced by small dose streptozotocin(STZ).Two groups were feed high fat dietary. After 6 weeks, we measured the activities of enzymic antioxidants (superoxide dismutase (SOD), catalase(CAT) , glutathione peroxidase (GPx) ,nitric oxide synthase (NOS),the levels of glutathione(GSH), maleic dialdehyde(MDA), nitric oxide (NO) in the liver, the liver viscera quotiety and the observingof livers histological. ResultsBody weight ,liver viscera quotiety and the activities of CAT,NOS,GSH decreased significantly(all P<0.01), the levels of MDA , GHSPX and NO increased remarkably (P<001or(P<005 ), SOD had no difference in diabetic group compared with the normal group(P>005). The liver histological damages were observed in DM group, light microscope observation showed hepatocytes swelling , punctuate necrosis and fatty droplets in hepatocytes were larger and cyncretized. Conclusions There may be oxidative injury in the liver of diabetic mice.
Keywords: Diabetes Mellitus; Oxidative Injury; Liver Tissue; mice.

肝脏是糖、脂肪代谢的主要脏器，也是摄取、储存、合成葡萄糖和代谢的主要场所。持续的高血糖，不仅引起肾脏、心脏、视网膜和神经病变等糖尿病慢性并发症，也累及肝脏［1］，糖尿病性肝脏损害主要表现为肝内脂肪浸润致脂肪肝(Fatty liver，FL)，部分可发展为脂肪性肝炎、肝纤维化甚至肝硬化。近年来氧化防御机能的异常在糖尿病并发症的作用日益受到重视，氧化应激带来的脏器损伤可能是糖尿病多种并发症发病机制的共同通道［2］。关于糖尿病小鼠肝脏氧化防御机能及NO、NOS的变化，是否与肝脏组织的损伤有关系，少有报道。本试验研究了链脲佐菌素（STZ）诱发的糖尿病小鼠肝脏组织中丙二醛（MDA），谷胱甘肽（GSH），抗氧化酶（SOD，GSHPx，CAT）、一氧化氮（NO），一氧化氮合酶（NOS）,肝脏组织的脏器系数变化及形态学改变，为探讨糖尿病小鼠肝脏氧化损伤状况，预防控制糖尿病提供依据。
1 材料与方法
11 材料
111 实验动物屏障级昆明小鼠体重20~25g雄鼠26只，由四川省医科院动物所提供（合格证号：医动字第24101106号）。整个实验过程中均在有IVCS（Individual Ventilated Cage System）动物房喂养，两组小鼠自由进食高脂饲料和饮水，室温20~24℃，湿度60%~70%，12h／12h明暗周期。
112 试剂与仪器链脲佐菌素（德国merk公司 ），MDA、NO、GSH水平、SOD、GSHPx、CAT、NOS活性测定、组织蛋白含量的测定，均采用南京建成生物研究所提供的试剂盒。血糖试纸（GLUCOCARDTMTest StripⅡ，批号77502，日本京都）、血糖仪（日本京都）、722紫外可见光栅分光光度计、恒温水浴锅、低温低速离心机、普通低速离心机、ME100光学显微镜。
12 方法
121 动物模型的建立
雄性昆明小鼠，高脂饲料（由常规饲料加10%猪油配制而成）适应性饲养1周后，按体重随机分成2组，其中正常对照组（NC组）10只，糖尿病组(DM)16只，DM组按体重腹腔注射链脲佐菌素(STZ)，72小时后再加强注射1次，每次80mg／kg，NC组注射等量的柠檬酸缓冲液。加强注射后的第4天，测空腹血糖（FBG），以禁食3~5h，尾静脉全血血糖≥111mmol／L［3］为糖尿病模型成功动物。
122 观察指标及测定方法
试验过程中每周称体重，血糖水平用葡萄糖试纸检测。在第6周末，称重，处死动物，取肝脏称重。取少量肝组织，加冷生理盐水，在冰浴条件下，制成10%的组织匀浆，低温低速离心，取上清液，T SOD为黄嘌呤氧化酶法、CAT采用紫外分光光度法、GSHPX和GSH为二硫代二硝基苯甲酸比色法、NO和NOS为硝酸还原酶比色法、MDA含量用硫代巴比妥酸(TBA)缩合法测定、组织蛋白含量测定为考马斯亮兰法。具体测定方法按照试剂盒要求进行。
123 组织学检查
留取肝脏标本，甲醛固定，常规石蜡包埋、切片、HE染色。
13 统计分析
实验数据以±s表示，应用SPSS 115统计软件进行成组Ｔ检验分析，确定两组数据有无差异。
2 实验结果
21 动物的一般情况
试验过程中，正常对照组生长情况良好，而糖尿病组动物出现食量增加，饮水增加，尿量增多，活动减少，精神稍委靡，被毛蓬松无光泽。
22 血糖情况、体重影响及脏器系数比较
喂养末期，糖尿病组小鼠血糖显著高于正常对照组（P＜001）。 两组小鼠初始体重差异没有统计学意义（P＞005），糖尿病组小鼠第6周实验结束时体重显著低于对照组（P＜001），提示糖尿病对小鼠生长可能有抑制作用。试验末，处死动物，测定肝脏脏器系数（肝脏重量／小鼠体重），糖尿病组显著高于对照组（P＜001），可能是由于糖尿病小鼠高血糖导致产生应激，肝脏代偿性增大。见表1。

23 糖尿病小鼠氧化应激状况
测定各氧化应激指标，糖尿病组肝脏组织中MDA，GSHPX，NO显著高于正常组（P＜005或P＜001）。GSH，CAT，NOS显著低于正常组（均P＜001）, SOD与正常组没有差异（P＞005）。结果见表2。

24 肝脏组织学检查
正常组小鼠肝组织光镜下显示，肝小叶结构正常，肝窦规则，肝细胞索排列整齐，见图1。糖尿病小鼠部分肝细胞水肿、核固缩、胞浆空亮，核消失，空泡样变，脂肪滴增大融合，说明糖尿病小鼠肝细胞存在损伤，见图2。

图1正常小鼠肝组织形态20×10倍

图2糖尿病小鼠肝组织形态20×10倍
a: 细胞水肿、核固缩；b:脂肪滴增大融合
3 讨论
机体的调节机制会使体内处于相对自稳态，但是当内源性和外源性刺激使机体代谢异常而骤然产生大量自由基（包括氧自由基，一氧化氮），过量的自由基数量超过抗氧化体系的还原能力，会使机体处于氧化应激状态，结果导致机体的损伤。研究表明随着自由基增加，细胞毒性也逐渐增加［4］。同时自由基和脂肪物质反应，引起脂质过氧化，增加脂质过氧化产物［5］。丙二醛（MDA）是最常见的脂质过氧化产物，MDA的量可以衡量脂质过氧化的程度，间接反映引起脂质过氧化的活性氧水平（reactive oxygen species，ROS），ROS与MDA总体上均可以反映组织承受的氧化侵袭程度［6］。由本研究结果可知，糖尿病组小鼠肝脏中MDA含量显著增加，表明糖尿病小鼠肝脏脂质过氧化增多。
SOD主要作用在于清除超氧阴离子O2-。本实验中SOD活性与正常组没有差异，还稍有增加。与Ceriello等研究相符，即高浓度的葡萄糖能诱导抗氧化性酶，包括SOD的增加［7］，研究也发现生物体合成SOD常受到O2-浓度的影响，如生物体内O2-浓度高于正常水平，在O2-的诱导下，SOD的生物合成能力增强［8］。
CAT主要作用是清除组织中H2O2。实验结束时糖尿病小鼠肝脏组织中CAT活性显著下降，与文献［ 9,10］一致。这可能是由于O2-对CAT活性有抑制作用［11］。
GSHPX除了可以降低H2O2水平之外，还可以清除脂质过氧化产物如MDA。本实验糖尿病组GSHPX显著高于正常组，原因可能是CAT与GSHPX有协同清除H2O2的作用，由于CAT活性降低，GSHPX活性代偿性升高，此研究结果与文献［12-14］报道一致，但文献［15］报道GSHPX活性显著降低。
除抗氧化性的酶外，GSH提供了抵抗ROS的第一道防线，除能清除自由基及降低H2O2水平，还能修复由自由基引起的生物学损伤［16］。当细胞GSH含量降低到一定程度时，细胞会受到不可逆损伤。因此测定GSH的含量，了解GSH动态平衡，是反映细胞状态的一个标志。在本研究中, 糖尿病组小鼠肝脏GSH水平下降，可能是由于持续高血糖的氧化应激产物ROS或由于NADPH 损耗所引起，同时GSH由于去除H2O2而被消耗减少［17］。
高血糖是导致氧自由基的产生重要原因之一，氧自由基增多能刺激NO的生物合成，过量的NO扩散到细胞后造成细胞损伤而成为一种细胞毒分子。NO与O2-都是自由基，两者生成ONOO及其质子化产物ONOOH，其化学性质类似 ·OH。ONOO可以氧化GSH成为GSSG，还可引发脂质过氧化，氧化蛋白质及羟化作用，显示活性氧特征［18］。动物体内NO生物合成的唯一途径是NO合酶（NOS）的酶促反应。作为产生内源性NO的催化酶，NOS具有的血红素与酶活性有关。如果NO与NOS的血红素结合，则会反馈抑制NOS活性［19］［20］。NO可与氧化氢酶中Fe(Ⅲ)结合为Fe(Ⅲ)NO，使过氧化氢酶活性受到抑制［21］。本实验中糖尿病小鼠肝脏中NO含量显著高于正常组，而NOS和CAT活性降低，MDA显著增加，说明糖尿病小鼠肝脏中可能在高糖的作用下可能产生了大量NO和O2-自由基，反馈抑制了NOS和CAT的活性，减少GSH含量，同时引发脂质过氧化，使MDA增加而引起肝细胞损伤。
本研究提示糖尿病小鼠肝脏内氧化、抗氧化平衡严重失调，氧自由基反应、氧化、过氧化及脂质过氧化反应加剧，引起糖尿病小鼠肝脏氧化损伤，糖尿病组肝细胞形态改变也证明了这一点。
参考文献
［1］ Stone BG，Van Thiel DH. Diabetes mellitus and the liver. Sem liver Dis. 1985.l(1): 8-28.
［2］ Baynes J W. Perspectives in diabetes, role of oxidative stress in development of complication.sindiabetes. Diabetes.1991.40(4):405-412.
［3］杨润军,李青旺,赵 蕊. 四氧嘧啶与链脲佐菌素诱导小鼠糖尿病模型的效果比较.西北农林科技大学学报. 2006.32(2):17-19.
［4］ NouroozZedeh Rahini A, TajaddiniSarmadi J, et al. Relationships between plasma measures of oxidative stress and metabolic control in NIDDM. Diabetologia.1997.40: 647-653.
［5］ Girotti, M.W. Mechanisms of lipid peroxidation. Free Radical Biology and Medicine.1985.1: 87-95.
［6］ Scott BC, Butler J, Hal1iwel1 B, et a1. Evaluation of the antioxidant action of feruliCacid and catechins.Free Raidc Res Co~un.1993.19：241-253.
［7］ Ceriello A, Quatraro A, Giugliano D. Diabetes and hypertension: the possible role of hyperglycaemia through oxidative stress. Diabetologia.1993.36: 265-266.
［8］ Kakkar R, Mantha S.V, Radhi J, et al. Increased oxidative stress in rat liver and pancreas during progression of streptozotocin induced diabetes. Clinical Science.1998.94: 623-632.
［9］Tagami.S, Kondo T, Yoshida J H, et al. Effect of insulin on impaired antioxidant activities in aortic endothelial cells from diabetes rabbits.Metabolism.1992.41(10):1053-1058.
［10］Tuzun S, Girgin F K, Sozmen E Y, et al. Antioxidant status in experimental type 2 diabetes mellitus: effect of glibenclamide and glipizide on various rat tissues. Experimental and Toxicologic Pathology.1999.51:436-441.
［11］ Kono Y, Fridovich I. Inhibition and reactivation of catalase. BiolChem.1983.258(22):13646-8.
［12］ M Naziroglu, M Cay. Protective role of intraperitoneally administered Vitamin E and selenium on the antioxidative defense mechanisms in rats with diabetes induced by streptozotocin. Biol. Trace Elem. Res. 2001.79: 149-159.
［13］ M Cay, M Naziroglu, H Simsek, et al. Effect of intraperitoneally dministered Vitamin C on antioxidative defense mechanism in rats with diabetes induced by streptozotocin.Res. Exp. Med. 2001.200:205-213.
［14］ R.K. Sindhu, J.R. Koo, C.K. Roberts, et al. Vaziri, Dysregulation of hepatic superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase in diabetes: response to insulin and antioxidant therapies. Clin. Exp. Hypertens. 2004. 26:43-53.
［15］ Anna Gumieniczek. Effects of repaglinide on oxidative stress in tissues of diabetic rabbits. Diabetes Research and Clinical Practice .2005.68:89-95.
［16］ Yoshida K, Hirokawa J, Tagami S. Weakened cellular scavenging activity against oxidative stress in diabetes mellitus: regulation of glutathione synthesis and efflux. Diabetologia.1995.38:201-210.
［17］ P Yadav, S Sarkar, D Bhatnagar. Action of Capparis deciduas against alloxaninduced oxidative stress and diabetes in rat tissues. Pharmacol. Res. 1997.36:221-228.
［18］方允中,郑荣梁,主编.自由基生物学的理论与应用.北京:科学出版社.2002.53-54.
［19］AbuSoud HM, Wang J, Rosseau DL,et al, Neuronal nitric oxide synthase selfinactivates by forming a ferrousnitrosyl complex during aerobic catalysis.J Biol Chem.1995.270:22997-23006.
［20］ AbuSoud HM, Rosseau DL,Stuehr DJ. Nitric oxide binding to heme of neuronal nitricoxide synthase links its activity to changes in oxygen tension. J Biol Chem.1996.271:32515-32518.
［21］Li Y,Severn A,Rogers MV,et al. Catalase inhibits nitric oxide synthesis and killing of intracellular Leishmania majar in murine macrophage.Eur J Immunol.1992.22:441-446.