达能营养中心第九届学术研讨会论文集

摘要：目的研究植物雌激素大豆异黄酮抑制去卵巢大鼠体重增加的作用，并从基因表达水平探讨其可能的机制。方法利用高脂肪饲料喂养的去卵巢大鼠作为绝经后肥胖模型，给予不同剂量的大豆异黄酮，观察试验期间体重的增加，并用RTPCR方法检测脂肪组织中脂代谢相关基因表达。结果研究发现大豆异黄酮对高脂肪饲料喂养的去卵巢大鼠体重增加有显著的抑制作用；大豆异黄酮显著降低大鼠全身脂肪和腹部脂肪含量，并显著降低血清总胆固醇含量；大豆异黄酮抑制白色脂肪中FAS基因表达，对褐色脂肪中的Pparγ基因表达也有明显的抑制作用。高剂量大豆异黄酮可激活褐色脂肪中Pparα基因表达，但低剂量的大豆异黄酮抑制Pparα基因表达。结论植物雌激素——大豆异黄酮可抑制高脂肪饲料喂养的去卵巢大鼠体重增加，并通过调节脂肪组织中脂代谢相关基因表达，抑制大鼠的血胆固醇水平增加及降低体内脂肪含量。
关键词：大豆异黄酮；去卵巢大鼠；体重增加；脂代谢相关基因；RTPCR

人口老龄化是当今世界人口发展的趋势，我国是世界上老年人口最多的国家。由于老年人群中妇女所占的比例超过男性，因此老年妇女的保健有其特殊的重要性［1］。绝经后妇女体内雌激素水平下降，体内脂代谢发生紊乱，脂肪重新分布，并引起体重增加。而体重的增加与许多疾病如高血压、冠心病等心脑血管疾病以及糖尿病的发生有密切关系，是这些疾病的重要危险因素。
近年来植物雌激素——大豆异黄酮（soybean isoflavone）引起研究人员的广泛关注。已有的研究结果表明大豆异黄酮可预防绝经妇女骨质疏松症的发生、减轻妇女更年期综合征的症状，具有降血脂、预防动脉粥样硬化以及预防和抑制乳腺癌、结肠癌等肿瘤生长的作用，其生物学活性研究已成为热点研究课题［2］。本研究在以往研究工作的基础上，利用高脂肪饲料喂养的去卵巢大鼠模拟绝经后肥胖，进行大豆异黄酮抑制体重增加的作用效果研究，并从基因表达水平探讨其可能的作用机制。
1 实验材料与方法
11 试剂及仪器
受试样品(大豆异黄酮)：日本Fujico公司提供的40%大豆异黄酮
mRNA提取试剂盒、cDNA试剂盒、RTPCR试剂盒：TaKaRa Bio.公司
无水乙醇、氯仿、DEPC水
RTPCR仪：Applied Biosystems Ltd ABI PRISMR 7000
血脂检测试剂盒
12 动物实验
2月龄雌性SD大鼠购回后，在SPF动物室用普通饲料喂养1周，根据体重随机分为5组。用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（50mg／kg·bw）后，手术切除双侧卵巢或假手术。各组给予高脂肪饲料，异黄酮剂量组添加不同剂量的大豆异黄酮。
实验期间每日定量喂食，每周称量体重一次，记录给食量、摄食量和撒食量，饮用水量不限。动物室温度20℃±2℃，12小时光照，12小时黑暗，通风良好。
13 饲料配方
按照美国实验动物营养饮食配方AIN93M进行配制，但对脂肪含量进行调整。
14 样品的采集及检测
实验结束时，将大鼠用戊巴比妥钠麻醉后， DEXA骨密度仪扫描测定全身及腹部脂肪含量。心脏采血，离心后分离血清用于血脂指标测定。大鼠解剖后取少量白色脂肪、褐色脂肪用液氮冷冻，然后转移到80℃冰箱中保存，用于基因检测。
15 脂肪组织脂代谢相关基因的检测
将脂肪样品用试剂盒提取mRNA，经逆转录反应生成cDNA，用ABI公司的7000型RTPCR仪检测。
检测基因包括：
脂肪酸合成酶(FAS)
激素敏感性脂肪酶（HSL）
过氧化物酶体增生物激活受体α(PPAR α )
过氧化物酶体增生物激活受体γ(PPARγ)
RTPCR扩增条件：
FAS：95℃ 10s；95℃、5s，65℃、31s；32个循环。
HSL：95℃ 10s；95℃、5s，65℃、31s；35个循环。
PPAR α：95℃ 10s；95℃、5s，67℃、31s；35个循环。
PPARγ：95℃ 10s；95℃、5s，67℃、31s；35个循环。
相同条件下测定GAPDH基因表达。
16 数据的统计学处理：
所有数据用SPSS 130统计软件进行分析处理。数据以均数±标准差（X±S）表示，组间差异采用方差分析进行处理。
2 实验结果
21 实验期间大鼠体重的变化
实验过程中每周称量大鼠体重一次，结果见图1（表格中的Sham, Ovx, LSI, MSI, HSI分别为假手术对照组、去卵巢对照组、去卵巢+低剂量大豆异黄酮组、去卵巢+中剂量大豆异黄酮组和去卵巢+高剂量大豆异黄酮组）。

Fig 1The rat's body weights during experiment

由图1可以看出，实验前，各组大鼠的平均体重没有显著性差异。从第二周开始，Ovx组大鼠体重显著增加（P＜005），此后，这一差异保持到实验结束。大豆异黄酮各组大鼠体重与Sham组相近，说明大豆异黄酮对去卵巢诱导的大鼠体重增加有显著的抑制作用，但标准差较大，显示大鼠对大豆异黄酮弱雌激素作用的敏感性不同。
22 大豆异黄酮对大鼠脂肪含量及血脂指标的影响
221 全身脂肪和腹部脂肪百分含量
实验结束后，利用双能X射线骨密度测定仪对大鼠进行全身扫描，测定体脂肪及第二至第七腰椎对应的腹部脂肪含量，结果见表1。

从表1可以看出，给予大豆异黄酮各组大鼠的全身脂肪和第二至第七腰椎对应的腹部脂肪含量百分比显著低于Ovx组，表明大豆异黄酮对去卵巢和高脂饲料诱导的体内脂肪含量、尤其是腹部脂肪含量增加具有显著的抑制作用。
222 血脂指标
实验结束时，分离血清，测定血脂指标TC、TG、HDL，结果见表2。

根据表2中的数据可知，与去卵巢对照组相比，给予大豆异黄酮后，血清中总胆固醇(TC)含量显著降低(P＜001)；各组TG、HDL没有显著变化。
23 大豆异黄酮对脂肪组织脂代谢相关基因表达的影响用RTPCR方法分别检测白色脂肪和褐色脂肪中脂肪酸合成酶（FAS)、激素敏感性脂肪酶（HSL）、过氧化物酶体增生物激活受体α和 γ（PPARα和PPARγ)的基因表达，结果见图2、图3和图4。

Fig 2Effect of isoflavone treatments on FAS mRNA expression in white adipose tissue(A), brown adipose tissue(B) Animal groups were Sham operated control (Sham), ovariectomized control (Ovx), ovariectomized and treated with different isoflavone (LISO, MISO and HISO)

从图2可以看出，大鼠去除卵巢后，脂肪组织中FAS基因表达下降，大豆异黄酮对白色脂肪FAS的基因表达有一定抑制作用，但本研究没有看到剂量效应关系。
图3显示，大鼠去卵巢后，白色脂肪组织HSL表达增加，而褐色脂肪中HSL表达下降。与Ovx组相比，高剂量大豆异黄酮对HSL基因表达有一定的抑制作用。
图4的结果表明，与Ovx对照组相比，不同剂量大豆异黄酮对PPARα, PPARγ的表达影响不同。低、中剂量的大豆异黄酮对Pparα和PPARγ基因表达有一定的抑制作用。高剂量的大豆异黄酮对褐色脂肪中的Pparα基因表达有显著的促进作用，但抑制PPARγ基因的表达。

Fig 3Effect of isoflavone treatments on HSL mRNA expression in white adipose tissue(A), brown adipose tissue(B) Animal groups were Sham operated control (Sham), ovariectomized control (Ovx), ovariectomized and treated with different isoflavone (LISO, MISO and HISO)

Fig 4Effect of isoflavone treatments on PPARα, PPARγ mRNA expression in white adipose tissue(A), brown adipose tissue(B) Animal groups were Sham operated control (Sham), ovariectomized control (Ovx), ovariectomized and treated with different isoflavone (LISO, MISO and HISO).
3 讨论
肥胖主要表现为机体脂肪组织的量过多或脂肪组织与其它软组织的比例过高。体重是衡量肥胖程度的重要指标之一，因为肥胖常表现为体重超过标准体重。本研究的实验结果发现，高脂肪饲料喂养的去卵巢大鼠，从第二周开始，Ovx组体重显著增加（P＜005），此后，这一差异保持到实验结束，表明肥胖模型诱导成功。大豆异黄酮各组大鼠体重与Sham组相近，说明大豆异黄酮对去卵巢和高脂饲料诱导的大鼠体重增加有显著的抑制作用，但标准差较大，显示大鼠对大豆异黄酮弱雌激素作用的敏感性不同。利用双能X射线骨密度仪对大鼠进行全身脂肪的扫描，发现大豆异黄酮具有显著降低大鼠全身脂肪的作用，尤其是显著降低第二至第七腰椎对应的腹部脂肪含量。血脂指标检测结果表明大豆异黄酮对血清总胆固醇含量有显著抑制作用。
机体内有两种形式的脂肪组织——白色脂肪组织和褐色脂肪组织。白色脂肪组织存在于整个机体，主要作为能量储存的场所。褐色脂肪组织主要参与热调节，位于机体的有限的部位。动物和人体实验均证明雌激素在白色脂肪组织调节中起着重要的作用。啮齿动物切除卵巢后，白色脂肪组织增加，雌激素治疗后白色脂肪组织减少。绝经后妇女体内白色脂肪组织增加，雌激素替代治疗后则减少。因此，本研究对大鼠肝脏、白色脂肪和褐色脂肪中一些脂代谢相关基因进行检测。
脂肪酸合成酶在动物体脂生成和沉积中发挥重要作用，动物脂肪组织中脂肪酸合成酶的活性与机体脂肪量呈显著正相关。有研究表明，FAS基因表达受抑可导致小鼠体脂肪含量迅速降低，说明FAS在调节体内能量平衡中发挥重要作用［3］。本研究结果显示，在白色脂肪和褐色脂肪中，Ovx对照组与Sham组相比，FAS基因的表达并没有因肥胖而增加，反而下降。研究发现，摄食和胰岛素可刺激FAS基因表达；饥饿、甲状腺素、cAMP和多不饱和脂肪酸可抑制其表达。因此，我们分析其原因可能是由于控制了Ovx对照组大鼠的摄食，造成大鼠长期处于饥饿状态，引起FAS基因表达的反馈性下降。给予大豆异黄酮后，对去卵巢大鼠白色脂肪中脂肪酸合成酶（FAS）的基因表达有显著抑制作用，这种作用不是由摄食造成的。
肥胖与体内脂肪的堆积密切相关，而脂肪堆积是一个复杂的过程，受饮食、内分泌、神经等多方面的调控。机体内脂肪代谢处于一个动态平衡中，体内脂肪的积累受甘油三酯合成和分解代谢速度的双重调节。动物将脂肪酸以甘油三酯的形式贮存在脂肪组织内。一旦机体需要时，脂肪酶即可将甘油三酯水解为游离脂肪酸和甘油并释放入血以供其他组织氧化利用，这一过程称为脂肪动员，调节这一过程的关键酶为激素敏感性脂肪酶。本研究用RTPCR测定了大鼠肝脏中激素敏感脂肪酶mRNA的表达，结果发现，大鼠去卵巢后，白色脂肪组织HSL表达增加，而褐色脂肪中HSL表达下降。与Ovx组相比，高剂量大豆异黄酮对HSL基因表达有一定的抑制作用。
过氧化物酶体增生物激活受体(PPARs)属于核内激素受体超家族，有α, β, γ三种亚型。PPAR对脂质代谢、糖类代谢、细胞生长分化及凋亡有重要影响。PPARα主要与肝内脂类代谢，可诱导肝脏脂代谢相关基因的转录，增强肝脏脂肪酸β氧化相关酶的活性，减少TG合成和向外输出，引起外周组织向肝脏的脂肪酸流量增加，降低血脂。PPARγ主要与脂肪平衡、诱导脂肪细胞分化及胰岛素有关,是诱导脂肪细胞分化的特异性转录因子。PPARγ的激活有助于脂肪细胞的分化，并促进非脂肪细胞分化成脂肪细胞。PPARγ通过调节相关基因的表达，在脂肪形成、糖、脂代谢、能量代谢，以及在免疫系统中发挥重要的调节作用。研究发现，大豆异黄酮可激活大鼠白色脂肪组织PPARα和PPARγ基因表达，促进脂肪分解［4］；流行病学调查显示绝经后妇女高膳食异黄酮的摄入与其较低的BMI相关［5］。从本研究的实验结果可以看出，低、中剂量的大豆异黄酮对脂肪组织Pparα和PPARγ基因表达有一定的抑制作用。高剂量的大豆异黄酮对褐色脂肪中的Pparα基因表达有显著的促进作用，但抑制PPARγ基因的表达。
现代医学研究证明，妇女进入更年期后，由于卵巢功能逐步衰退、雌激素分泌降低，引起更年期综合征的发生，以及血脂代谢和糖代谢紊乱、骨量丢失加快等，导致绝经妇女体内体内脂肪分布发生明显改变。绝经妇女患高血脂、高血压、动脉粥样硬化等心脑血管疾病以及糖尿病、骨质疏松症的危险性提高。而这一变化过程是一个缓慢和循序渐进的过程，很多人没有意识到它的发生，也没有多加注意和预防。一旦出现疾病症状，再进行预防已为时过晚，因此有必要采取措施延缓这一过程的发生。近年来，动物和人体的一些新的研究结果发现摄入或补充富含植物雌激素的食品对预防糖尿病和肥胖的发生具有一定的作用，因此大豆异黄酮降脂、预防肥胖和糖尿病的作用研究已成为植物雌激素研究领域的新热点［69］。
参考文献
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