达能营养中心第九届学术研讨会论文集

摘要：目的探讨苯并(a)芘（B(a)P）对肝细胞DNA损伤作用及牛磺酸（Tau）的干预效果。方法以健康人胚肝细胞（L-02细胞）为靶细胞，采用完全随机实验设计，分为4组：①空白及溶剂对照组；②B(a)P组：25、50μM的B(a)P加入细胞培养体系后培养2h；③Tau组：设05、10、20、40mM四个浓度，加入培养体系后培养24h；④Tau预防组：先分别以四个不同浓度的Tau预处理24h，再加入25μM的B(a)P，培养2h。各组培养结束后收集细胞用单细胞凝胶电泳技术检测细胞DNA损伤。收集培养上清液测定丙二醛（MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）、天门冬酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)含量。结果（1）B(a)P能引起L-02细胞明显的DNA损伤，与对照组相比差异显著，同时可使细胞培养上清液中MDA、ALT、AST含量升高、GSH含量降低；（2）Tau预处理能明显减轻B(a)P引起的肝细胞DNA损伤，抑制B(a)P引起的MDA、AST、ALT含量升高和GSH含量下降，其作用随Tau剂量增加而增加；（3）肝细胞DNA损伤的Oliver尾矩值与培养上清液中MDA、AST、ALT含量呈明显正相关，与GSH含量呈明显负相关。结论B(a)P可诱导健康人胚肝细胞DNA损伤，使MDA、AST、ALT水平升高、GSH含量降低。Tau可拮抗上述B(a)P的细胞毒性。提示B(a)P诱导L-02细胞的氧化损伤可能在细胞DNA损伤作用中起重要作用，而Tau具有抗B(a)P氧化损伤的作用。
关键词：牛磺酸；苯并(a)芘；健康人胚肝细胞；肝细胞毒性；DNA损伤；单细胞凝胶电泳

牛磺酸（taurine，Tau）是人体内含量较高的一种条件氨基酸，研究表明，Tau具有多种生物学功能，如调节细胞内外钙稳态、稳定细胞膜、抗氧化、抑制肿瘤细胞增殖及胶原形成、对外源化合物的解毒作用等，这些作用还可相互关联，如通过调节细胞内外钙稳态，发挥抗氧化作用，继而保护细胞膜的完整。已知肝细胞损伤的发生与肝脏内自由基或脂质过氧化物的作用有密切关系，自由基可产生反应活性氧（ROS），ROS可对细胞脂质、蛋白质、氨基酸、DNA等多种成分造成损害。研究发现，Tau通过抗氧化作用可拮抗醋氨酚、环孢霉素A等多种毒物引起的肝细胞损害［1，2］。苯并(a)芘（B(a)P）是广泛存在于人类食品中的一种化学污染物，如某些行业排放的“三废”中含有大量的B(a)P，造成环境和空气污染，通过“食物链”的生物富集作用而污染食物；食物在烘烤或熏制过程中，会受到燃烧产物中B(a)P的污染；食物成分（尤其是脂肪）在高温下可产生B(a)P等。尽管已知B(a)P是一类高毒性、强致癌物，对人体健康危害极大，但它对人肝细胞毒性作用如何？Tau是否可拮抗其肝毒性及机制如何？相关报道较少。本研究采用单细胞凝胶电泳技术（SCGE）来分析B(a)P诱导健康人胚肝细胞（L-02细胞）DNA的损伤作用以及牛磺酸的保护效应，同时测定脂质过氧化损伤主要终产物丙二醛（MDA）、抗氧化主要物质还原型谷胱甘肽（GSH）及肝细胞损伤漏出酶（AST、 ALT)含量的改变，探讨Tau对B(a)P肝细胞毒性的保护作用，以期为建立化学毒物致人肝细胞DNA损伤模型和寻找有效的营养保护因子提供科学依据。
1 材料与方法
11主要仪器
CO2培养箱，DYY－Ⅲ7型电泳仪、电泳槽（北京市六一仪器厂），冷冻离心机（上海安庭科学仪器厂），荧光显微镜和荧光数码显微成像系统（日本OLYMPUS公司）。
12 主要试剂
培养基（DMEM，美国Gibco公司），小牛血清（新西兰PerbBio公司），胰蛋白酶（Difco武汉中键科技开发公司），正常熔点琼脂糖（NMPA，德国Merck Darmstadt公司），低熔点琼脂糖（LMPA，上海YITO BIOINSTRUMENT公司），TritonX100（SinoAmerican Biotec），溴化乙锭（EB，Sigma进口分装），二甲基亚砜（DMSO，Sigma公司），Taurine (Sigma公司）， B(a)P(Sigma公司)。
13 分组处理
L-02细胞来自武汉大学中国典型培养物保藏中心。取对数生长期的L-02细胞40μl，与04％台盼蓝按1∶1混合，观察细胞存活率。若细胞存活率不低于95％，可用于试验。按每孔细胞数约1X105个，将细胞接种到6孔培养板，置CO2培养箱培养12h使细胞贴壁，12h后更换新鲜培养基用于以下试验。细胞随机分为4组：①对照组：空白对照及DMSO（10me／L）溶剂对照组；②B(a)P组：为损伤模型组，B(a)P设高（50μM）、低(25μM)两个剂量，加入培养体系后继续培养2h；③Tau组：设05，10，20，40mM四个浓度，加入培养体系后继续培养24h；④Tau预防组：L-02细胞先以四个不同浓度的牛磺酸预处理24h，再加入25μM的B(a)P，培养2h。四组每种物质、每种浓度设3个复孔，培养体系里小牛血清浓度均为10％。培养结束后收获细胞进行SCGE分析，用培养上清液测定MDA、GSH、天门冬酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)含量。
14 肝细胞
DNA损伤测定：采用SCGE技术，参照Singh方法【1】，操作步骤包括制片、裂解、解旋、电泳、中和和染色，最后在荧光显微镜下（100W汞灯作为荧光光源，激发波长为549nm，发射波长为590nm）观察、测定。未受损的细胞核表现为一圆形荧光核心，即彗星头部，没有拖尾；而受损的细胞则有彗星尾从核中伸向阳极，形成一个亮的荧光头部和尾部。每片随机观察计数100个细胞核并拍照。计算平均Oliver尾矩值及标准差，并进行统计分析。根据“彗星”尾中DNA含量占彗星DNA总量的百分比将细胞损伤进行分级［1］，计数不同损伤级别的细胞核数。0级：＜5%，代表无损伤；Ⅰ级：5%～20%，代表轻度损伤；Ⅱ级：20%～40%，代表中度损伤；Ⅲ级：40%～95%，代表重度损伤；Ⅳ级：≥95%，代表完全损伤。
15 MDA、GSH、AST、ALT的测定
分光光度法，用南京建成生物工程研究所产的检测试剂盒。
16 资料统计分析
上述所有指标重复测3次取均值。数据采用SPSS统计软件处理，对于计量资料，各组间的显著性检验用方差分析，各实验组与对照组间比较用GamesHowell检验；计数资料采用秩和检验；采用一元线性相关分析各指标间的相关性。
2 结果
21 B(a)P对人胚肝细胞DNA损伤及Tau
的保护作用各组3次重复试验的数据均服从正态分布。由表1可见，25，50μM的B(a)P均能引起L-02细胞明显的DNA单链断裂损伤，其Oliver尾矩值与溶剂对照组相比差异有显著性（P＜001），随着B(a)P剂量升高，引起细胞损伤的Oliver尾矩值也增大（P＜001）；05～40mM的Tau对L-02细胞未见有毒性作用，Oliver尾矩值随着Tau剂量增大有减小趋势；若预先用Tau预处理L-02细胞，可明显减轻细胞DNA损伤，其Oliver尾矩值与单纯25μM的B(a)P组相比差异有显著性（P＜001），且Oliver尾矩值随着Tau剂量增大而减小，40mM的Tau的保护作用尤其显著。B(a)P对L-02细胞DNA损伤及Tau保护作用的彗星图像见附图。
表2显示，B(a)P诱导不同损伤级别的细胞数不同（P＜001），随B(a)P剂量增大，细胞损伤严重程度增加；10mM的Tau引起的细胞DNA损伤级别与空白对照无显著差异（P＞005），其余剂量组与空白对照相比，各级损伤细胞数不同（P＜001），05 mM的Tau引起细胞损伤的级别稍加重，而2～40mM的Tau可使细胞损伤减轻；若预先用05～40mM的Tau预处理L-02细胞，可明显减轻细胞DNA损伤，与单纯25μM的B(a)P组相比，各级损伤细胞数有显著性差异（P＜001），随Tau剂量增大，细胞损伤严重程度减轻。以上结果与Oliver尾矩值显示的结果基本一致。

图1B(a)P致L-02细胞核DNA损伤及Tau保护作用的彗星图像（附图）
22 B(a)P对L-02细胞培养上清液MDA、
GSH的影响及Tau的保护作用从表3可见，B(a)P引起人胚肝细胞培养上清液中MDA含量增加和GSH含量降低（P＜005）；其中MDA含量随着Tau浓度增加而降低，2～40mM的Tau组与空白对照相比差异有显著性意义（P＜005），而GSH含量在Tau组与空白对照组之间无显著差异，但有随Tau浓度增加而增加的趋势；Tau预防组培养上清液中MDA含量虽然与单纯B(a)P组比较无显著性差异，但加入Tau可使MDA含量降低，使GSH含量上升并随Tau剂量增加而增加，与单纯B(a)P组比较差异显著（P＜001）。
B(a)P对L-02细胞培养上清液AST、ALT的影响及Tau的保护作用
如表4所示，B(a)P可引起人胚肝细胞培养上清液中AST和ALT含量升高（P＜001～005），但Tau组却与空白对照组无显著差异；Tau预防组可使培养上清液中AST和ALT含量降低，与单纯B(a)P组比较差异显著（P＜001～005）。

24 B(a)P及Tau对L-02细胞DNA损伤
的影响和（抗）氧化指标相关性分析将25μM B(a)P组对人胚肝细胞DNA损伤的Oliver尾矩值与培养上清液中各检测指标及Tau干预组数值做直线相关分析发现，Olive尾矩值与MDA含量呈明显正相关（r=0852，P＜001），与GSH含量呈明显负相关（r=-0929，P＜001），与AST、ALT含量呈明显正相关（r=0930和0927，P＜001）。

表2B(a)P致L-02细胞DNA损伤分级及Tau的保护作用
组别〖〗0级〖〗Ⅰ级〖〗Ⅱ级〖〗Ⅲ级以上空白对照〖〗46〖〗50〖〗4〖〗005 mM Tau〖〗47〖〗37〖〗16〖〗010mM Tau〖〗56〖〗40〖〗4〖〗020mM Tau〖〗57〖〗41〖〗2〖〗040mM Tau〖〗65〖〗34〖〗1〖〗0DMSO对照〖〗28〖〗67〖〗5〖〗0B(a)P25μM〖〗0〖〗67〖〗28〖〗5B(a)P50μM〖〗0〖〗49〖〗42〖〗925μM B(a)P + 05 mM Tau〖〗12〖〗50〖〗38〖〗025μM B(a)P + 10mM Tau〖〗14〖〗50〖〗36〖〗025μM B(a)P + 20mM Tau〖〗16〖〗64〖〗20〖〗025μM B(a)P + 40mM Tau〖〗16〖〗78〖〗6〖〗0
表3 B(a)P对L-02细胞培养上清液MDA、GSH的影响及Tau的保护作用（X±S）
组别〖〗MDA〖〗GSH空白对照〖〗5817±0282〖〗21465±77405 mM Tau〖〗5993±066〖〗421536±124010mM Tau〖〗4743±0766〖〗21822±102020mM Tau〖〗4563±0820*〖〗23319±214840mM Tau〖〗4253±0472*〖〗25209±2103DMSO对照〖〗5817±0675〖〗12836±214B(a)P 25μM〖〗7650±0817*〖〗10947±539*25μM B(a)P+ 05 mM Tau〖〗6577±0135〖〗14477±728△△25μM B(a)P+ 10mM Tau〖〗6397±0509〖〗16045±849△△25μM B(a)P + 20mM Tau〖〗64000±1347〖〗1715067±405△△25μM B(a)P + 40mM Tau〖〗63067±1075〖〗1978933±1127△△注：与溶剂对照组相比，*P＜ 005；与单纯25μM的B(a)P组相比，△△P＜001
表4B(a)P对L-02细胞培养上清液AST、ALT的影响及Tau的保护作用（X±S）
组别〖〗AST〖〗ALT空白对照〖〗2106±043〖〗2399±35105 mM Tau〖〗2068±129〖〗2437±33710mM Tau〖〗2068±127〖〗2177±75220mM Tau〖〗1936±107〖〗1956±13740mM Tau〖〗2031±075〖〗1840±159DMSO对照〖〗2124±139〖〗2784±088B(a)P 25μM〖〗3093±043**〖〗3901±569* 25μM B(a)P + 05 mM Tau〖〗2961±246〖〗3073±37625μM B(a)P + 10mM Tau〖〗2575±142△〖〗2707±148△25μM B(a)P + 20mM Tau〖〗2388±268△△〖〗2524±1002△25μM B(a)P + 40mM Tau〖〗2331±329△△〖〗2485±252△注：与溶剂对照组相比，**P＜ 001；与单纯25μM的B(a)P组相比，△P＜005，△△P＜001
3 讨论
31 B(a)P对健康人胚肝细胞的毒性
B(a)P是一种公认的环境和食品污染物，对人和动物具有一定的毒性和强烈的致癌作用，是世界卫生组织确定的食物中三大强致癌物质之一，在致癌物分类中属于A类致癌物。其在体内需经代谢活化转变成终致癌物后才具有致突变和致癌作用。B(a)P大部分经肝、肺细胞微粒体中细胞色素P-450酶系代谢活化形成终致癌物二羟基环氧化物，该环氧化物可与靶细胞DNA结合，形成加合物引起DNA损伤，从而启动致突变、致癌过程［3，4］。B(a)P代谢产物之一的反式7，8二羟9，10环氧化苯并芘是代谢终致癌物，可与DNA结合而损伤DNA并引起突变。此外，B(a)P代谢过程中可产生多种ROS，当细胞内ROS处于较高水平超过细胞清除能力时也会引起脂质过氧化并诱导DNA损伤［5］。
B(a)P在机体内的代谢主要在肝脏进行，但其对肝细胞DNA损伤及致肝癌的相关报道不多，Gao YJ等［6］研究发现B(a)P在50μM时可引起人胚肺细胞DNA的明显损伤。Garry S等［7］发现经气道染毒B(a)P 3mg可引起大鼠肝细胞、肺细胞及外周血淋巴细胞DNA损伤；Garry S［8］亦发现Fe2O3 075mg单独给予不能引起大鼠肝肺等细胞的DNA损伤，而B(a)P075mg单独给予即可引起肝肺细胞的DNA损伤，Fe2O3及B(a)P联合给予则可增强肝肺细胞的DNA损伤。本课题用SCGE来分析食品污染物B(a)P诱导健康人胚肝细胞DNA的损伤，建立化学毒物致肝细胞损伤的体外实验研究模型，同时探讨食物中的营养成份Tau对B(a)P肝毒性的保护作用。
本试验结果表明：25、50μM的B(a)P在体外试验中均能引起L-02细胞明显的DNA单链断裂损伤，其Oliver尾矩值与溶剂对照组相比差异有显著性；高低剂量B(a)P之间引起L-02细胞的DNA损伤也有差异性，随着B(a)P剂量升高，引起细胞DNA损伤的作用也增大。DNA损伤分级结果显示：各组诱导不同损伤级别的细胞数均不同， B(a)P组与溶剂对照组相比，无损伤及轻度损伤细胞数较少，而中、重度损伤细胞数增多；高低剂量的B(a)P组相比，高剂量的B(a)P引起的细胞DNA损伤级别有加重趋势。从以上结果可以看出，25μM的B(a)P即可引起L-02细胞DNA的明显损伤，并随剂量增加而损伤加重。
化学性毒物产生毒性作用的机制复杂多样，其中脂质过氧化被认为是重要的机制之一，它所产生的代谢产物可以引起多种细胞功能的损伤，并且和疾病的发生发展有密切关系。MDA是氧自由基作用于生物膜中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化反应的终产物，不仅可改变膜结构和膜通透性，而且MDA易与核苷酸结合形成加合物，造成DNA链上易受物理、化学因素攻击的薄点，其与鸟苷反应生成的加合物M1G，能引起移码突变、碱基对替换和DNA链断裂［9］等。MDA的高低反映了细胞受自由基攻击的严重程度，是反映机体氧化损伤的最具代表性的指标之一。GSH既可以与嗜电子毒物结合，阻断毒性化合物对DNA、RNA及蛋白质的损害，又可以作为重要的还原剂，保护体内蛋白质或酶分子中巯基免遭氧化，是机体抵抗活性氧的主要物质之一［10，11］，其水平的降低反映了组织或细胞氧化应激的程度。细胞中GSH含量降低，其抗氧化能力便会下降，使外来有害因素对细胞的脂质过氧化作用增强。本研究结果显示：B(a)P引起L-02细胞培养上清液中MDA含量增加及GSH含量降低，酶学测定结果可见AST、ALT含量均显著升高。结果提示脂质过氧化损伤在B(a)P致肝细胞损伤机制中起重要作用，与Godschalk R等［6］的研究结果相符。
32 Tau对B(a)P致健康人胚肝细胞毒性的保护作用Tau是机体内含量最丰富的自由氨基酸，主要分布在细胞内，具有十分广泛的生物学效应。缺乏Tau可引起机体生长发育缺陷、免疫缺陷、心血管疾病、肝胆系统损伤等。在Tau众多的生物学作用中，抗氧化作用越来越受重视，其直接作用是由其分子中的氨基与氧化剂结合从而阻止了氧化作用的发生，如Tau与强氧化剂HOCl作用时生成牛磺氯胺，从而解除了HOCl对组织细胞的氧化损伤作用并且可直接诱导肿瘤细胞凋亡［12，13］；间接抗氧化作用可能是Tau能机械地进入细胞膜，稳定细胞膜的脂质成分，从而抵抗氧化剂的攻击［14］，故Tau对多种氧化剂造成的细胞损伤具有良好的拮抗作用。肝脏是合成Tau的主要器官，如肝脏受到毒物的侵害，可影响Tau的合成，使肝脏及其它组织Tau浓度降低，更易受到有害因素的影响。
文献资料表明，Tau通过抗氧化作用可对抗多种与氧化损伤有关的肝脏疾病：（1）Tau可有效防治大鼠酒精性肝损伤。乙醇在体内可通过脂质过氧化而引发肝脏疾病［15］，同时给予Tau后则降低脂质过氧化过程及提高酶和非酶系抗氧化剂含量而减轻乙醇的毒性［16,17］。（2）肝脏缺血再灌注以后引起线粒体损伤，用Tau等加入再灌注液和贮藏液可减少乳酸脱氢酶、转氨酶、谷胱甘肽S转移酶的漏出，对缺血再灌注肝损伤起保护作用［18］。（3）脂质过氧化还可激活枯否细胞和肝星状细胞（HSC），并造成过量细胞外基质的沉积，在肝纤维化的发生发展过程中起重要作用。自由基清除剂能抑制HSC活化、增殖并抑制合成。Chen YX等［19］观察到5～50mM范围的Tau可剂量依赖性抑制离体HSC增殖，故可对抗HSC引起的肝纤维化。(4)肝脏对药物、化学毒物解毒的过程中同时会产生大量的自由基，当产生量超过肝脏的清除能力时，极易造成肝细胞损伤。研究发现Tau可减轻某些毒物、药物的肝毒性，与减轻肝脏脂质过氧化有关［20,21］。有研究发现一些抗氧化营养因子可对抗B(a)P引起的细胞DNA损伤，如大鼠给予B(a)P后分离肝细胞可见肝细胞DNA损伤，而在食物中同时给予VitE、VitA则可减轻其损伤作用［22］；Gajecka M等［23］观察到VitC、VitE通过和ROS竞争与DNA结合可拮抗B(a)P诱导的健康人外周血淋巴细胞的基因毒性；硒是抗氧化酶主要成分之一，Yu RA 等［24］证明亚硒酸钠可对抗B(a)P导致的小鼠肺细胞的DNA损伤。Yen GC等［25］发现抗氧化剂绿茶、乌龙茶、黑茶及提取物茶多酚可减轻B(a)P引起的癌化程度低的Chang liver cell的DNA损伤。本研究显示：不同浓度Tau预处理所致L-02细胞的Oliver尾矩值与空白对照组无显著差异，且能明显减轻25μM的B(a)P引起的细胞DNA损伤，与单纯毒物组相比差异有显著性，且Oliver尾矩值随着Tau剂量增大而减小，40mM的Tau的保护作用尤其显著。表明Tau有良好的拮抗B(a)P诱导肝细胞DNA损伤效果。对培养上清液中MDA及GSH含量测定结果表明，MDA含量随着Tau浓度增加而降低，2～40mM的Tau组与空白对照组相比差异有显著性；Tau预防组MDA含量虽然与B(a)P组比较无显著性差异，但加入Tau可使MDA含量降低。Tau组GSH含量与空白对照组无显著差异，且有随Tau浓度增加而增加的趋势；Tau预防组GSH含量增高，与B(a)P组比较有极显著差异，且随Tau剂量增加而增加。提示Tau具有拮抗B(a)P引起的L-02细胞MDA含量升高及GSH下降的作用。Pearson相关性分析表明，健康人胚肝细胞DNA损伤的Olive尾矩值与MDA含量呈明显正相关，与GSH含量呈明显负相关，显示氧化损伤在B(a)P致L-02细胞损伤机制中起重要作用，脂质过氧化损伤指标MDA升高和抗氧化酶GSH降低可在一定程度上反映肝细胞DNA损伤情况。培养上清液中转氨酶AST、ALT测定结果显示：Tau组与空白对照组无显著差异，1～40mM的Tau预防组可显著抑制B(a)P引起的转氨酶升高，表明Tau具有拮抗B(a)P引起肝细胞AST、ALT含量升高的作用。Pearson相关性分析表明，健康人胚肝细胞DNA损伤的Olive尾矩值与AST、ALT含量呈明显正相关，表明转氨酶含量升高也可在一定程度上反映肝细胞DNA损伤情况。
综上所述，本研究发现B(a)P可诱导健康人胚肝细胞DNA损伤，并且在较低剂量下即能产生明显损伤作用； Tau通过减轻肝细胞氧化损伤，可显著拮抗B(a)P引起的L-02细胞毒性，显示Tau不失为一种具有抗化学性肝损伤的营养物质。研究结果还提示：可通过B(a)P染毒 L-02细胞来建立含肝毒性有效评价指标的细胞DNA损伤体外试验模型，以此作为一个灵敏、快捷、准确地筛选无毒副作用、有良好效果的保肝护肝营养及药用物质的科研平台，对进一步促进抗肝病、抗肿瘤的创新研究有一定的现实意义。
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