达能营养中心第九届学术研讨会论文集

摘要：本文利用独自建立的三基因突变 (apoE-／-／LDLR-／-／Leprdb／db，ALO)小鼠模型，探讨大蒜素对其血脂代谢及动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）发展的影响。结果显示，高脂／高胆固醇／高糖喂养的小鼠，较普通饮食同龄小鼠血脂TC，TG水平明显增高。大蒜素处理组不同程度地抑制了血脂增高的趋势，对脂肪肝以及动脉粥样硬化病变均有一定的抑制作用。今后有待于进一步系统深入研究。
另外，我们此次采用90％乙醇溶液为浸提剂的大蒜素萃取方法效果最好。
关键词： 三基因突变(apoE-／-／LDLR-／-／Leprdb／db, ALO)小鼠；动脉粥样硬化(AS)；大蒜素；高血脂

Atherosclerosis is a complex multifactorial disease. At present study, apoE-／-／LDLR-／-／Leprdb／db ，a treplegene mutant (ALO) mouse was established for the first time, and has been used for study the effects of allicin on hyperlipidemia as well as atherogenesis.
1The level of TC and LDLC are decreased in ALO mice which received allicin compared to those mice received distilled water. But the level of TG and HDLC are not changed significantly in allicin trated groups.
2The body weight have no visible Changes compared to those mice received distilled water.
3When feeded with normal diet, the liver apomorphosis is obviously changed compared to those mice received distilled water. Feeded with high sucrose ／fat／cholesterol diet, however, the efect of allicin is shown more affective, and the fat drops in liver cell is became more small and less than those mice given by distilled water as placebo.
4The morphology change of atherosclerosis in allicin groups shown slightly inhibited compared with that of placebo group.
5These results indicated that triple gene mutation is strong contributed to sever hyperlipidemia and allicin has a role that inhibited the progress in development of dyslipidemia and atherogenesis in our unique ALO mice model.

多数疾病与基因变异或基因多态性有关，而相当一部分疾病的发生发展均涉及到两个以上基因的结构或表达调控的改变。动脉粥样硬化症（athrosclerosis, AS）是严重危害人类健康的常见的多基因疾病。脂质代谢异常、肥胖、糖尿病等诸多因素均可导致AS。人以及动物研究表明，血脂代谢异常导致的动脉内膜损伤、脂质沉积是AS的重要始动原因。血浆总胆固醇（TC）和甘油三脂（TG）增高等血脂代谢紊乱以及脂质氧化是引起动脉内脉损伤的重要原因之一(1-3)。
肥胖作为心脑血管疾病危险因子，常与其它致病因素并存，共同参与多种相关疾病的发生发展。瘦素受体(leptin receptor，LR)介导瘦素参与糖、脂肪等能量代谢及体脂调节。LR编码基因（db）突变（Leprdb／db）小鼠表现为皮下及内脏周围脂肪过渡沉积，个体高度肥胖并伴有血脂、血糖代谢失衡(4,5)，说明瘦素及其受体功能异常与肥胖以及相关病变有关。目前中国有2亿人超重、7000万人肥胖，高血压和高血脂的人数都超过16亿，冠心病、中风等心血管疾病患者呈急速增长趋势。
数千年来大蒜在中国等亚洲国家，一直是一种药食两用的食品。二十世纪70年代以来国际上越来越重视对大蒜药用价值的研究和应用，现代医学研究也说明大蒜和天然大蒜制剂有非常好的防病治病功效。其强大的药理作用价值已备受国际医学界和消费者的青睐，成为欧美等国用于抗菌、提高免疫力、调节血脂和抗肿瘤的首选天然治疗药物。然而，应用脂代谢关键基因突变小鼠模型，开展大蒜素对其血脂代谢紊乱影响以及抗AS的研究不多，为此在前期工作的基础上，我们利用三基因突变小鼠（ALO），讨论了在大蒜素对其降血脂以及抗AS的作用特点。
材料与方法
1小鼠：待小鼠出生后第4周停止母乳喂养，小鼠分6组，在不同饮食喂养条件（普通饲料含4％动物脂肪和0075％胆固醇；高脂高胆固醇饲料含10%动物脂肪和125%）的同时，分别添加安慰剂和大蒜素溶液灌胃，所有小鼠于SPF级动物房饲养、繁殖，恒温、恒湿、12小时日暗循环环境，饮水和饲料均令其自由摄取。

2给药方式：从第4周至第15周龄连续12周的喂养过程中， 1天／2次，每天早晚9点各给药一次，间隔12小时；每次每只小鼠给药量为10mg／kg大蒜素抽提液。
3血生化指标检测：分别采集3、5、7、11和15周龄小鼠（n=6）尾静脉血01ml，分离血清，采用CODPAP、GPOPAP法和免疫抑制酶试剂直接法［,］，测定TC、TG、HDLC和LDLC浓度。所有数据以x±s表示，应用SPSS110统计软件进行分析。实验结果采用独立样本的ttest检验，P＜005为统计学有显著性差异，P＜001为统计学有极显著差异。
4肝脏以及主动脉形态学观察：待小鼠15周龄时，解剖小鼠（n=6），分别制备肝脏和主动脉冰冻切片（5μm），采用油红O和HE染色，光学显微镜下拍照纪录。
结果
1 血脂、血糖水平变化（图1，图2，图3，图4）

图1小鼠不同年龄时期血清TC水平

图2小鼠不同年龄时期血清 TG水平

图3不同年龄时期血清HDLC水平

图4不同年龄时期血清LDLC水平
2 肝脏形态学检测
普通饮食喂养的小鼠，5w龄时肝脏切片HE染色后也不见明显变化（图5A），随年龄增长，至15w龄时，肝细胞表现出明显的脂肪变性，胞浆内出现大小不等的脂滴。高脂高胆固醇喂养的小鼠，在5w龄时，肝脏就表现出一定程度的脂肪变性，肝细胞质内出现大小不等的脂肪滴（图5C）。喂养12w时，大小不等的脂滴融合成较大的脂滴，充满于肝细胞质内，使肝细胞体积明显增大（图5D）。增加高糖饮水的小鼠肝脏脂肪变形程度较同周龄单纯高脂高胆固醇饲料喂养的小鼠相比更为严重（图5E、F）；大蒜素给药处理的小鼠在普通饮食条件下与蒸馏水安慰剂处理的小鼠相比肝脏脂肪变性程度略有减轻，但不明显（图6A-B）。而高脂高胆固醇饮食组和高糖高脂高胆固醇饮食组的小鼠肝脏脂肪变性有明显的减缓（图6CF）。

图5 0.9%生理盐水安慰剂对照组小鼠
的肝脏冰冻切片HE紫色
A：5周龄ALO小鼠，普通饮食（×600）
B：15周龄ALO小鼠，普通饮食（×600）
C：5周龄ALO小鼠，高脂高胆固锌饲料（×600）
D：15周龄ALO小鼠，高脂高胆固锌饲料（×600）
E：5周龄ALO小鼠，高糖高脂高胆固锌饮食（×600）
F：15周龄ALO小鼠，高糖高脂高胆固锌饮食（×60）

图6大蒜素给药组小鼠的
肝脏冰冻切片HE染色
A：5周龄ALO小鼠，普通饮食（×600）
B：15周龄ALO小鼠，普通饮食（×600）
C：5周龄ALO小鼠，高脂高胆固锌饲料（×600）
D：15周龄ALO小鼠，高脂高胆固锌饲料（×600）
E：5周龄ALO小鼠，高糖高脂高胆固锌饮食（×600）
F：15周龄ALO小鼠，高糖高脂高胆固锌饮食（×60）

肝脏油红O染色结果，证实不同年龄段小鼠肝细胞的脂肪病变程度，与HE染色结果吻合（图7）。大蒜素给药组肝组织脂肪病变相对较轻（图8）。

图7 0.9%生理鼻水安慰对照组
小鼠的肝脏冰冻切片油红染色
A：5周龄ALO小鼠，普通饮食（×600）
B：15周龄ALO小鼠，普通饮食（×600）
C：5周龄ALO小鼠，高脂高胆固锌饲料（×600）
D：15周龄ALO小鼠，高脂高胆固锌饲料（×600）
E：5周龄ALO小鼠，高糖高脂高胆固锌饮食（×600）
F：15周龄ALO小鼠，高糖高脂高胆固锌饮食（×60）

图8大蒜素给药组小鼠的
肝脏冰冻切片油红染色
A：5周龄ALO小鼠，普通饮食（×600）
B：15周龄ALO小鼠，普通饮食（×600）
C：5周龄ALO小鼠，高脂高胆固锌饲料（×600）
D：15周龄ALO小鼠，高脂高胆固锌饲料（×600）
E：5周龄ALO小鼠，高糖高脂高胆固锌饮食（×600）
F：15周龄ALO小鼠，高糖高脂高胆固锌饮食（×60）

3 主动脉形态
所有实验组小鼠主动脉均有不同程度的AS早期病理变化（图9）。根部主动脉内膜有泡沫状细胞堆积病灶，内膜增厚、平滑肌细胞的游走和增值，结缔组织增生以及胆固醇结晶核等。其病变的程度依次为高脂高胆固醇+蔗糖组＜高脂高胆固醇+普通饮水＞高脂高胆固醇+大蒜组＞普通饮食+大蒜组。

图9高脂+高糖喂养的15周龄ALO小鼠主动脉（右图），有明显的动脉粥样硬化病灶，大蒜素处理的高脂喂养组，病变较前者轻。
讨论
5w龄到15w龄整个喂养阶段内，同一时间内高脂高胆固醇饮食喂养的小鼠的TC水平均显著高于普通饮食喂养的小鼠，而加以高糖饮水配同高脂高胆固醇饲料喂养的小鼠又要比单纯高脂高胆固醇饲料喂养的小鼠。各实验组内小鼠TC水平从3w龄到7w龄内先是逐渐增加，后趋于平稳。实验中辅以大蒜素给药处理的小鼠，其TC水平比同饮食小组相对低，并随年龄增长，与同样饮食条件空白对照组小鼠之间的TC水平差值幅度有所增大。
HDLC、LDLC水平的变化情况与TC相似，小鼠在普通饮食、高脂高胆固醇、高糖高脂高胆固醇饮食3个喂养条件下依次增加，并都随着小鼠年龄的增长，有个逐渐增加的过程，至11w龄大小左右时其HDLC、LDLC水平开始趋于稳定。辅以大蒜素给药处理后，同一时期内，相同饮食条件的小鼠的LDLC水平有一定程度的降低，但比较TC水平变化其下降趋势要小很多。而HDLC水平在大蒜素给药处理后，同样饮食条件各组小鼠之间比较没有发生大的变化。
实验各组小鼠的TG水平在普通饮食、高脂高胆固醇、高糖高脂高胆固醇饮食3个喂养条件下依次增加，并随着小鼠周龄增长而逐渐增加。同一时期内，相同饮食条件的两组对比组的小鼠TG水平在大蒜素给药处理后之间比较基本没有变化。
普通饮食喂养的小鼠，5w龄时肝脏无明显变化，但随年龄增长，至15w龄时，该小鼠表现出明显的肝脏脂肪变性。高脂高胆固醇饮食喂养的小鼠，5w龄时，肝细胞质内即出现散在的小脂肪滴。高脂高胆固醇饮食喂养时间越长，小鼠肝脏脂肪变性程度越重。增加高糖饮水的小鼠肝脏脂肪变形程度较同周龄单纯高脂高胆固醇饲料喂养的小鼠相比更为严重；大蒜素给药处理的小鼠在普通饮食条件下与蒸馏水安慰剂处理的小鼠相比肝脏脂肪变性程度略有减轻，但并不明显。而高脂高胆固醇饮食组和高糖高脂高胆固醇饮食组的小鼠则由于大蒜素的药理作用使得肝脏脂肪变性有明显的减缓。
apoE基因的缺失导致对富含胆固醇的脂蛋白清除障碍，使TC、 LDL和 VLDL增高、泡沫细胞形成并堆积于血管壁内。LDLR基因缺乏的人或小鼠由于富含apoB100的LDL的聚集，TC中度增高，AS也较缓慢且轻微。而当apoE依赖的LDLR途径和非LDLR途径受阻时会导致小鼠在幼龄时即出现乳糜微粒、LDL和IDL增高，血脂代谢异常和AS的病变程度更为严重。瘦素受体介导瘦素参与体内脂肪和糖等能量及脂蛋白的代谢与调节，其基因缺失的小鼠幼龄开始即出现病理性肥胖、胰岛素抵抗，并伴有血糖、TG及TC的轻度升高，但未出现明显的AS性病变（潘论文）。提示该小鼠体内apoE和LDLR等发挥着血脂代谢的主要作用，而单独存在的瘦素／瘦素受体相关代谢途径在血脂代谢中不占主要地位。
高血糖能产生超氧化应激，增加体内氧自由基和糖基化终产物的生成，导致内皮受损、LDL的氧化和糖基化以及高胆固醇血症的发生；修饰的LDL可促进单核细胞迁入动脉内膜并转变成泡沫细胞。高血糖还可促进动脉平滑肌细胞的增生和聚集，参与了ALO小鼠血脂紊乱及早期AS发生发展，加速AS斑块的形成。
因此，脂代谢相关的apoE、LDLR、db基因联合突变导致了ALO小鼠普通饮食组从3w龄开始即出现血脂、血糖的紊乱及血浆脂蛋白水平的异常，且发生时间提前，说明apoE和LDLR双基因缺失，联合db基因突变加重了由血脂代谢转运障碍导致的血脂紊乱和血浆脂蛋白异常，引发了血糖代谢失衡，从而加速了AS性病变的发生发展。高脂高胆固醇饮食的诱导作用加速了这一病理过程。因此，三基因突变对血脂紊乱和AS的影响不仅是单个基因突变效应的加和，多基因间的相互影响和作用在ALO小鼠血脂紊乱及AS性病变的发生发展中发挥了重要的作用。
本实验表明，脂代谢相关三基因突变的ALO小鼠幼龄时即表现出明显的高脂血症和早期AS性病变，且随年龄的增长，血脂紊乱和AS病变程度加剧，还伴随明显的肝脏脂肪变性。高脂高胆固醇饮食加剧了肝脏的这一病变，反映了饮食性因素对AS发生发展的影响。
大蒜含有丰富的蛋白质、糖类、维生素及矿物质等。大 蒜 素(Allicin) ，即二烯丙基硫代亚磺酸醋，是大蒜油中的主要成分。大蒜素对血管的作用是通过降低血浆总胆固醇及肝脏cAMP水平等作用实现的。大蒜素由于具有较强的还原性而具有抗氧化能力，能与活泼自由基反应，形成稳定的新自由基，从而切断引起油脂自动氧化的自由基链式反应:大蒜提取物含还原态硫，有较强的还原性，能将过氧化物及氧还原掉，从而发挥抗氧化作用。
大蒜素对高胆固醇血症的保护机制是在增加脂质分解和抑制胆固醇及脂肪酸合成途径的关键酶系统中发挥作用的。高质血症可引起血小板聚集性升高、促进动脉粥样硬化、缺血性心脏病、血栓等的形成和发展。研究表明，大蒜素可降低机体血浆内皮素(ET)的水平，这对预防和缓解冠脉痉挛、减小外周血管张力。同时，大蒜素对血浆一氧化氮(NO)浓度有升高作用。另外，大蒜素能对乙醇所致的各种抗氧化酶的变化有逆转效应，对乙醇性肝损伤的保护作用与其增强肝脏抗氧化作用有关。本文在前期实验的基础上增加了高糖饮水及禁食过程对小鼠脂肪堆积及血脂异常，并由此引发动脉病变的影响，并初步探讨了大蒜提取物之一的大蒜素在缓解和治疗AS病变中所发挥的作用。本实验所提取的大蒜素是通过乙醇溶液作为有机溶剂从破碎的大蒜组织中萃取得到的，是大蒜提取物中非常重要的生物活性组分之一，纯度达到90%以上。本实验结果显示大蒜素对于因高糖高脂高胆固醇饮食不当引起的血脂异常及动脉粥样硬化均有一定的疗效，表现在对血脂TC、LDLC两项血液生化指标有一定程度的降低，分别达到6％、45％左右，同时动脉斑块也有一定程度的抑制。本工作的后续实验将深入开展脂代谢相关功能蛋白的蛋白组学分析研究，大蒜素组分的进一步分离纯化及其药代药动研究以及降血脂和抗AS的机理研究，为今后相关疾病的防治药物的开发打下坚实的基础。
参考文献
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［3］ Ishibashi S, Herz J, Maeda N, et al. The tworeceptor model of lipoprotein clearance: tests of the hypothesis in “knockout ” mice lacking the low density lipoprotein receptor, apolipoprotein E, or both proteins. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1994; 91: 4431-4435.
［4］ Tartaglia LA, The leptin receptor. J Biol Chem., 1997; 272: 6093-6096.
［5］ Chua SC Jr., Chung WK, WuPeng XS, et al. Phenotypes of mouse diabetes and rat fatty due to mutations in the OB (leptin) receptor. Science, 1996; 271: 994-996.