达能营养中心第九届学术研讨会论文集

摘要：目的观察抗性淀粉（RS）对大鼠肝脏胆固醇代谢相关基因表达的影响，探讨RS干预胆固醇代谢的作用机制。方法将18只大鼠随机分为三组，分别饲食正常化学纯合饲料（对照组）、含15%RS纯合饲料（低RS组）和含30%RS纯合饲料（高RS组）6周。采用实时荧光定量PCR技术检测各组大鼠肝组织中胆固醇7a羟化酶（CYP7A1）、肝清除细胞B1受体（SRB1）、肝低密度脂蛋白受体（LDLR）mRNA表达水平。并检测各组大鼠血胆固醇、盲肠内容物短链脂肪酸（SCFA）含量。结果大鼠肝组织CYP7A1mRNA、SRB1mRNA、LDLR mRNA表达水平及盲肠内SCFA含量，高RS组与对照组相比显著增加（P＜005）。血清胆固醇水平，RS干预组显著低于对照组（P＜005）。结论RS通过增强肝组织胆固醇代谢相关基因表达水平，增加盲肠内SCFA含量，发挥降低血胆固醇的作用。
关键词：抗性淀粉；基因；干预；胆固醇代谢

Study on effect of resistant starch on gene expression
 of genes associated with cholesterol metabolism in rat liver.Zhangwenqing1Zhangyueming2
1Shanxi Medical University, Taiyuan ,0300012Xinjiang Medical University,Wulumuqi, 830054

Abstract:Objectivewe examined the effects of RS on serum cholesterol and on gene expression of genes associated with cholesterol metabolism in rat liver in order to understand the mechanism on reducing the serum cholesterol level. MethodsEighteen rats were randomly assigned to three groups, six rats each group. They were fed with chemical purified normal diet (control group), lower RS (15%HiMaize 1043) diet and high RS (30%HiMaize 1043) diet，respectively. Six weeks later, sercum cholesterol and short chain fatty acid (SCFA) concentration in the cecum were measured. Likewise, hepatic cholesterol 7ahydroxylase, LDL receptor, and SRB1mRNA levels were measured by Realtime PCR. ResultsHepatic cholesterol 7ahydroxylase, LDL receptor, SRB1mRNA levels and cecal acetate, propionate and nbutyrate concentrations in the high RS group were significantly higher than in the control group(P＜005＝. Sercum cholesterol in intervention group were significantly lower than in the control group(P＜005＝. ConculsionRS reduces serum cholesterol level by increasing hepatic cholesterol 7ahydroxylase, LDL receptor, and SRB1mRNA levels, and by increasing cecal SCFAs contents.
Keywords:resistant starch; gene; intervention; cholesterol metabolism.

抗性淀粉（resistant starch，RS）为“健康人小肠中不吸收的淀粉及其降解产物”，具有抵抗淀粉酶消化的特性，在结肠微生物的作用下发酵，产生有代谢活性的短链脂肪酸（主要是乙酸、丙酸和丁酸）。大量研究表明，短链脂肪酸可被结肠上皮细胞利用和通过肝门静脉进入血循环，影响肝脏中的胆固醇代谢，降低正常和高胆固醇大鼠的血胆固醇水平［1, 2］。我们前期的动物实验和临床试验也发现：Himaize 1043抗性淀粉可降低糖尿病模型大鼠及2型糖尿病患者的血胆固醇水平［3］。本研究观察Himaize 1043抗性淀粉对正常大鼠血清胆固醇及盲肠内容物短链脂肪酸（SCFA）含量的影响，并采用实时荧光定量PCR技术检测大鼠肝组织中胆固醇7a羟化酶(CYP7A1)、肝清除细胞B1受体(SRB1)、肝低密度脂蛋白受体(LDLR)mRNA表达水平，初步探讨抗性淀粉降血胆固醇的分子生物学机制，为今后深入研究这一食物功效成分奠定基础。
1 材料与方法
11 实验动物与饲养
111 动物来源及饲料：Wister大鼠（雄性），体重180～200g，清洁级，由新疆医科大学实验动物中心提供。采用由中国医学科学院实验动物研究所配制的化学纯合饲料，分为基础饲料、低Himaize 1043饲料、高Himaize 1043饲料。Himaize 1043由国民淀粉上海有限公司提供。
112 分组与饲养：根据体重将18只大鼠随机分为3组（对照组、高RS组、低RS组），每组6只。饲养于新疆医科大学医学实验动物中心，温度20±1℃，人工昼夜（每天照明12小时），单笼喂养，自由进食饮水。实验开始三组大鼠体重、血脂浓度无组间差别。实验期共6周，每三周测一次体重，每天记录进食量。
12 测量指标与方法
121 血胆固醇
于实验0周、3周、6周大鼠尾静脉采空腹血1ml，置于无抗凝剂的EP管内，室温静置2h离心，吸取血清50ul酶法检测总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）。计算TC／HDLC。
122 盲肠内容物重量、pH值及SCFA含量的测定
实验末腹主动脉取血处死大鼠，剖开腹腔取出盲肠，称重后，取出盲肠内容物，盲肠壁用蒸馏水擦净、滤纸吸干后，再次称重，并计算肠内容物重量。称取盲肠内容物05g于5ml离心管，加蒸馏水1∶10稀释，加入3～4粒玻璃珠匀浆，离心后取上清液于精密pH计测定。另取盲肠内容物03g加蒸馏水2ml，离心后取上清液15ml，加入1∶5的磷酸05ml，离心后取上清液，经045um滤膜抽滤后，取10ul注入气相色谱仪，以2ethylbutyric acid作为内参标准，测定SCFA含量。
123 粪便重量及pH值
实验前及实验末，各收集大鼠三日粪便，自然干燥后称重。取新鲜粪便03mg，加蒸馏水1∶10稀释，匀浆后离心取上清液于精密pH计测定。
124 肝组织总mRNA抽提、cDNA合成、荧光实时定量PCR
依Trizol试剂盒（Gibco公司）说明提取肝组织总RNA，M－MLV逆转录酶盒(Promega公司)合成cDNA。PCR所用引物见表1，由上海康成生物技术公司合成。扩增产物于2％琼脂糖凝胶电泳（含05ug／ml的溴化已锭），凝胶成像系统（Vilber Louramt, France）拍照。在PCR反应体系中加入荧光染料Sybergreen，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析［4, 5］。针对待测基因（CYP7A1mRNA、LDLR mRNA、SRB1 mRNA）和管家基因(GAPDH)，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应，根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线，各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成(RotorGene 3000 Realtime PCR仪)。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。

13 统计分析
应用SPSS 110 for window软件包对实验数据进行统计分析，采用单因素方差分析，数据用X±S表示，α＝005为检验水准。
2 结果
21 动物的一般情况（见表1）
实验期间，三组大鼠饮食活动正常。实验末低RS组、高RS组与对照组相比，大鼠体重增值、摄食量无显著性差异（P＞005）。肝脏重量、盲肠重量也无显著性差异（P＞005）。
22 RS对大鼠排便量及pH值的影响（见表2）
实验末收集大鼠三日排出的粪便，自然干燥后称重，发现粪便重量随RS摄入量的增加而增加，粪便pH值随RS摄入量的增加而降低，高RS组与对照组相比有显著差异（P＜005）。低RS组与高RS组之间无差异。

23 RS对大鼠盲肠内容物重量、pH值、短链脂肪酸含量的影响（见表3）
如表3所示，三组大鼠在实验末盲肠内容物重量、pH值、各SCFA含量及总SCFA含量产生显著差异（P＜005）。RS干预组（低RS组和高RS组）与对照组相比，盲肠内容物重量、SCFA含量有显著增加，pH值显著降低（P＜005）。低RS组与高RS组相比，检测指标未产生差异。

4 RS对大鼠血脂的影响（见表4）
从表4数据可见，三组大鼠实验前，血脂各项检测指标无差异（P＞005）。实验3周末、6周末时，RS干预组TC、HDLC、LDLC及TC／HDLC比值较对照组有显著降低（P＜005），RS干预组之间TC、HDLC、LDLC也产生显著差异（P＜005）。即随着RS摄入量增加血胆固醇水平随之降低，并有剂量反应关系。

25 RS对大鼠肝脏胆固醇代谢相关基因
表达水平的影响（见表5、图2）
在进行Realtime PCR反应中，为了标准化反应体系的RNA或DNA质量，同时扩增了一内源控制物，即管家基因3磷酸甘油醛（GAPDH）。每个待测基因浓度除以管家基因的浓度，即为此基因校正后的相对含量，结果见表5。从表中数据可见，大鼠肝脏清除细胞B1受体(SRB1)、LDL受体(LDLR)、7α胆固醇脱氢酶(CYP7A1) mRNA表达水平，高RS组与对照组相比产生显著差异（P＜005），高RS组与低RS组之间未产生差异。

图2胆固醇代谢相关基因表达
3 讨论
生物化学理论认为细胞通过以下机制调节自身胆固醇的动态平衡［6］：1）抑制3羟3甲基戊二酰辅酶A（HMGCoA）还原酶，减少自身的胆固醇合成；2）减少LDL受体的合成，从而减少LDL的摄取；3）激活内质网脂酰基CoA胆固醇酰基转移酶，使游离胆固醇在胞质内酯化成胆固醇酯贮存。本研究探讨抗性淀粉（RS）干预胆固醇代谢的调节机制。许多研究已证实，RS在结肠微生物作用下发酵产生乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸（SCFA）可被结肠上皮细胞利用和通过肝门静脉进入血循环，影响肝脏中胆固醇代谢，降低正常和高胆固醇大鼠的血胆固醇浓度［7, 8］。并认为这种降胆固醇作用的机制可能是：增加粪便中胆汁酸的排泄，结肠发酵产生的丙酸抑制肝脏胆固醇合成，但其分子机制仍未十分清楚。我们于前期的动物实验和临床试验均已证实；RS可降低糖尿病大鼠及2型糖尿病患者的血胆固醇水平［3］。本研究结果也显示：RS干预组TC、HDLC、LDLC及TC／HDLC比值较对照组有显著降低（P＜005＝，RS干预组之间TC、HDLC、LDLC也产生显著差异（P＜005＝。即随着RS摄入量增加血胆固醇水平随之降低，并存在剂量反应关系。故此，本研究着重从以下方面阐述RS干预胆固醇代谢的机制。
①对胆固醇代谢关键酶的影响
胆固醇7α羟化酶（cholesterol 7 alphahydroxy2lase, CYP7A1）是胆固醇转化为胆汁酸经典途径的关键酶，胆固醇在肝脏内受其催化生成7α羟胆固醇，后者经一系列反应转化为胆汁酸。这是胆固醇代谢的主要去路。据研究报道，膳食纤维可能通过升高胆固醇7α羟化酶活性或通过抑制胆固醇合成来加速胆固醇代谢［9］。果胶不仅能抑制肝脏HMGCoA还原酶的活力，尚可阻止膳食胆固醇引起的仓鼠CYP7A1活力的下降。本研究显示：RS干预组大鼠CYP7A1 mRNA 的表达水平明显高于对照组，推测可能由此提高了CYP7A1活性，促进胆固醇转化为胆汁酸，进而加速胆固醇从机体的排泄。
②对细胞膜受体的影响
血中胆固醇主要由低密度脂蛋白（LDL）携带运输，借助细胞膜上的LDL受体介导的内吞作用进入细胞, 并在细胞内进行分解代谢，最终从血浆中清除。因此, 脂蛋白受体途径是脂蛋白在血浆中分解代谢后最终从血浆中清除的重要途径之一，并与体内胆固醇调节密切相关［10］。肝细胞表面上有LDL的特异受体，LDL通过其apoB的正电荷精氨酸残基与此受体结合。结合的LDL在细胞表面的凹陷结构内被表面膜包成小泡并与内吞体融合，由于内吞体内的酸性环境，LDL从受体上释放下来，被运送到溶酶体。在溶酶体中LDL的蛋白组分和脂类组分都被水解，后者进一步被转化成游离的胆固醇和脂肪酸。而释放下来的LDL受体重新返回到细胞表面［11］。本研究显示：RS干预组大鼠LDLR mRNA的表达水平明显高于对照组，说明RS增强了细胞LDLR mRNA的表达，进而使细胞膜LDL受体数目增多，LDL受体活性升高，清除血中胆固醇能力增强，导致血胆固醇水平下降。
人体内2／3的LDLC是通过LDL受体途径降解的，还有另一个降解途径，就是通过肝清除细胞的吸入降解LDLC。RS干预组大鼠肝脏清除细胞B1受体（SRB1）mRNA 表达水平的显著增高，说明RS增强了SRB1 mRNA的表达，增强了此受体的活性，进而也增强了清除血中胆固醇能力，导致血胆固醇水平下降。
③对胆固醇及胆汁酸吸收排泄的影响
关于RS影响胆固醇及胆汁酸吸收和排泄的机制。可能有以下几方面［12~14］ ：1）吸附或结合胆固醇及胆汁酸，增加其肠道排出；2）具有凝胶特性的RS在肠道内形成凝胶，影响胆固醇与消化酶、胆汁酸微团及肠粘膜的接触；3）加速肠蠕动，缩短肠内容物在肠道的停留期；4）结肠代谢物SCFA具有的降胆固醇作用。
本研究结果显示：肠道内乙酸、丙酸、丁酸及总SCFA含量，高RS组与对照组相比有显著增加，由此推测SCFA具有降血胆固醇的作用。据报道，丙酸盐在游离大鼠肝细胞中可抑制胆固醇合成率达45%；在大鼠体内也能象某些可溶性纤维一样降低血浆及肝胆固醇水平，加入05%的丙酸盐即可见效，同时测定肝功能及进行肝脏组织学检查未见不良影响。推测此作用可能与抑制肝脏胆固醇合成有关，尤其是抑制HMGCoA还原酶［15,］。Mather和Dawsony［16］报道喂食不同饲料的大鼠肠道丁酸含量与肠内容物转运时间呈负相关。KyuHo Han［17, 18］等研究表明丁酸含量与粪便总胆汁酸浓度呈明显正相关（r＝0874，P＜001），肠道中总SCFA水平也与胆汁酸浓度呈正相关（r＝0841，P＜001）。
本研究结果还显示：RS干预组粪便及盲肠内容物pH值显著下降，其重量显著增加。推测可能是RS增加肠道胆汁酸及固醇类物质的排泄有关，但因检测条件所限，未能进一步检测粪便及肠内容物中胆汁酸及固醇类物质的含量，有待在下一步实验中完善。
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