达能营养中心第九届学术研讨会论文集

梁惠1张秀珍1贺娟1，2逄丹1马爱国1
（1青岛大学医学院，青岛，266021；2青岛大学医学院附属医院，青岛，266003）

摘要：目的通过对D—半乳糖诱导的氧化损伤小鼠补充不同剂量海兔素，观察其对DNA损伤和机体抗氧化能力的影响。方法1、体内实验进行海兔素的抗氧化活性评价：采用昆明种小鼠60只，随机分为空白对照组，低、中、高剂量实验组、维生素E对照组和模型对照组，分别以0（注射生理盐水）、20mg／kg(低剂量组)、40mg／kg(中剂量组)、80mg／kg(高剂量组)海兔素、40mg／kg(维生素E组)灌胃及模型对照组（吐温80灌胃），2、除空白对照组外，其他五组小鼠颈背皮下注射D—半乳糖生理盐水液，剂量400mg／kg BW，建立氧化损伤动物模型，实验期为30天。3、末次给药24小时后，眼眶取血处死动物。采用单细胞凝胶电泳法测定DNA损伤状况；高效毛细管电泳法测定血浆中O6甲基鸟嘌呤（O6MeG）的含量；以试剂盒测定血浆中SOD、GSHPX活性及MDA和含量。结果海兔素各剂量组的血淋巴细胞自发性损伤无显著性差异（P＞005）。当加入10μmol／L H2O2处理后，海兔素中、高剂量组及维生素E组淋巴细胞DNA损伤与模型对照组比较显著降低，差异具有统计学意义（P＜005）；中、高剂量海兔素组及维生素E组血浆中O6甲基鸟嘌呤含量明显降低，差异具有显著性（P＜005）。海兔素各剂量组及维生素E组小鼠血中MDA的含量与模型对照组比较均显著降低，差异有显著性(P＜005)。海兔素中剂量组及维生素E组小鼠血中SOD、GSHPX活性与模型对照组比升高，差异有统计学意义(P＜005)。结论海兔素可有效地降低H2O2诱导的DNA氧化损伤和减少DNA烷化损伤产物O6MeG的生成，提高血浆中SOD、GSHPX活性，降低血中MDA含量，体内具有一定的抗氧化作用。
关键词：凹顶藻；海兔素；DNA损伤；SOD；MDA；GSHPX；抗氧化

Studies on the Antioxidant Activities of AplysinLIANG Hui1, ZHANG Xiuzhen1,HE Juan1,2, PANG Dan1,MA Aiguo1
1 Medical College,Qingdao University,Qingdao266021, China
2 Affiliated Hospital of Medical College,Qingdao University,Qingdao 266003, China

Abstract: Objective To investigate the antioxidant activities of various dosages of aplysin in mice. Design-60 kunming mice were randomly divided into 6 groups. Except for the blank group,all the mice in the other 5 groups were injected with Dgalactose at the dose of 400mg／kg bw to the abdominal cavity to induce the oxidant damage model. Each of the supplement groups was given aplysin (20,40,80 mg／Kg bw), VitE(40mg／Kg bw)respectively, while the blank group was given saline and the model group was given towen80. DNA oxidized damage was analyzed by SCGE. The content of O6MeG was measured by P／ACE. Levels of SOD, MDA, and GSHPx activies in plasma were measured with test kits. ResultsThere was a significant decreasing tendency of the oxidative DNA damage on peripheral lymphocytes in the aplysin 40mg／Kg bw, 80mg／Kg bw and VitE 40mg／Kg bw supplement group by 10μmol／L H2O2compared with blank group. The levels of O6MeG in plasma in the aplysin 40mg／Kg, 80mg／Kg supplement group and VitE (40mg／Kg) were significantly lower than the blank group (P＜005). Plasma SOD and GSHPX activities in the aplysin 40mg／Kg, 80mg／Kg and VitE（40mg／Kg） supplement groups were higher than the blank group (P＜005) . The levels of MDA in every supplement groups were significantly lower than the blank group (P＜005).; ConclusionsThe study indicated that aplysin could enhance antioxidantive activities,such as strength the activities of antioxidative enzyme SOD and GSHPx, and lower the level of MDA .Aplysin can also decreased DNA damage effectively in the oxidant damage mice.
Keywords： laurencia; aplysin; DNA damage; superoxide dismutase;  MDA; GSHPx glutathione peroxidase; antioxidants.

萜类化合物因其结构独特、生物活性强，很久以来引起人们的广泛关注［1］。近十几年来，仅从凹顶藻属中就分离出400多种萜类化合物，代表着26种类型结构骨架，是海洋萜类化合物的重要来源［2，3］。本文从三列凹顶藻提取物中分离纯化得到溴代倍半萜海兔素，并应用动物实验和分子生物学的方法，观察三个不同水平海兔素对D—半乳糖诱导的氧化损伤小鼠抗氧化能力和DNA损伤的影响，为安全、合理开发具有高度生物活性的新的海洋药物提供科学依据。1 材料与方法
11 材料
111 三列凹顶藻（Laurencia tristicha Tseng,Chang,E.Z.et.B.M.Xia）属红藻门(Rhodophyta)红藻纲(Rhodophyceae),仙菜目(Ceramiales)，仙菜科(Cermiaceae),凹顶藻属(Laurencia)，中国科学院海洋研究所提供并鉴定。倍半萜海兔素（Aplysin）由本室经反相HPLC分离纯化得到，以吐温-80溶解成所需的浓度。
112 实验动物:青岛市实验动物中心提供纯种昆明小鼠，雌雄各半，体重18-23g，随机分组。
12 方法
121 动物喂养60只昆明小鼠购进后适应性喂养一周，按体重随机分为空白对照组，低、中、高剂量实验组、维生素E对照组和模型对照组，10只／组，雌雄各半，分笼喂养。分别以生理盐水（空白对照组、）、20mg／kg(低剂量组)、40mg／kg(中剂量组)、80mg／kg(高剂量组)海兔素、40mg／kg维生素E（维生素E组对照组）及吐温-80（模型对照组）灌胃，每天1次，连续30天，同时除空白对照组外，其他五组小鼠均每天颈背皮下注射D—半乳糖生理盐水液，剂量400mg／kg BW，建立氧化损伤动物模型。
122 观察指标末次给药24小时后，眼眶取血，进行如下指标测定。
1221 淋巴细胞DNA损伤检测
12211 试剂
正常熔点琼脂糖、低熔点琼脂糖、RPMI1640（来自GibicoBRL公司），荧光剂DAPI(46Diamidine2Phenlindoledihydrochloride)由Boehringer Mannheim公司提供。Tris由Amresco公司提供；DPH(1,6Diphenyl1,3,5hexatriene)美国Sigma公司产品；小牛血清购自Gibico公司，淋巴细胞分离液由爱普生物技术公司提供，乙二胺四乙酸，磷酸二氢钠等为国产AR级试剂。
12212 仪器
低温离心机（德国Sigma 3K30型），低温冰箱，电泳仪，制冰机（英国IM20K型），荧光显微镜（日本OLYMPAS BH2型）。
12213 实验方法
采用单细胞琼脂糖凝胶电泳（singalcell gel electrophoresis,SCGE）技术。参照Colins等的方法，取新鲜抗凝血35μL加入盛有1640和小牛血清的离心管中，0℃培养30分钟，取淋巴细胞分离液100μL加到该离心管的最低层，离心，取淋巴细胞层移入磷酸缓冲液中，加入10μmol／LH2O2处理5min，离心，去上清放入冰水浴中备用。取1%融化的标准琼脂糖85μL滴在载玻片上，4℃放置510min，取1%融化的低熔点琼脂糖85μL和上述淋巴细胞混匀滴在第一层琼脂薄板上，放入溶解液中处理60min后，4℃电泳30min，中和液中和，DAPI染色，荧光显微镜下观察。每种处理观察100个细胞，计算其损伤单位［4］。
1222 血浆O6甲基鸟嘌呤（O6MeG）的测定，采用高效毛细管电泳法［5］。
仪器与试剂：
P／ACE5000型全自动毛细管电泳仪，配有紫外检测器，用Gold软件控制仪器操作数据采集（美国Beckman仪器公司提供），毛细管（75umid×57cm）。O6MeG标准品购自Sigma公司，硼砂缓冲液由Beckman公司提供。
1233 血清脂质过氧化指标测定
超氧化物歧化酶（SOD）采用羟胺法；丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸法；谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPX）采用DTNB直接法。
13 统计分析
实验结果采用SPSS110统计软件进行单因素方差分析。
2 结果
21 海兔素对DNA损伤的影响
海兔素补充组和各对照组的淋巴细胞DNA自发性氧化损伤均较低，各组间无显著性差异（P＞005），而诱发氧化损伤（加入10μmol／L H2O2）明显加重。海兔素中、高剂量组及维生素E组淋巴细胞DNA损伤与模型对照组比较显著降低，差异具有统计学意义（P＜005）；中、高剂量海兔素组及维生素E组血浆中O6甲基鸟嘌呤含量明显降低，差异具有显著性（P＜005）(表1)
22 海兔素对机体抗氧化活性的影响
结果显示，与空白对照组比较，模型组动物血红细胞SOD、及GSH—Px活力明显降低，MDA的含量升高(P＜005)，表明造模是成功的。与模型组比较，海兔素各剂量补充组及维生素E组小鼠血中MDA的含量均降低，差异有显著(P＜005)。海兔素中剂量组及维生素E组小鼠血中SOD、GSHPX活性升高，差异有统计学意义(P＜005)。(表2)

3 讨论
本研究探讨了三种不同水平海藻溴代倍半萜海兔素对D—半乳糖诱导的氧化损伤小鼠DNA损伤和机体抗氧化能力的影响。结果表明，经过4周补充，海兔素能显著降低机体的脂质过氧化水平并能提高机体抗氧化酶活性，同时，DNA诱发氧化损伤及烷化损伤程度则明显下降，说明补充海兔素对DNA损伤的防护作用与其具有抗氧化活性有关。
正常情况下，机体的氧化和抗氧化处于一种动态的平衡中。但由于各种原因如外源性毒物、电离辐射、机体自身的抗氧化防御体系受损等，均可使机体的自由基水平明显增高，导致机体的氧化应激［6］。本实验中动物连续注射D—半乳糖后，因其代谢产物半乳糖醇不能进一步代谢而堆积在细胞内，导致细胞肿胀，使动物组织细胞出现DNA损伤以及功能改变。同时，D—半乳糖具有氧化剂的作用，在体内氧化产生大量自由基，当机体自由基的产生过多或清除能力下降时，可导致细胞发生脂质过氧化、蛋白质变性、酶失活、核酸和染色体破坏。然而具有抗氧化作用的自由基清除剂可以调节氧化和抗氧化平衡，维持机体的正常功能。体内除了酶系统如SOD、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等能有效地清除自由基外，抗氧化营养素则作为第二道防线发挥抗氧化作用。海兔素作为一种具有（C5H8）n结构的萜类化合物，含有丰富的烯键，化学性质比较活泼，易发生加成反应，具有较强的还原性，因此能有效地与强氧化剂起反应，保护细胞膜和线粒体膜中的不饱和脂肪酸不被氧化，维持膜的完整性和功能，是自由基有效的淬灭剂和捕捉剂。本实验结果显示中剂量（40mg／kg）组海兔素抗氧化水平与维生素E接近，在体内具有较强的抗氧化活性。
近几年研究认为［7,8］，O6MeG是DNA受到环境致癌物（主要是烷化剂）及各种细胞毒性物质的甲基化作用而形成的代谢产物。由于O6MeG能使碱基错误地配对，从而诱导细胞的遗传物质发生变异，被认为是一种潜在的致癌物，是各种烷化损伤中对细胞危害最大的一种致突变前体物质。本实验结果表明中、高剂量海兔素能够明显降低血浆中O6甲基鸟嘌呤含量，作用与维生素E接近，说明海兔素作为一种有效的抗氧化剂对机体烷化损伤具有一定的保护作用。
单细胞琼脂糖凝胶电泳(SCGE),也称彗星电泳(cometassay)，是近年来发展起来的一种快速、敏感、简便的ＤＮＡ断裂损伤分析技术［9］。实验发现，经过4周补充，各实验组的血淋巴细胞自发性损伤无显著性差异（P＞005）。当加入10μmol／L H2O2处理后，海兔素中、高剂量补充组及维生素E组淋巴细胞DNA损伤与模型对照组比较显著降低，说明一定剂量的海兔素在体内可有效改善H2O2诱发的DNA损伤状况。
海兔素作为一种天然萜类化合物，能显著降低机体的脂质过氧化水平并能提高机体抗氧化酶活性，同时，对DNA诱发氧化损伤及烷化损伤有一定保护作用。前期工作表明，海兔素具有良好的抑瘤和免疫调节作用。因此，海兔素作为一种新型的海洋活性物质，值得进一步研究和开发。