达能营养中心第九届学术研讨会论文集

摘要: 目的研究番石榴叶水和乙醇提取物抗氧化活性,寻找高效天然抗氧化剂。方法干燥的番石榴叶分别用蒸馏水、650ml／L和950ml／L乙醇浸提，浸提液过滤、浓缩、干燥得到三种提取物。紫外分光光度法分析其中总黄酮含量，高效液相色谱和紫外可见吸收光谱法对黄酮类化合物初步鉴定；体外实验测定各提取物对羟自由基清除和脂质过氧化抑制活性。结果提取液乙醇浓度升高，提取物中总黄酮含量增加。水和乙醇三种提取物均能抑制脂质过氧化和清除羟自由基，并呈剂量效应关系；乙醇提取物抑制脂质过氧化和清除羟自由基作用强于水提取物。三种提取物抗氧化能力与其总黄酮含量有关。结论番石榴叶水和乙醇提取物均具有较强的抗氧化作用，其中黄酮类化合物可能是影响抗氧化活性的主要因素。
关键词：番石榴；植物化学物；抗氧化；黄酮类化合物

现有研究表明许多植物化学物具有很强的抗氧化活性，在机体中可发挥抗衰老、抗肿瘤、抗炎、降血糖、抗心脑血管疾病等多种药理学作用［1,2］。随着对氧自由基与疾病关系的理论研究不断深入，抗氧化剂的应用价值日益得到重视，从天然植物中提取抗氧化活性物质成为一个新的研究热点。
番石榴（Psidium guajava Linn.）属于桃金娘科（Myrtaces），别名番稔、红心果、鸡屎（矢）果和番桃等，原产于美洲热带地区，世界热带与亚热带地区均有分布，生于旷野或村庄附近。我国主要分布于广东、广西、福建、江西、四川和台湾等省、自治区，既有广泛的人工栽培，也有大量野生种类［3］。许多研究表明番石榴叶提取物可治疗轮状病毒肠炎、降血糖和局部止血等作用［4-6］。番石榴果具有较强的抗氧化作用［7］，但番石榴叶的抗氧化作用研究报道较少。本文对攀枝花地区野生番石榴叶的水和乙醇提取物的抗氧化活性及其有效成分进行了初步的研究。
1 材料和方法
11 材料
111 主要试剂950ml／L食用乙醇（成都市科龙化工试剂厂），芦丁对照品（中国药品生物制品检定所），SOD和MDA试剂盒（南京建成生物工程研究所），过氧化氢（成都市方舟化学试剂厂）聚酰胺粉（江苏临江试剂化工厂），邻二氮菲（浙江省温州市东升化工试剂厂）。
112 主要仪器UV260型紫外可见分光光度计（日本岛津）；WATERS1525型高效液相色谱仪（美国WATERS）,配有2996型二极管阵列检测器（PAD,美国WATERS）；KQ250型超声波清洗器（昆山市淀山湖检测仪器厂）。
113 实验动物及饲养环境雄性昆明种小鼠，清洁级，体重18～22g，购于四川省医学科学院实验动物中心（合格证号：医动字第24101106号）。小鼠饲养于屏障级实验动物室（配备IVC独立通气饲养笼）。
114 番石榴叶攀枝花地区野生番石榴叶，12月份采摘。
12 方法
121 番石榴叶提取物的制备依据植物化学成分传统提取方法［8］，选用不同溶剂浸提制备番石榴叶提取物。
番石榴叶采摘后立即用水清洗，通风晒干、打碎，阴凉干燥处贮存。称取碎叶三份，分别用蒸馏水于60℃、650ml／L食用乙醇于60℃、950ml／L食用乙醇于38℃浸泡48h，浸液经20层纱布过滤，滤液再经G3玻砂漏斗抽滤；滤渣再同样浸泡48h，提取滤液，反复两次。合并三次滤液。
滤液60℃水浴蒸发浓缩，粘稠状浓缩物于烘箱中60℃干燥；醇提的干燥提取物用乙醚脱脂。所得提取物研磨成粉末，即获得水提物(WE)，650ml／L食用乙醇提取物(AE65)和950ml／L食用乙醇提取物(AE95)，装于棕色瓶中，于干燥器中保存。
122 番石榴叶提取物中总黄酮含量测定
称取番石榴叶提取物约005g，用无水乙醇15ml超声提取15 min。吸取提取夜10ml,聚酰胺吸附，苯洗脱杂质，甲醇洗脱黄酮，定容至10ml。以无水乙醇作空白对照。分析液360nm波长测吸光度。据芦丁标准曲线回归方程，计算样品中总黄酮含量（以芦丁计）［9］。每种提取物平行测三次，取三次测定值的均值。
123 番石榴叶提取物中黄酮类化合物初步鉴定
参考张延之等测定黄酮方法［10］，称取适量番石榴叶提取物05g，加甲醇至10ml，超声提取黄酮20min。提取液045μm滤膜过滤，滤液经高效液相色谱柱分离后，对各分离组分在200～500nm范围内进行波长扫描分析。以芦丁作标准对照。
色谱条件：RPC18对称柱（5μm，39cm×150mm），流动相为甲醇－水－冰乙酸（40:60:2），流速10ml／min，柱温32℃。
124 番石榴叶提取物对羟自由基的影响
采用亚铁离子催化过氧化氢产生羟自由基（HO·）（Fonton反应）方法［11］。取075mmol／L邻二氮菲溶液1ml，PBS液2mL和蒸馏水1ml，充分混匀后，加075mmol／L硫酸亚铁1ml，混匀，加001%的过氧化氢1ml，于37℃温育60min，于536nm处测其吸光度，其值为AP。用1mL 30%的乙醇代替1mL过氧化氢，测得吸光度为AB。取不同浓度的提取物水溶液1ml代替1ml蒸馏水，测得吸光度为AS。按下式计算HO·清除率（d％）：
d%=AsAp〖〗ABAp×100%
125 番石榴叶提取物对脂质过氧化的影响
按文献方法［12］，取小鼠肝脏，生理盐水洗除血污，剪碎用生理盐水制成3％匀浆。取此匀浆03ml，加人不同浓度的提取物水溶液017ml、00024%过氧化氢01ml、003mmol／L硫酸亚铁01ml，37℃保温60min；然后加人20%三氯醋酸1ml及067% TBA 1ml,90℃保温15min，流水冷却，4000r／min离心20min，取上清液测定532nm测吸光度A。蒸馏水代替TBA作空白对照。按下式计算脂质过氧化抑制率（I％）：
I％= ［（A空白A药液）／A空白］×100%
2 结果
21 番石榴叶提取物中总黄酮含量
水提取物中总黄酮含量比较低；乙醇浓度增高，乙醇提取物中总黄酮含量增高（见表1）。

22 番石榴叶提取物中黄酮类化合物初步
鉴定高效液相色谱分析表明，水、650ml／L乙醇和950ml／L乙醇等三种提取物中含有四种相同组分（见图1：峰1、2、3、4），其中峰1保留时间与芦丁的保留时间相同。峰1、2、3和4分别在2556～2568nm和3554～3606nm间有最大吸收（见图2：吸收曲线1、2、3、4），峰1、峰2和峰3与芦丁的紫外可见吸收光谱的峰型、峰位和峰强度相似；而峰4的紫外可见吸收光谱的峰强度与峰1、2和3不同。该测定结果表明，番石榴提取物含有芦丁等黄酮类化合物。
23 番石榴叶提取物对羟自由基的清除能力
水、650ml／L乙醇和950ml／L乙醇提取物对反应体系中产生的羟自由基均具有一定清除作用，其清除效果随着浓度增加而增强，剂量效应关系呈直线型（见表2、表3）。羟自由基清除作用的半数有效浓度分别为063、047和058mg／L，乙醇提取物对羟自由基清除作用较大。

RT: 1 913； 2 1056； 3 1124； 4 1255
图1番石榴叶提取物高效液相色谱图
Fig1HPLC of the extracts from Psidium guajava leaves

注：1、2、3、4分别为图1中相应高效液相色谱分离组分
图2番石榴叶提取物高效液相色谱分离组分的紫外－可见光谱图
Fig2UVabsorption of the separated component of extracts from Psidium guajava leaves by HPLC

24 番石榴叶提取物对脂质过氧化的抑制
作用水、650ml／L和950ml／L乙醇提取物对反应体系中脂质过氧化具有一定抑制作用，抑制效果随着浓度增加而增强，剂量效应曲线符合一元二次方程模型（见表4、5）。脂质过氧化抑制作用的半数有效浓度分别为020、0035和018g／L，乙醇提取物对脂质过氧化抑制作用较大。

3 讨论
黄酮类化合物在240～400nm具有2个特征吸收带，Ⅰ带位于300～400nm之间，是由B环桂皮酰基体系的电子跃迁产生的吸收带；Ⅱ带位于240～285nm之间，是由A环的苯甲酰基体系的电子跃迁产生的吸收带［13］，不同类型的黄酮Ⅰ带和Ⅱ带的峰型、峰位和强度均有所不同，可以此初步判定黄酮类化合物的类型。本研究分析结果表明，番石榴叶提取物中有芦丁；有两种组分与芦丁的紫外可见吸收光谱的特征吸收峰相似，Ⅰ带最大吸收波长在3554～3606nm之间，Ⅱ带最大吸收波长在2556～2568nm之间。而芦丁的甙元是槲皮素，由此初步推测此两种组分可能是以槲皮素为甙元的黄酮类化合物。另有一种组分紫外可见吸收光谱具有黄酮类化合物特征，但与前三种不同。以上初步鉴定结果还有待用红外、质谱分析等方法进一步确认。
大量研究表明，植物中黄酮类化合物，如槲皮素、芦丁、儿茶素等B环上有临酚羟基的化合物具有较强的抗氧化活性［14,15］。本研究显示随着提取液中乙醇浓度升高，提取物中总黄酮含量升高，所含黄酮类化合物可能主要是芦丁等以槲皮素为甙元的黄酮。体外实验结果显示，650ml／L和950ml／L乙醇提取物清除羟自由基能力和对脂质过氧化的抑制能力高于水提取物，并且随剂量增加而增强。提取物成分分析显示，番石榴叶乙醇提物总黄酮含量高于水提取物，而且黄酮类化合物以芦丁等槲皮素为甙元的黄酮为主，实验结果提示黄酮类化合物可能是主要的抗氧化活性成分。
影响抗氧化活性的物质比较多。一般情况下，黄酮甙类化合物的抗氧化活性低于相应的甙元［16］，微量元素既可以作为抗氧化的辅助因子发挥抗氧化作用［17］，也可以在一定条件下诱导过氧化反应［18］。比较清除羟自由基和抑制脂质过氧化能力，650ml／L乙醇提取物半数有效浓度明显低于水和950ml／L乙醇提取物，能在较小的浓度范围内，作用效能迅速增强达到最大水平。结果提示650ml／L乙醇提取物中黄酮类化合物不是唯一的有效成分，可能存在对抗氧化能力具有协同作用的其他成分。
体外试验结果表明，番石榴叶是一种有效的天然抗氧化剂，乙醇提取物抗氧化能力较高，值得进一步对番石榴叶提取物分离提纯，从体外和体内等多方面对抗氧化作用机制进行深入研究，分析功效成分及其相互作用规律，为番石榴叶资源的开发和利用提供依据。
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