青年科学工作者论坛2008年第2期
论著
牛源乳铁蛋白体外抗HBsAg分泌的研究
李松涛 黄桂荣1 周海波 刘宁1*
东北农业大学 食品学院 乳品科学教育部重点实验室 黑龙江 哈尔滨，150030
【摘要】 目的 探讨牛源乳铁蛋白(BLF)体外抑制乙型肝炎表面抗原分泌作用，为乳铁蛋白应用于临床治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染提供理论和实验依据。 方法 以天然HBV感染HepG2细胞为模型，应用ELISA法测定细胞上清中的HBsAg水平，并用MTT法对BLF对HepG2细胞的毒性进行研究。 结果 BLF对细胞的最大无毒剂量(TD0)为3.0 g/L，半数中毒剂量(TD50)为11.08 g/L；先用HBV对HepG2细胞进行感染，再加入BLF，各浓度组BLF均对HBsAg分泌有一定抑制作用，BLF浓度 3.0 g/L时对HBsAg的抑制率达58.34%；将BLF与HBV阳性血清作用后再接种于细胞，各实验组均不能抑制HBsAg分泌，将BLF先与细胞作用后洗去BLF，在接种病毒后，BLF浓度0.5 g/L以上各组均能显著抑制HBsAg分泌，但BLF0.1 g/L组不能抑制HBsAg分泌。乳铁蛋白水解物不能抑制HBsAg分泌。 结论 牛源乳铁蛋白不能通过与HBV结合来阻断对HepG2细胞的感染，但可以通过对HepG2细胞的保护来阻断感染；当HepG2细胞感染HBV后，牛源乳铁蛋白仍可抑制HBsAg分泌，将乳铁蛋白水解后无抑制作用，说明是乳铁蛋特有结构起作用，但其机理有待深入研究。
【关键词】 牛源乳铁蛋白；体外；乙型肝炎表面抗原；HepG2细胞系；乳铁蛋白水解物
Study of inhibition effect on hepatitis B surface antigen of bovine lactoferrin in vitro
LI Song-tao, HUANG Gui-rong1, ZHOU Hai-bo , LIU Ning
(1 *Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education; College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin, Heilongjiang, 150030. 2 Staff Room of Epidemiology, Harbin Medical University, Harbin Heilongjiang, 150086)
Corresponding author: LIU Ning (Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, North East Agriculture University, Harbin, Heilongjiang, 150030)
【Abstract】 Objective To probe inhibition effect on hepatitis B surface antigen (HBsAg) of bovine lactoferrin (BLF) in vitro, so as to provide theoretical as well as experimental basis for the clinical management of HBV infection. Methods Nature hepatitis B virus (HBV) was used to infect HepG2 cell as model, HBsAg in the culture supernatant was measured by ELISA, and MTT test was used to examine cytotoxic effect of BLF. Results The maximum nontoxic dose(TD0) in HepG2 cell of BLF is 3.0 g/L, 50% toxic dose(TD50) is 11.08 g/L; After HepG2 cell were infected with HBV, every BLF test group had effect on inhibiting HBsAg to some extent. At the highest concentration(3.0 g/L) BLF was most effective, exhibiting 58.34% inhibition; Mixing BLF with HBV, then HepG2 cell were infected with them, every BLF test concentrations were not shown to inhibit HBsAg; Adding BLF to HepG2 cell, then HepG2 cell were infected with HBV after washing BLF, test groups had significant effect on inhibiting HBsAg as concentration over 0.5 g/L, but BLF concentration 0.1 g/L did not inhibit HBsAg. HBsAg wasn’t inhibited by lactoferrin hydrolysate. Conclusion BLF was shown to inhibit HBV infection into HepG2 cell by protecting corresponding cell sites rather than binding to HBV; After HepG2 cell was infected, HBsAg also could be inhibited by BLF, lactoferrin hydrolysate didn’t have this function, so it was BLF structure’s work, but the deep mechanism need to be lucubrated.
【Key words】 Bovine lactoferrin, In vitro, hepatitis B surface antigen, HepG2 cell line，Lactoferrin hydrolysate
乙型肝炎是一个严重的公共卫生问题。目前，全球有20亿人已经感染乙肝病毒，其中3.5亿人为慢性乙肝病毒感染。15%～20%的慢性感染者将死于乙肝及其相关疾病。乙肝病毒是一种包含3200个碱基对外层被脂蛋白包被的双链DNA病毒。乳铁蛋白是一种能由多种粘膜分泌的铁结合糖蛋白。研究表明，乳铁蛋白可以抗多种DNA及RNA病毒，包括人体免疫缺陷性病毒、呼吸道合胞病毒、丙型肝炎病毒、轮状病毒、脊髓灰质炎病毒、疱疹病毒、细胞巨化病毒、汉坦病毒。本研究以天然HBV转染HepG2细胞为模型，对乳铁蛋白早期抑制HBsAg分泌进行研究。
1 材料和方法
1.1 材料
牛源乳铁蛋白购自新西兰乳品总公司(纯度＞90%)；乙型肝炎病毒阳性血清(5×108拷贝数/ml, HCV、HAV均阴性)由哈尔滨医科大学第一附属医院提供；HepG2细胞系由哈尔滨医科大学公共卫生学院流行病学教研室提供；DMEM培养基购自Intitrogen公司；胎牛血清(FBS)购自中国医学科学院生物工程研究所；乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒购自上海实业科华生物技术有限公司；胰蛋白酶（1:250）购自Amresco公司；胃蛋白酶（1:10 000）购自Sigma公司；酶标仪（美国伯乐公司）；洗板机（美国伯乐公司）。
1.2 方法
1.2.1 HepG2细胞的培养
将HepG2细胞接入25 cm2培养瓶中，每瓶加入DMEM培养液(含10%FBS)5 ml，置37℃，5%CO2恒温培养箱中，次日更换含5%FBS的DMEM维持液，3～4天后传代。
1.2.2 HBV病毒转染HepG2细胞模型建立
HepG2细胞消化后以5´104个/ml接种于96孔培养板中，每孔0.2 ml，待细胞长成单层后除去培养液，将HBV阳性血清用DMEM培养基以10倍倍比进行稀释成6组浓度后以每孔0.2 ml加入培养板中，每个浓度设4个复孔并设阴性对照组，阴性对照组为健康人血清，于37℃孵育2h后扣除血清，更换维持液进行培养，应用乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒分别于48、96、144 h测定细胞上清的HBsAg的A值，并计算P/N值。其中每48 h更换培养液一次，更换前用PBS清洗3遍以除去细胞表面HBsAg残留。
P/N=样品平均A值/阴性对照平均A值(当P/N＞2.1时HBsAg为阳性)
1.2.3 乳铁蛋白水解物的制备
根据国外文献[1]我们取10gBLF溶于500ml灭菌超纯水，水浴加热至37℃后用HCl调节pH值至2.5，加胃蛋白酶300mg，胰蛋白酶300mg于37℃水浴作用1h后转至80℃水浴15min终止酶解，10000´ g离心5min，取上清冻干备用。
1.2.4细胞毒性试验
HepG2细胞以5´104个/ml接种于96孔培养板中，每孔0.2ml，待细胞长成单层后除去培养液，加入BLF浓度分别为24、12、6.0、3.0、1.5 g/L，干扰素a浓度分别为100、500、2 500 u/ml和乳铁蛋白水解物浓度分别为6.0、3.0、1.5 g/L的培养液进行培养，每个浓度设4个复孔并设空白对照组及正常细胞对照组，空白对照只加培养基，不加细胞，每两天换同浓度药一次，96小时后，应用MTT法测定细胞存活率以及半数中毒剂量(TD50)。
细胞存活率= ´100
TD50= Antilog[(logB+ ´C)]
式中，A≥50%药物浓度，B≤50%药物浓度，C= log稀释倍数
1.2.5 乳铁蛋白抑制试验
为了明确BLF对HBsAg是否有抑制作用并初步判定其作用机制，我们根据国外研究文献设计了A、B、C3种BLF处理方式[2]，试验应用96空培养板，A、B处理方式选择BLF的无毒剂量3.0 g/L及1.5、1.0、0.5、0.1 g/L共5个浓度进行抗HBsAg分泌实验，C处理方式选择3.0、1.5、1.0、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 g/L共8个浓度进行抗HBsAg分泌实验，并选用干扰素a作为阳性对照药物，具体流程如下：
A处理方式:含BLF培养液+HBV阳性血清 加入细胞37℃，作用120min后用PBS洗去，换正常维持液进行培养。
B处理方式：含BLF培养液+细胞 加入HBV阳性血清，作用120min后加正常维持液进行培养。
C处理方式：细胞+ HBV阳性血清 加入含BLF培养液进行培养。
上述3种方式处理后48小时测定细胞上清液中的HBsAg。
抑制率=
1.2.6 乳铁蛋白水解物抑制试验
按上述C处理方式，BLF水解物采用1.0、0.5、0.1 g/L 3种浓度。
1.2.7 统计学处理
采用SAS 6.12软件，对各组数据进行方差分析，分析差异显性。
2 结果
2.1 HBV病毒转染HepG2细胞模型建立
我们发现当HBV病毒浓度＞105拷贝数/ml时，天然HBV病毒可以成功感染HepG2细胞， 48及96小时后细胞上清中均有HBsAg分泌，144小时后各组上清中HBsAg均为阴性，结果见表1。由于研究表明乳铁蛋白的抗病毒作用一般发生在病毒入侵的早期[3]，因此我们选择应用天然HBV病毒转染HepG2细胞为模型进行本试验的研究，并选择病毒载量为1´106拷贝数/ml进行抗HBsAg分泌研究。
表1. HBV病毒转染HepG2细胞48、96、144h后HBsAg分泌结果
|
病毒载量(拷贝数/ml)
|
108
|
107
|
106
|
105
|
104
|
103
|
|
48h后P/N值
|
62.10
|
60.79
|
22.67
|
5.56
|
1.55
|
1.26
|
|
96h后P/N值
|
53.29
|
37.29
|
8.67
|
1.61
|
1.05
|
1.06
|
|
144h后P/N值
|
各组均＜2.1
|
|||||
2.2细胞毒性测定
我们运用MTT法检测BLF对细胞的毒性作用，经酶联检测仪测定正常细胞对照平均A值为(1.338±0.033)，并将BLF浓度分别为24 g/L、12 g/L、6.0 g/L、3.0 g/L、1.5 g/L的各孔A值(n=4)计算细胞存活率分别为26.51%、47.52%、69.34%、97.47%、100%。当BLF浓度大于6 mg/ml时对细胞有毒性作用(P＜0.01),其TD50为11.08 g/L，当浓度低于3.0 g/L时对细胞无显著毒性作用(P＞0.05)。在本试验中，我们选用的阳性对照药物干扰素a的3个浓度均对细胞无显著毒性作用(P＞0.05)，其细胞存活率均为100%，我们选用浓度为2 500 u/ml的干扰素a为阳性对照。MTT检测乳铁蛋白水解物浓度6.0 g/L、3.0 g/L、1.5 g/L、1.0 g/L的各孔A值(n=4)计算细胞存活率分别为53.03%、75.94%、96.30%、100%，当乳铁蛋白水解物浓度大于3.0g/L时对细胞有毒性作用(P＜0.01)，当乳铁蛋白水解物浓度小于1.5g/L时对细胞没有毒性作用(P＞0.05)，因此，本试验采用1.0、0.5、0.1 g/L三个浓度。
2.3乳铁蛋白抑制HBsAg分泌试验
结果显示在A处理方式中，实验组与阳性对照组无显著差异(P＞0.05)，各组P/N值均大于2.1，细胞上清液中HBsAg均呈阳性，表明BLF不能与HBV结合来抑制天然HBV对HepG2的感染。在B处理方式中，BLF浓度3.0、1.5、1.0、0.5 g/L组均能显著抑制HBsAg分泌(P＜0.05)，P/N值均低于2.1，但BLF浓度0.1 g/L组与阳性对照组无显著差异(P＞0.05)。A、B处理方式结果见表2。
表2. A、B处理方式48小时后BLF抑制HBsAg实验结果
|
Group
（g/L.）
|
|
A处理方式
|
|
B处理方式
|
|
|
`x±s P/N
|
`x±s P/N
|
||||
|
Positive control
|
1.225±0.021 24.50
|
1.036（1）±0.026 20.715
|
|
||
|
BLF 3.0
|
1.159±0.063 23.18
|
0.032（2）±0.007 0.645
|
|||
|
BLF 1.5
|
1.199±0.087 24.00
|
0.039（2）±0.011 0.780
|
|||
|
BLF 1.0
|
1.232±0.064 24.62
|
0.042（2）±0.015 0.835
|
|||
|
BLF 0.5
|
1.213±0.037 24.26
|
0.044（2）±0.009 0.870
|
|||
|
BLF 0.1
|
1.221±0.076 24.42
|
1.012（1）±0.022 20.245
|
|||
C处理方式结果见表3。结果表明实验组各浓度BLF均能显著抑制HBsAg分泌(P＜0.05)，BLF浓度3.0、1.5、1.0 g/L组之间以及浓度0.2、0.3 g/L组之间无显著差异(P＞0.05)。
试验所采用的BLF水解物各浓度组均不能抑制HBsAg分泌，各药物组与阳性对照组之间无显著差异(P＞0.05)。
表3. C处理方式48小时后BLF抑制HBsAg实验结果
|
Group
（g/L.）
|
`x±s
|
P/N
|
Inhibition%
|
|
Positive control
|
1.057±0.026
|
21.14
|
|
|
BLF 3.0
|
0.44±0.014
|
8.81
|
58.34
|
|
BLF 1.5
|
0.456±0.022
|
9.13
|
56.83
|
|
BLF 1.0
|
0.504±0.031
|
10.08
|
52.33
|
|
BLF 0.5
|
0.532±0.038
|
10.64
|
49.66
|
|
BLF 0.4
|
0.605±0.078
|
12.11
|
42.73
|
|
BLF 0.3
|
0.636±0.068
|
12.72
|
39.84
|
|
BLF 0.2
|
0.684±0.109
|
13.67
|
35.32
|
|
BLF 0.1
|
0.794±0.052
|
15.88
|
24.89
|
|
IFN-a 2500(1)
|
0.685±0.051
|
13.71
|
35.16
|
注：(1) BLF单位g/L，IFN-a单位u/ml.
3 讨论
根据国外对乳铁蛋白抗病毒的研究结果，乳铁蛋白主要在病毒感染的早期起作用，因此我们选用天然HBV病毒血清攻击HepG2细胞方式建立模型进行抗病毒研究。通过研究我们发现当HBV病毒浓度>105拷贝数/ml时，天然HBV病毒可以成功感染HepG2细胞，说明天然HBV病毒可以吸附并穿刺进入细胞，并于48 h、96 h后均可检出HBsAg，因此该模型可以满足本研究的需要，即验证BLF的早期抗病毒效果。在病毒感染144 h后无HBsAg分泌，有研究表明这可能与HepG2细胞缺少相关的蛋白酶有关[4]，或是由于HepG2细胞的丝蛋白酶抑制剂Kazal过多表达[5]。
BLF来源于食品，与现有抗乙型肝炎病毒药物相比，其安全无毒，来源广泛。本研究通过乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒对反应结果进行诊断，具有快速、灵敏、准确、简便的特点，并选取BLF对HepG2细胞的无毒作用浓度，采用A、B、C三种方式进行给药结果显示在A处理方式中，BLF各个浓度均不能抑制HBsAg分泌(P＞0.05)，说明BLF不能通过与HBV病毒结合来抑制病毒对HepG2细胞的感染。在B处理方式中，所选用的BLF浓度大于0.5 g/L均能显著抑制HBsAg分泌(P＜0.05),实验各组HBsAg分泌均呈阴性，说明BLF可以通过与HepG2细胞某位点结合来阻断天然HBV病毒对HepG2细胞的感染，这
与国外报道结果相一致[2]。McAbee等人报道BLF可以与大鼠肝脏细胞的脱唾液酸糖蛋白位点结合[6]，而该位点可能是HBV病毒的入侵位点[7]，因此这可能是BLF对HBV病毒的预
防抑制机制。在C处理方式中，BLF各浓度均能显著抑制HBsAg分泌(P＜0.05)，其中
3.0 g/L（1）组抑制率最高为58.34%，这说明当HBV已经侵入HepG2细胞后，BLF仍可以抑制HBsAg分泌，但将BLF水解后，水解物对HBsAg无显著抑制作用，说明BLF对HBsAg的抑制作用取决于BLF的空间结构而不是特有的某个肽链区域。彭志高等[8]利用时间分辨荧光免疫技术定量检测乙型肝炎表面抗原，并用实时FQ-PCR定量检测HBV-DNA，定量结果表明两者具有很好的相关性，因此我们推测BLF对HBV-DNA也有相同的抑制作用，但其抑制HBsAg分泌作用机理尚不明确，这还需要我们做进一步的研究,以确定乳铁蛋白的抗HBV机制，为其得到更广泛的应用奠定理论基础。
参考文献
1 MAMORU TOMITA, WAYNE BELLAMY, MITSUNORI TAKASE, et al. Potent Antibacterial Peptides Generated by Pepsin Digestionof Bovine Lactoferrin[J]. Dairy Sci. 1991,74:4137-4142
2 KOJI HARA, MASANORI IKEDA, SATORU SAITO, et al. Lactoferrin inhibits hepatitis B virus infection in cultured human hepatocytes[J]. Hepatol Res. 2002, 24(3):228-235
3 MARCHETTI M, LONGHI C, CONTE M P,et al. Lactoferrin inhibits herpes simplex virus type 1 adsorption to vero cells[J]. Antiviral Res,1996,29(2-3):221-231
4 LU X,BLOCK TM,GERLICH WH. Protease-induced infectivity of hepatitis
Virus for a human hepatoblastoma cell line[J].J Virol, 1996,70:2277-2285.
5 XUAN YONG LU, BLOCK T. Study of the early steps of the Hepatitis B Virus life cycle[J]. Int J Med Sci. 2004,1(1):21-33
6 MCABEE DD, BENNATT DJ, LING YY. Identification and analysis of a CA(2+) –dependent lactoferrin receptor in rat river.Lactoferrin binds to the asialoglycoprotein receptor in a galactose-independent manner[J]. Adv Exp Med Biol, 1998,443:113-121.
7 TREICHEL U, MEYER ZUMBUSCHENFELDE KH,DIENES HP, et al. Receptor-mediated entry of hepatitis B virus particles into liver cells[J]. Arch Virol, 1997,142:493-498.
8 彭志高，廖可育. 乙型肝炎病毒标志物定量检测与HBV定量关系的研究[J]. 实用预防医学, 2005,12(5):1142-1143. 收稿日期：
作者简介：李松涛，男(1981-)，在读硕士研究生，研究方向：营养学与保健食品。lisongtaoklds@126.com
通信作者：刘宁，男(1960-)，医学博士，教授，研究方向：营养与食品安全。Tel：0451-55191827， Fax：0451-55190340，E-mail：ningliu6666@yahoo.com.cn
基金项目：黑龙江省普通高校骨干教师创新能力资助计划(1055G004)
1哈尔滨医科大学流行病学教研室，黑龙江 哈尔滨，150081)
论著
食物诱导的脂代谢紊乱对机体糖代谢及炎症因子的影响
王艳莉 翟成凯[1] 陈晗 王晓飞
东南大学公共卫生学院，南京 210009
摘要：目的 通过观察大鼠脂代谢紊乱过程中糖代谢及相关炎症因子的变化，探讨脂代谢紊乱对糖代谢及炎症因子的作用。方法 20只雄性SD大鼠随机分为对照组、脂代谢紊乱组，以相应饲料连续喂养17周，检测实验前后大鼠TC、TG、HDL-C、TNF-α和IL-6，并分别于实验第0周、5周、11周、17周取血检测FPG、FINS和hs-CRP。结果 与对照组相比，脂代谢紊乱组大鼠的血清TC、TG、FINS、hs-CRP和IL-6水平显著升高（P＜0.05），ISI显著降低（P＜0.05）。结论 高脂食物成功诱导大鼠脂代谢紊乱模型的建立，脂代谢紊乱促使机体FINS升高及ISI下降，炎症因子在糖脂代谢紊乱发生发展过程中作为促发因素，直接介导胰岛素抵抗的发生，加重糖代谢紊乱。
关键词：脂代谢紊乱 糖代谢 炎症因子
中图分类号： 文献标识码：
Effects of lipid dysmetabolism on glycometabolism and
inflammatory factors in rats induced by high-fat diets
WANG Yan-li, ZHAI Cheng-kai, CHEN Han, WANG Xiao-fei, et al.
School of Public Health, Southeast University (Nanjing 210009), China
Abstract Objective To investigate the changes of glycometabolism and inflammatory factors of the lipid dysmetabolism processing in rats, and to explore the effects of lipid dysmetabolism on glycometabolism and inflammatory factors .Methods 20 male SD rats were divided into 2 groups: the control group and the lipid dysmetabolism group. After feeding the rats for17 weeks respectively, then body weight、TC、TG、HDL-C、TNF-α and IL-6 were measured, and the serum FPG、FINS and hs-CRP were detected in the 5th ,11th ,17th week respectively. Results Compared with the control group, the serum TC、TG、FINS、hs-CRP and IL-6 were increased significantly in the lipid dysmetabolism group , and the ISI levels were decreased in the lipid dysmetabolism group（P＜0.05).Conclusion The rats induced by high-fat diets were developed to the lipid dysmetabolism model , the lipid dysmetabolism impeled the organism of the FINS increased and the ISI decreased, the inflammatory factors as a precipitating factor in the development of lipid dysmetabolism processing, it can mediate the generation of insulin resistance directly and aggravate the glycometabolism ultimately.
Key words: lipid dysmetabolism ; glycometabolism ;Inflammatory factors
糖尿病是由多种病因引起的内分泌代谢疾病，长期以来患者体内血脂代谢异常被认为是继发于糖代谢紊乱。近来，McGarry和Taskinen等提出了脂代谢异常为2型糖尿病的原发性病理生理事件[1，2]，并提议将糖尿病改为“糖脂病(Diabetes Mellipitus)”。同时，多项研究也表明糖脂代谢紊乱患者体内伴随着慢性炎症反应。目前多数研究集中在机体单一糖代谢或脂代谢紊乱与炎症因子之间的关系，而由食物诱导的机体脂代谢紊乱对糖代谢与炎症因子共同作用的研究较少。本研究旨在以高脂饲料喂养大鼠诱导脂代谢紊乱，在检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的基础上，同时观察空腹血糖（FPG）、空腹胰岛素（FINS）及超敏C反应蛋白（hs-CRP）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的水平, 并以胰岛素敏感指数(ISI)判定机体胰岛素抵抗状态，探讨脂代谢紊乱对糖代谢及炎症因子的作用，为糖尿病和血脂异常的发病机制与临床防治提供参考依据。
1 材料与方法
1.1饲料配制
饲料配方参考AIN-93G国际配方[3]，高脂饲料中添加猪油、蛋黄粉、胆盐等，两组饲料主要成分及三大营养素的供能比见表1。
表1 两组饲料主要成分及三大营养素的供能比(100g)
Table1 Composition of two diets and proportion of three nutriments for energy(100g)
|
饲料类型
|
酪蛋白（g）
|
油脂(1)（g）
|
玉米淀粉（g）
|
蔗糖（g）
|
蛋黄粉（g）
|
胆盐（g）
|
胆固醇（g）
|
|
对照饲料
|
23
|
5
|
32
|
31.0
|
0
|
0
|
0
|
|
高脂饲料
|
20
|
10
|
29
|
25.3
|
5
|
0.2
|
1.5
|
|
饲料类型
|
混合矿物盐(2)（g）
|
混合维生素(3)（g）
|
纤维素（g）
|
总能量（kJ）
|
蛋白质供能比（%）
|
脂肪供能比（%）
|
碳水化合物供能比（%）
|
|
对照饲料
|
3.5
|
1
|
4
|
1566.99
|
24.98
|
12.02
|
63.01
|
|
高脂饲料
|
3.5
|
1
|
4
|
1631.42
|
21.66
|
26.41
|
51.93
|
注：(1)每100g对照饲料含有豆油5g，每100g高脂饲料含有猪油10g。
(2)混合矿物盐（g/kg混合物）：磷酸二氢钾250g,氯化钠74g,，硫酸钾46.6g,，枸橼酸钾(单结晶水)28g， 氧化镁24g，枸橼酸铁6.06g，碳酸锌1.65g，碳酸锰0.63g，碳酸铜0.3g，碘化钾0.01g，硒酸钠0.01025g，对钼酸胺0.00795g，偏硅酸钠(9个结晶水)1.45g，硫酸钾铬(12个结晶水)0.275g，硼酸0.0815g，氟化钠0.0635g，碳酸镍0.315g，氯化锂0.0174g，钒酸胺0.0066g，碳酸钙400g，加蔗糖使混合物至1000g.。
(3)混合维生素（g/kg混合物）：烟酸3g，泛酸钙1.6g，盐酸吡哆醇0.7g，盐酸硫胺素0.6 g，维生素B20.6g，叶酸0.2g，生物素0.02g，维生素B122.5g，维生素E(500IU/G)15g，维生素A(棕榈酸盐50 0000IU/g)0.8g，VitD3(40 0000IU/g)0.25，维生素K0.075g，加蔗糖至1000g。
1.2实验动物及分组
清洁级近交系雄性SD大鼠20只，体重330～350g，购自中国科学院上海实验动物中心，许可证号：SCXK（沪）2003－0003。实验前适应性喂养一周后，随机分为对照组和脂代谢紊乱组，每组10只，分别饲以对照饲料和高脂饲料。动物自由摄食，连续喂养17周。
1.3指标的检测
（1）实验期间每周称量大鼠体重，实验前后检测TC、TG、HDL-C、TNF-α和IL-6，并分别于实验第0周、5周、11周、17周检测FPG、FINS和hs-CRP，对其进行动态观察。hs-CRP试剂盒为美国Rapid Bio Lab公司产品；FINS、TNF-α、IL-6试剂盒为北京科美东雅生物技术有限公司产品；TC、TG、HDL-C试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。
（2）以ISI判定机体胰岛素抵抗状态，ISI=-log(FPG×FINS)。
1.4 数据处理
采用SAS 8.0统计软件进行数据处理，实验前后同组指标比较用配对t检验，组间比较采用DUNNET-t检验，差异显著性设定为P＜0.05。
2 结果
2.1高脂饲料对实验大鼠脂代谢的影响（表2）
表2 高脂饲料对实验大鼠血脂的影响 ( ±s，n=10)
Table2 Effects on the blood lipids of the rats induced by high-fat diets
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组别
|
时间
|
TC（mmol/L）
|
TG（mmol/L）
|
HDL-C（mmol/L）
|
|
对照组
|
实验前
|
1.86±0.31
|
1.52±0.29
|
1.16±0.14
|
|
对照组
|
实验后
|
1.88±0.28(1)
|
1.59±0.56(1)
|
1.18±0.20(1)
|
|
脂代谢紊乱组
|
实验前
|
1.87±0.31
|
1.65±0.37
|
1.18±0.19
|
|
脂代谢紊乱组
|
实验后
|
3.26±0.56(1,2)
|
2.46±0.35(1,2)
|
0.55±0.11(1,2)
|
注：（1）与实验前相比P＜0.05；（2）与对照组相比 P＜0.05。
由表2可知，实验前两组大鼠的TC、TG和HDL-C水平未见显著性差异（P＞0.05），实验后脂代谢紊乱组大鼠血清TC、TG水平显著高于对照组（P＜0.05），HDL-C水平显著低于对照组（P＜0.05），证明大鼠脂代谢紊乱造模成功。
2.2脂代谢紊乱对大鼠体重及糖代谢的影响（表3）
表3 脂代谢紊乱对大鼠体重及糖代谢的影响( ±s，n=10)
Table3 Effects on body weight and glycometabolism of the lipid dysmetabolism
|
组别
|
时间
|
体重（g）
|
FPG（mmol/L）
|
FINS（mIU/ml）
|
ISI
|
|
对照组
|
实验前
|
329.4±18.7
|
4.06±0.52
|
14.37±3.11
|
-4.04±0.31
|
|
|
实验后
|
489.8±20.9(1)
|
5.32±0.78(1)
|
26.23±7.27(1)
|
-4.89±0.40(1)
|
|
脂代谢紊乱组
|
实验前
|
329.1±17.3
|
4.17±0.57
|
16.98±4.09
|
-4.22±0.35
|
|
|
实验后
|
577.4±22.9(1,2)
|
6.49±1.62(1)
|
50.20±5.83(1,2)
|
-5.76±0.19(1,2)
|
注：（1）与实验前相比P＜0.05；（2）与对照组相比P＜0.05。
由表3可知，实验前两组大鼠的体重、FPG、FINS和ISI水平未见显著性差异（P＞0.05），实验后脂代谢紊乱组大鼠体重和FINS与对照组相比显著升高（P＜0.05），ISI与对照组相比显著降低（P＜0.05）。
2.3脂代谢紊乱对炎症因子的影响（表4）
表4 脂代谢紊乱对hs-CRP、TNF-α和IL-6的影响( ±s，n=10)
Table 4 Effects on hs-CRP、TNF-α and IL-6 of the lipid dysmetabolism
|
组别
|
时间
|
hs-CRP (ug/ml)
|
TNF-α（ng/ml）
|
IL-6（pg/ml）
|
|
对照组
|
实验前
|
104.90±15.88
|
0.52±0.16
|
41.36±11.97
|
|
对照组
|
实验后
|
186.23±46.01(1)
|
0.78±0.24(1)
|
46.99±17.73(1)
|
|
脂代谢紊乱组
|
实验前
|
106.73±12.57
|
0.54±0.36
|
42.77±15.12
|
|
脂代谢紊乱组
|
实验后
|
368.36±87.70(1,2)
|
1.15±0.71(1)
|
82.16±20.46(1,2)
|
注：（1）与实验前相比P＜0.05；（2）与对照组相比 P＜0.05。
由表4可知，实验前两组大鼠的hs-CRP、TNF-α和IL-6水平未见显著性差异（P＞0.05），实验后脂代谢紊乱组血清hs-CRP、IL-6水平显著高于对照组（P＜0.05）。
2.4 两组大鼠体重、FPG、FINS、ISI、hs-CRP的动态变化趋势（图1）
由图1可知，实验前两组大鼠的体重、hs-CRP、FPG、FINS、ISI未见显著性差异（P＜0.05），随着高脂饲料不断摄入，5周后脂代谢紊乱组大鼠体重明显上升，而对照组体重上升的幅度较小；实验第5周，两组血清FINS、hs-CRP水平均有一定程度的升高，脂代谢紊乱组血清FINS、hs-CRP较对照组上升幅度更大（P＜0.05），至第11周， FINS、hs-CRP进一步升高，而对照组自第11周起FINS较为稳定、hs-CRP缓慢上升，两组间FPG水平接近，脂代谢紊乱组ISI水平低于对照组（P＜0.05），且保持此趋势至实验结束。
注：1、体重单位为g；FINS单位为mIU/ml；hs-CRP单位为ug/ml；FPG单位为mmol/L。
2、大鼠体重及hs-CRP值均缩小10倍，H为脂代谢紊乱组，C为对照组。
图1 两组大鼠体重、FINS 、hs-CRP、FPG及ISI的动态变化趋势
Chart1 Dynamic trend on the body weight、FINS、hs-CRP 、FPG 、ISI of the rats
3 讨论
3.1饮食诱导的脂代谢紊乱动物模型的建立
脂代谢紊乱是许多代谢性疾病的一个重要特征，本实验通过喂饲大鼠高脂饲料诱导脂代谢紊乱模型，结果显示17周后脂代谢紊乱组大鼠体重显著高于对照组，血清TC、TG、FINS水平比对照组显著升高，而HDL-L显著降低，同时ISI比对照组显著降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。根据文献报告[4,5]，一般高脂饲料喂饲大鼠4周以上，血清TC、TG、和HDL-C水平与同时喂饲普通饲料的对照组大鼠血清相应的指标相比较，可以产生显著差异（P＜0.05），从而确定脂代谢紊乱造模成功。本实验中高脂饲料诱导大鼠脂代谢紊乱模型的建立，并具有高胰岛素血症的特点，与人类糖脂代谢紊乱的特点极为相似。
3.2脂代谢紊乱对机体糖代谢的影响
随着高脂饲料不断摄入，脂代谢紊乱组大鼠体重明显上升。由图1可知，脂代谢紊乱组大鼠血清FINS水平比对照组增长更快，第11周FINS进一步升高，而对照组至11周FINS水平较为稳定。实验结果显示，实验后脂代谢紊乱组大鼠ISI显著降低（P＜0.05）。Matthias B发现，在胰岛素抵抗患者血浆中，血管紧张素-2、TNF-α没有升高，而游离脂肪酸(FFA)显著升高[6]，提示FFA升高是胰岛素抵抗状态中首先出现的代谢异常。已有研究表明，脂代谢紊乱大鼠的血清及组织中FFA浓度显著升高[7]，由于过量FFA在肌肉、肝脏、脂肪组织中储留，能够降低胰岛素作用下骨骼肌和脂肪组织对葡萄糖的吸收作用，改变对胰岛素敏感的组织葡萄糖转变规律[8]，引起胰岛β细胞分泌功能异常, 因此脂代谢紊乱能够影响胰岛素的分泌，进而导致整个机体糖代谢紊乱。此外，膳食中碳水化合物成分又刺激肝脏脂肪的生成，使血清中TG水平升高，进一步导致脂代谢紊乱加重，形成恶性循环。因此，脂代谢紊乱是糖代谢紊乱的原发性病理事件。
3.3脂代谢紊乱对炎症因子的影响
本文结果显示，实验后脂代谢紊乱组大鼠血清hs-CRP、IL-6水平显著高于对照组（P＜0.05），由图1hs-CRP的动态变化趋势可见，脂代谢紊乱组hs-CRP上升的幅度显著高于对照组（P＜0.05），随着体重的增加，脂代谢紊乱组大鼠血清hs-CRP始终保持较高水平，而对照组自11周起hs-CRP缓慢上升，说明脂代谢紊乱组大鼠体内由于脂肪过多而处于低度慢性损伤状态。hs-CRP是急性期反应蛋白，为非特异性炎症标志物,其合成受激活的单核细胞、成纤维细胞及某些细胞因子如TNF-α和IL-6等的调节，而这些细胞因子均由脂肪细胞高度分泌[9]。由于高脂饲料喂养易引起大鼠脂肪堆积，使得炎症因子IL-6和TNF-α释放增多，胰岛β细胞功能受损，胰岛素生理作用被抑制，进而导致肝细胞hs-CRP合成增加[10]。同时，TNF-α和IL-6还可通过抑制胰岛素受体酪氨酸激酶活性，降低胰岛素依赖的葡萄糖转运分子Glut4的表达[11]，以及加速脂肪分解，导致FFA水平增加等，引起外周组织的胰岛素抵抗，进一步促进炎症因子hs-CRP的产生，由此推断hs-CRP和IL-6等炎症因子是糖脂代谢紊乱发生发展过程中的促发因素，可通过多种途径影响糖脂代谢紊乱的发生发展。本实验中两组TNF-α水平无显著性差异，与刘海龙等研究结果一致[12]，但脂代谢紊乱组大鼠相对于对照组大鼠呈胰岛素抵抗状态，推测在胰岛素抵抗状态的初期不伴有TNF-α的浓度升高，关于脂代谢紊乱中TNF-α介导胰岛素抵抗的机制，还需要深入的研究。
本实验中随着高脂食物的摄入，脂代谢紊乱组大鼠体内形成脂肪堆积，分解释放的炎症因子增加，直接介导胰岛素抵抗的发生，加重糖代谢紊乱，因此hs-CRP、IL-6等炎症因子是糖脂代谢紊乱发生的促发因素。临床工作中可将炎症因子hs-CRP、IL-6作为血脂异常、糖尿病等的监测指标，从而预测营养相关慢性病的发生和发展。
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