青年科学工作者论坛2008年第2期
调查研究
中国发酵乳制品市场常用益生菌菌种的安全性评估
徐进 严卫星 杨宝兰 李志刚
中国疾病预防控制中心营养与食品安全所，北京 10021
摘要：本文对中国2000年-2006年保健食品行业常用的137株益生菌菌种进行了毒力试验安全性评价，同时检测了31株益生菌对20种抗生素的耐药性，初步评估我国目前所使用的益生菌菌种安全性。结果表明：除一株鼠李糖乳杆菌外，其余益生菌菌种均为安全的。31株益生菌均对下列抗生素敏感：氨苄西林、青霉素、亚胺培南、庆大霉素、阿莫西林、阿莫西林/棒酸、加替沙星、红霉、素克林霉素、四环素、利福平和头孢噻肟；而对萘啶酮酸、万古霉素和磷霉素的耐药率较高。
关键词：益生菌 耐药性 安全性评估
中图分类号 ： 文献标识码：
Safety assessment of Probiotics in food as starters
XU Jin, YAN Weixing, YANG Baolan, LI Zhigang
National Institute of Nutrition and Food Safety, China Center for Control and Prevention, Beijing 100021, China
Abstract: In this study, we analysised the safety of 137 strains of probiotics in food as starters in China between 2000 and 2006. The study was designed to evaluate the acute oral toxicity of 137 strains to mice, and 31 of 137 strains for Minimum inhibitory concentrations(MIC) of 20 kinds of antibiotics by broth micro-dilution method. The result suggests that except a strain of Lactobacillus rhamnosus , other probiotics are non-pathogenic and safe for human consumption. 31 strains of probiotics were sensitive to Ampicillin ,Penicillin ,Imipenem ,Gentamicine, Amoxicillin, Amoxicillin/clavulanic acid ,Gatifloxacin , Erythromycin , Clindamycin, and resistant to Nalidixic acid, Vancomycine , Fosfomycin.
Key words: Probiotics, Antibiotic Susceptibility Testing, safety assessment
2002年FAO/WHO(Food and Agriculture Organization /World Health Organization)联合专家组提出了《用于食品的益生菌安全性评价指导原则》 [1]，原则指出益生菌是指活的微生物，当人体摄入足够量的时候可对人体产生有益的
作用。通常所说的益生菌主要就是指乳杆菌和双歧杆菌等乳酸菌，这些益生菌广泛应用于发酵食品中，如酸奶、乳酪，或者将益生菌直接制成菌粉食用。
传统的益生菌菌种，比如嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌在安全应用上已有很长的历史，被认为是没有致病可能性的共生微生物体。但目前新的益生菌菌种不断被开发出来进入市场，如罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌也在我国发酵乳制品市场中应用。这些新菌种能否分享传统菌种的安全性，目前引起国外专家的极大争论。鉴于此，FAO／WHO在《用于食品的益生菌安全性评价指导原则》中指出益生菌存在的可能危害包括：①益生菌进入血液引起的人体全身性感染（菌血症和感染性心内膜炎）；②益生菌产生有害的代谢活性产物对人体产生的不良反应；③食用益生菌制剂后对敏感个体的免疫刺激作用；④益生菌菌种在长期使用后所携带耐药基因的转移。针对此安全问题，本文对中国2000~2006年保健食品行业常用的137株益生菌菌种进行了实验动物毒力试验安全性评价，同时对31株益生菌进行了耐药性检测，初步评估中国目前所使用的益生菌的菌种安全性。
1 材料
1.1材料
2000~2006年中国保健食品行业常用益生菌菌种，包括49株双歧杆菌（Bifidobacterium），74株乳杆菌（Lactobacillus）和14株嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus），共计137株益生菌。
1.2培养基：MRS（Man Rogosa Sharpe）培养基(OXOID，英国)。
1.3使用的抗生素（OXOID，英国）种类及浓度范围见表1。
1.4选用中国医学科学院实验动物研究所繁殖的健康成年清洁级昆明小鼠(许可证编号为SCXK(京)2004-0001)。
表1 本实验使用的抗生素及其浓度范围
Table 1 Antibiotics used in this study
|
序号
|
抗生素名称 |
中文
|
浓度(μg/ml)
|
|
1
|
Ampicillin
|
氨苄西林
|
0.016-256
|
|
2
|
Penicillin
|
青霉素
|
0.016-256
|
|
3
|
Imipenem
|
亚胺培南
|
0.016-256
|
|
4
|
Gentamicine
|
庆大霉素
|
0.016-256
|
|
5
|
Vancomycine
|
万古霉素
|
0.016-256
|
|
6
|
Erythromycin
|
红霉素
|
0.016-256
|
|
7
|
Clindamycin
|
克林霉素
|
0.016-256
|
|
8
|
Trimethoprin/sulfamethoxazone
|
甲氧苄胺嘧啶/磺胺甲基异噁唑
|
0.002-32
|
|
9
|
Amoxicillin
|
阿莫西林
|
0.016-256
|
|
10
|
Amoxicillin/clavulanic acid
|
阿莫西林/棒酸
|
0.016-256
|
|
11
|
Gatifloxacin
|
加替沙星
|
0.016-256
|
|
12
|
Ciprofloxacin
|
环丙沙星
|
0.002-32
|
|
13
|
Chloramphenicol
|
氯霉素
|
0.016-256
|
|
14
|
Streptomyxine
|
链霉素
|
0.016-256
|
|
15
|
Tetracycline
|
四环素
|
0.016-256
|
|
16
|
Fosfomycin
|
磷霉素
|
0.016-256
|
|
17
|
Kanamycine
|
卡那霉素
|
0.016-256
|
|
18
|
Nalidixic acid
|
萘啶酮酸
|
0.016-256
|
|
19
|
Ceftriaxone
|
头孢曲松
|
0.016-256
|
|
20
|
Cephalothin
|
头孢噻吩
|
0.016-256
|
|
21
|
Cefepime
|
头孢吡肟
|
0.016-256
|
|
22
|
Norfloxacine
|
诺氟沙星
|
0.016-256
|
|
23
|
Rifampin
|
利福平
|
0.016-256
|
|
24
|
Cefotaxime
|
头孢噻肟
|
0.016-256
|
2 方法
2.1 实验动物经口灌胃法毒力试验
该方法为中国国家食品药品监督管理局保健食品评审中心规定方法。益生菌菌种接种于MRS的液体培养基中，置（36±1）℃兼性厌氧培养（48±2）h后，作为培养物原液备用，取部分培养物原液常温下浓缩5倍，作为培养物5倍浓缩液备用。小鼠80只，雌、雄各半。分别随机分为4组，剂量组设置为：培养物原液组、培养基原液空白对照组、培养物5倍浓缩液组、培养基5倍浓缩液空白对照组。将受试物以20.0ml/kg bw的剂量给小鼠灌胃，连续灌胃3d，观察7d，记录实验过程中小鼠的体重变化、中毒表现及死亡情况。
2.2实验动物腹腔注射法毒力试验
该方法为国家食品药品监督管理局保健食品评审中心规定方法。益生菌菌种接种于MRS固体培养基中，置（36±1）℃兼性厌氧培养（48±2）h后，刮取平板上的菌苔，用生理盐水制成菌悬液，浓度调整5.0×109cfu/ml。小鼠40只，雌雄各半，分别为益生菌菌悬液组和生理盐水对照组。每只小鼠一次性腹腔注射0.3ml菌悬液，连续观察7d。观察小鼠体重增长及是否有毒性反应或死亡。
2.3益生菌菌种药物敏感性试验
采用CLSI推荐的96微孔肉汤稀释法[2]。对9株双歧杆菌（Bifidobacterium）和22株乳杆菌（Lactobacillus）进行耐药性检测。质控菌株为Streptococcus pneumoniae ATCC49619。
3 结果
3.1实验动物经口灌胃法毒力试验结果:
共对我国保健食品行业2000~2006年间共计137株益生菌进行了经口灌胃法毒力试验，包括49株双歧杆菌（Bifidobacterium），74株乳杆菌（Lactobacillus）和14株嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）。结果表明: 这137株益生菌均未观察到对小鼠有毒性反应或死亡,同时也不影响小鼠体重的正常增长。
3.2实验动物腹腔注射法毒力试验结果:
对双歧杆菌BB-12 （B. lactis Bb-12）,罗伊氏乳杆菌（L. reuteri）鼠李糖乳杆菌（L. rhamnosus LR）和鼠李糖乳杆菌GG ATCC53103 (L. rhamnosus GG，LGG)4株益生菌除进行了经口灌胃法毒力试验，还对其进行腹腔注射法毒力试验检测。结果表明：双歧杆菌BB-12 ,罗伊氏乳杆菌和1株鼠李糖乳杆菌均未观察到对小鼠有毒性反应或死亡,同时也不影响小鼠体重的正常增长。
另1株鼠李糖乳杆菌以5.0×109、5.0×108和5.0×107cfu/ml三组菌悬液分别每只小鼠一次性腹腔注射0.3ml菌悬液，与生理盐水对照组相比: 5.0×108和5.0×107cfu/ml菌悬液组均未观察到对小鼠有毒性反应或死亡,同时也不影响小鼠体重的正常增长。5.0×109cfu/ml组在观察第24h内，雌雄动物均表现为精神不振、弓背和背毛竖起中毒症状；在第48h内，动物开始出现死亡，雄性小鼠死亡5只，雌性小鼠死亡6只，存活小鼠仍有中毒症状；在第72h内，雄性小鼠累计死亡8只，雌性小鼠全部死亡，累计10只，存活小鼠仍有中毒症状且持续到第4d，第5d中毒症状消失，存活至观察期末。
3.3 药物敏感性试验结果
本试验益生菌菌种对不同抗生素的最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentrations , MIC）范围及对抗生素的耐药模式见表2。
表2 益生菌菌种对不同抗生素的最低抑菌浓度（MIC）范围(μg/ml)
Table 2 Minimum inhibitory concentrations of Probiotics to different antibiotics
|
抗生素
|
耐药判定标准的MIC值
|
乳杆菌（22株）
|
|
双歧杆菌 （9株）
|
||
|
MIC范围
|
敏感率（%）
|
|
MIC范围
|
敏感率（%）
|
||
|
氨苄西林
|
≥8 （3）
|
0.016-1
|
100.00
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
青霉素
|
≥8 （3）
|
0.016-4
|
100.00
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
亚胺培南
|
≥0.5 （3）
|
0.016-0.25
|
100.00
|
|
0.016-0.25
|
100.00
|
|
庆大霉素
|
≥16 （3）
|
0.016-2
|
100.00
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
阿莫西林
|
≥8（2）
|
0.016-4
|
100.00
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
阿莫西林/棒酸
|
≥8 （2）
|
0.016-4
|
100.00
|
|
0.016-0.5
|
100.00
|
|
加替沙星
|
≥4 （2）
|
0.016-1
|
100.00
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
红霉素
|
≥8（3）
|
0.016-0.25
|
100.00
|
|
0.5-0.016
|
100.00
|
|
克林霉素
|
≥8 （2）
|
0.016-0.5
|
100.00
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
四环素
|
≥8 （2）
|
0.016-4
|
100.00
|
|
0.016-16
|
100.00
|
|
利福平
|
≥4 （2）
|
0.016-2
|
100.00
|
|
0.016-2
|
100.00
|
|
头孢噻肟
|
≥32 （2）
|
0.016-8
|
100.00
|
|
0.125-4
|
100.00
|
|
链霉素
|
≥16 （2）
|
0.016-16
|
95.45
|
|
0.016-8
|
100.00
|
|
头孢噻吩
|
≥32 （1）
|
0.125-64
|
90.91
|
|
0.125-64
|
77.78
|
|
氯霉素
|
≥4 （2）
|
0.012-4
|
90.91
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
环丙沙星
|
≥4（1）
|
0.016-8
|
81.82
|
|
0.016-16
|
100.00
|
|
诺氟沙星
|
≥16 （2）
|
0.125-128
|
77.27
|
|
2-64
|
66.67
|
|
甲氧苄胺嘧啶/磺胺甲基异噁唑
|
≥4 （2）
|
0.016-32
|
72.27
|
|
0.016-32
|
66.67
|
|
卡那霉素
|
≥16 （2）
|
0.5-64
|
68.18
|
|
0.0312-64
|
88.89
|
|
头孢曲松
|
≥32 （1）
|
0.0625-32
|
63.64
|
|
0.0312-16
|
100.00
|
|
头孢吡肟
|
≥32 （1）
|
0.0312-128
|
54.55
|
|
0.016-32
|
100.00
|
|
磷霉素
|
≥32 （1）
|
0.125-256
|
31.82
|
|
0.016-256
|
66.67
|
|
万古霉素
|
≥32 （3）
|
0.25-256
|
27.27
|
|
0.016-256
|
66.67
|
|
萘啶酮酸
|
≥32（1）
|
128-256
|
0.00
|
|
1-256
|
33.33
|
注：（1） Scientific committee on animal nutrition (SCAN) [6]；
（2）本试验判定标准[7,8]； （3）CLSI[2] ；
由表2可见，22株乳杆菌和9株双歧杆菌有相似的耐药谱，但乳杆菌对本实验所选用的抗生素的耐药性要高于双歧杆菌。22株乳杆菌和9株双歧杆菌均对下列抗生素敏感：氨苄西林、青霉素、亚胺培南、庆大霉素、阿莫西林、阿莫西林/棒酸、加替沙星、红霉、素克林霉素、四环素、利福平和头孢噻肟，且最低抑菌浓度范围均比较低。22株乳杆菌对萘啶酮酸、万古霉素和磷霉素的耐药性较高，分别为100%，72.63%和68.18%。
4 讨论
本试验评价的137株益生菌均为中国国家食品药品监督管理局批准使用的益生菌菌种。鉴于有些新菌种使用历史不长， 2003年起对这些新菌种除了进行实验动物经口灌胃法毒力试验外，还要进行实验动物腹腔注射法毒力试验，以进一步深入评价这些菌种的安全性。以后的实践也证明实验动物腹腔注射法毒力试验是非常必要的，在对一株欧洲市场应用的鼠李糖乳杆菌进入中国市场进行安全性评价时，证明了该菌高浓度腹腔注射可导致实验动物死亡。
国际上也有报道鼠李糖乳杆菌可进入人体形成菌血症。芬兰的国家疾病监测网在1990~2000年对全国520万人口中患菌血症患者血培养物分析表明[3]，有66例患者的菌血症是由益生菌引起的，其中48例为乳杆菌引起，益生菌引起菌血症的发病率约为0.15~0.76/10万人。引起菌血症的乳杆菌以鼠李糖乳杆菌为主，感染病例主要发生在免疫力低下（器官移植或癌症）及年老体弱者。鉴于此，欧盟将鼠李糖乳杆菌列入监管使用的范畴。法国的资料显示[4]，从1988~1990年内从血培养分离的微生物中乳杆菌平均为0.1%，明串珠菌为0.007%。Donohue等认为益生菌中大多数乳杆菌是安全的，而链球菌属和肠球菌属的某些菌株为条件致病菌[5]。
目前认为益生菌引起的感染多为二次感染。考虑到目前益生菌商品在货架期内的活菌数一般为106cfu/ml-108cfu/ml，且通过口服进入体内，要经过胃液和胆汁酸的杀灭作用才能到达肠道，加之人体肠道粘膜还有屏障作用，因此在健康人群中不会有大量益生菌进入血液，故鼠李糖乳杆菌对健康人群是安全的，但对免疫力低下和肠道粘膜有破损的人而言，考虑到个体的敏感性，应加强含鼠李糖乳杆菌商品的售后监测。
益生菌安全性另一个非常重要的方面是其耐药性。本研究结果显示，22株乳杆菌和9株双歧杆菌有相似的耐药谱，乳杆菌耐药性要高于双歧杆菌。
以目前我国对益生菌的管理来看，本试验评价的137株益生菌均为安全的，但应对含鼠李糖乳杆菌的商品进行售后监测。我国目前对益生菌的安全性评价手段还与国际水平有一定差距，随着越来越多的国外益生菌新菌种申报进入中国市场，国内益生菌市场的迅速增长，也附带了不安全性的风险。因此，对我国发酵乳制品市场常用益生菌菌种安全性进行风险评估，建立适合我国国情的益生菌安全性评价体系，对保证我国发酵乳制品市场的安全性有重要的意义。
参考文献
1. Food and Agriculture Organization /World Health Organization . Guidelines for the Evaluation of Probiotics in food. 2002.
2. JAMES H，JANET HINDER . Methods for Antimicrobial Dilution and Disk Susceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidious Bacreria[J] .Clin lab standards inst,2007,26(19):24-25.
3. SALMINEN MK, SOILE T . Lactobacillus bacteremia during a rapid increase in probiotic use of Lactobacillus rhamnosus GG in Finland[J]. Clin Infect Dis , 2002, 35: 45-47.
4. Adams MR. Safety of industrial lactic acid bacteria[J]. J Biotechnol , 1996, 68: 1741-1748.
5. DONOHUE DC. Safety of probiotic bacteria[J]. Asia Pac J Clin Nutr, 1996, 5: 25-28.
6. European food safety authority. Scientific committee on animal nutrition on the criteria for assessing the micro-organisms resistant to antibiotics of human clinical and veterinary importance. revised on 24 January 2003.
7. HUMMEL A S, HERTEL C. Antibiotic resistances of starter and probiotic strains of Lactic acid bacteria[J]. Appl Environ Microbiol , 2007, 73(3):730-739.
8. MOUBARECK C, GAVINI F. Antimicrobial susceptibility of bifidobacteria[J]. J Antimicrob Chemoth , 2005(1)38-44.