青年科学工作者论坛2008年第3期
中国常用益生菌菌种的耐药性研究
徐进 刘秀梅 杨宝兰 李志刚 姚景会 余冬敏
中国疾病预防控制中心营养与食品安全所，北京 10021
摘要：采用肉汤稀释法，对中国益生菌保健品行业常用的9株双歧杆菌和22株乳杆菌，共计31株益生菌进行了20种抗生素的耐药性检测。结果表明： 31株益生菌均对下列抗生素敏感：氨苄西林、青霉素、亚胺培南、庆大霉素、阿莫西林、阿莫西林/棒酸、加替沙星、红霉、素克林霉素、四环素、利福平和头孢噻肟；而对萘啶酮酸、万古霉素和磷霉素的耐药率较高。
关键词：益生菌 耐药性
Antimicrobial Susceptibility of Probiotics
Xu Jin, Liu Xiumei, Yao Baolan, Li Zhigang, Yao jinghui, Yu Dongmin
National Institute of Nutrition and Food Safety, China Center for Control and Prevention, Beijing 100021, China
Abstract: The aim of our study was to analyse the antibiotic susceptibility of 31 probiotics strains, including 9 Bifidobacterium and 22 Lactobacillus used for the manufacture of various fermented foods in China. Probiotics are tested for minimum inhibitory concentrations(MIC) of 20 kinds of antibiotics by broth dilution method on cation-adjusted Mueller-Hinton broth with lysed horse blood. 31 strains of probiotics were sensitive to ampicillin ,penicillin ,imipenem ,gentamicine, amoxicillin, amoxicillin/clavulanic acid ,gatifloxacin , erythromycin , clindamycin, and resistant to nalidixic acid, vancomycine , fosfomycin.
Key words: Probiotics, Antibiotic Susceptibility Testing
2002年FAO／WHO(Food and Agriculture Organization/World Health Organization)联合专家组提出了《用于食品的益生菌安全性评价指导原则》，原则指出益生菌是指活的微生物，当人体摄入足够量的时候可对人体产生有益的作用。通常所说的益生菌主要就是指乳杆菌和双歧杆菌等乳酸菌，这些益生菌广泛应用于发酵食品中，如酸奶、乳酪，或者将益生菌直接制成菌粉食用。
传统的益生菌菌种，比如嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌在安全应用上已有很长的历史，被认为是没有致病可能性的共生微生物体。但目前新的益生菌菌种不断被开发出来进入市场，这些新菌种能否分享传统菌种的安全性，目前引起国外专家的极大争论。鉴于此，FAO／WHO在《用于食品的益生菌安全性评价指导原则》中指出益生菌存在的可能危害包括：①益生菌进入血液引起的人体全身性感染（菌血症和感染性心内膜炎）；②益生菌产生有害的代谢活性产物对人体产生的不良反应；③食用益生菌制剂后对敏感个体的免疫刺激作用；④益生菌菌种在长期使用后所携带耐药基因的转移。由益生菌引起的菌血症，产生的有害代谢活性产物和个体免疫刺激作用发生率非常低，而某些益生菌对抗生素具有天然的耐药性，所以目前益生菌的安全性问题主要集中在由益生菌所携带耐药基因转移引起的耐药性问题，益生菌菌株的耐药性评价时目前国际上益生菌安全评价的首要内容。本文采用肉汤稀释法，对2005~2006年在中国保健品市场常用的22株乳杆菌和9株双歧杆菌的耐药性进行了分析，初步评估中国目前所使用的益生菌的耐药状况，为中国益生菌的安全性评估提供技术依据。
1 材料与方法：
1.1材料：益生菌为中国保健食品行业常用菌种，包括9株双歧杆菌（Bifidobacterium）和22株乳杆菌（Lactobacillus）。
1.2益生菌菌种药物敏感性试验
采用美国Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)推荐的96微孔肉汤稀释法，培养基为金属离子调整的MH培养基（Mueller-Hinton Agar）加裂解的马血（2.5~5% v/v）[1]。96微孔耐药板及抗生素浓度的制备由天津金章公司提供。质控菌株为CLSI推荐的Streptococcus pneumoniae ATCC49619。使用的抗生素（OXOID，英国）种类及浓度范围见表1。
表1 本实验使用的抗生素及其浓度范围
Table 1 Antibiotics used in this study
|
序号
|
抗生素名称 |
中文
|
浓度(μg/ml)
|
|
1
|
Ampicillin
|
氨苄西林
|
0.016-256
|
|
2
|
Penicillin
|
青霉素
|
0.016-256
|
|
3
|
Imipenem
|
亚胺培南
|
0.016-256
|
|
4
|
Gentamicine
|
庆大霉素
|
0.016-256
|
|
5
|
Vancomycine
|
万古霉素
|
0.016-256
|
|
6
|
Erythromycin
|
红霉素
|
0.016-256
|
|
7
|
Clindamycin
|
克林霉素
|
0.016-256
|
|
8
|
Trimethoprin/sulfamethoxazone
|
甲氧苄胺嘧啶/磺胺甲基异噁唑
|
0.002-32
|
|
9
|
Amoxicillin
|
阿莫西林
|
0.016-256
|
|
10
|
Amoxicillin/clavulanic acid
|
阿莫西林/棒酸
|
0.016-256
|
|
11
|
Gatifloxacin
|
加替沙星
|
0.016-256
|
|
12
|
Ciprofloxacin
|
环丙沙星
|
0.002-32
|
|
13
|
Chloramphenicol
|
氯霉素
|
0.016-256
|
|
14
|
Streptomyxine
|
链霉素
|
0.016-256
|
|
15
|
Tetracycline
|
四环素
|
0.016-256
|
|
16
|
Fosfomycin
|
磷霉素
|
0.016-256
|
|
17
|
Kanamycine
|
卡那霉素
|
0.016-256
|
|
18
|
Nalidixic acid
|
萘啶酮酸
|
0.016-256
|
|
19
|
Ceftriaxone
|
头孢曲松
|
0.016-256
|
|
20
|
Cephalothin
|
头孢噻吩
|
0.016-256
|
|
21
|
Cefepime
|
头孢吡肟
|
0.016-256
|
|
22
|
Norfloxacine
|
诺氟沙星
|
0.016-256
|
|
23
|
Rifampin
|
利福平
|
0.016-256
|
|
24
|
Cefotaxime
|
头孢噻肟
|
0.016-256
|
2、药物敏感性试验结果:
本试验益生菌菌种对不同抗生素的最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentrations , MIC）范围见表2。
表2 益生菌菌种对不同抗生素的最低抑菌浓度（MIC）范围(μg/ml)
Table 2 Minimum inhibitory concentrations of Probiotics to different antibiotics
|
抗生素
|
耐药判定标准的MIC值
|
乳杆菌（22株）
|
|
双歧杆菌 （9株）
|
||
|
MIC范围
|
敏感率（%）
|
|
MIC范围
|
敏感率（%）
|
||
|
氨苄西林
|
≥8 （3）
|
0.016-1
|
100.00
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
青霉素
|
≥8 （3）
|
0.016-4
|
100.00
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
亚胺培南
|
≥0.5 （3）
|
0.016-0.25
|
100.00
|
|
0.016-0.25
|
100.00
|
|
庆大霉素
|
≥16 （3）
|
0.016-2
|
100.00
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
阿莫西林
|
≥8（2）
|
0.016-4
|
100.00
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
阿莫西林/棒酸
|
≥8 （2）
|
0.016-4
|
100.00
|
|
0.016-0.5
|
100.00
|
|
加替沙星
|
≥4 （2）
|
0.016-1
|
100.00
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
红霉素
|
≥8（3）
|
0.016-0.25
|
100.00
|
|
0.5-0.016
|
100.00
|
|
克林霉素
|
≥8 （2）
|
0.016-0.5
|
100.00
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
四环素
|
≥8 （2）
|
0.016-4
|
100.00
|
|
0.016-16
|
100.00
|
|
利福平
|
≥4 （2）
|
0.016-2
|
100.00
|
|
0.016-2
|
100.00
|
|
头孢噻肟
|
≥32 （2）
|
0.016-8
|
100.00
|
|
0.125-4
|
100.00
|
|
链霉素
|
≥16 （2）
|
0.016-16
|
95.45
|
|
0.016-8
|
100.00
|
|
头孢噻吩
|
≥32 （1）
|
0.125-64
|
90.91
|
|
0.125-64
|
77.78
|
|
氯霉素
|
≥4 （2）
|
0.012-4
|
90.91
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
环丙沙星
|
≥4（1）
|
0.016-8
|
81.82
|
|
0.016-16
|
100.00
|
|
诺氟沙星
|
≥16 （2）
|
0.125-128
|
77.27
|
|
2-64
|
66.67
|
|
甲氧苄胺嘧啶/磺胺甲基异噁唑
|
≥4 （2）
|
0.016-32
|
72.27
|
|
0.016-32
|
66.67
|
|
卡那霉素
|
≥16 （2）
|
0.5-64
|
68.18
|
|
0.0312-64
|
88.89
|
|
头孢曲松
|
≥32 （1）
|
0.0625-32
|
63.64
|
|
0.0312-16
|
100.00
|
|
头孢吡肟
|
≥32 （1）
|
0.0312-128
|
54.55
|
|
0.016-32
|
100.00
|
|
磷霉素
|
≥32 （1）
|
0.125-256
|
31.82
|
|
0.016-256
|
66.67
|
|
万古霉素
|
≥32 （3）
|
0.25-256
|
27.27
|
|
0.016-256
|
66.67
|
|
萘啶酮酸
|
≥32（1）
|
128-256
|
0.00
|
|
1-256
|
33.33
|
注：（1）Scientific committee on animal nutrition (SCAN) [9]；
（2）本试验判定标准[2,3]；
（3）CLSI[1] ；
由表2可见，22株乳杆菌和9株双歧杆菌有相似的耐药谱，乳杆菌对本实验所选用的抗生素的耐药性要高于双歧杆菌。22株乳杆菌和9株双歧杆菌均对下列抗生素敏感：氨苄西林、青霉素、亚胺培南、庆大霉素、阿莫西林、阿莫西林/棒酸、加替沙星、红霉、素克林霉素、四环素、利福平和头孢噻肟。22株乳杆菌对萘啶酮酸、万古霉素和磷霉素的耐药性较高，分别为100%，72.63%和68.18%。
3、讨论
益生菌安全性一个非常重要的方面是其耐药性。本研究结果显示，22株乳杆菌和9株双歧杆菌有相似的耐药谱。在2005年检测的中国常用发酵乳制品的12株益生菌中，耐药的主要模式为丁胺卡那霉素-卡那霉素-萘啶酮酸-复方新诺明-甲氧苄胺嘧啶-万古霉素[4]，和本次实验的结果相似。从国内外资料来看，益生菌均耐受多种抗生素。Katla 等对挪威市场的189株乳酸菌的耐药检测结果表明[5]：189株乳酸菌均对下列抗生素敏感：氨苄西林、青霉素G、头孢噻吩、万古霉素、杆菌肽、庆大霉素、链霉素、红霉素、四环素、氯霉素和环丙沙星。Temmerman等对欧洲益生菌产品市场分离到的187株益生菌的耐药检测表明[6]：对卡那霉素，万古霉素、四环素、青霉素G、红霉素和氯霉素的耐药率分别为79%、65%、26%、23%、16%和11%，68.4%的菌株具有多重耐药特性。Lim等对韩国市场37株双歧杆菌的耐药检测结果表明[7]：大部分双歧杆菌耐受头孢噻吩、卡那霉素、新霉素、萘啶酮酸和多黏菌素B，部分双歧杆菌耐受庆大霉素和链霉素。Masco等对比利时市场100株乳酸菌的耐药检测结果表明[8]：所有菌株均对阿莫西林、氯霉素、红霉素和万古霉素敏感；其中11株双歧杆菌均耐受庆大霉素和多年菌素B。综合国内与国际资料来看，无论是乳杆菌还是双歧杆菌，萘啶酮酸和卡那霉素的耐药率较高，其他抗生素的结果则有很大差异，不同的益生菌菌种显示了各自复杂的耐药特性。这主要是因为，2007年CLSI才出版了乳酸菌耐药试验的标准[1]，在此之前由于各实验室所采用的培养基，使用的抗生素，检测的方法和质控菌株不同，使得不同试验室间的数据也不同。本研究所采用的方法为2007年CLSI出版的乳酸菌耐药试验的标准。
对益生菌耐药性的管理上不同国家及国际组织也不尽相同。美国FDA对益生菌的耐药性没有特别规定，把益生菌类发酵食品作为GRAS (generally recognized as safe)级来看待，需要明确的是美国FDA并不是将益生菌菌株本身做为GRAS 来看待，而是指益生菌发酵的食品。益生菌及其制品在欧洲使用历史悠久并销量巨大，因此欧盟食品安全局提出了Qualified Perception of Safety(QPS)概念[9]。其内涵是既不等同于有长期使用历史的益生菌就是安全的观点，也不能将益生菌的安全性评价规定的过于严格而阻碍益生菌的市场发展，就益生菌的耐药性而言，规定益生菌不得携带可转移的耐药基因。中国的益生菌评审机构目前尚未对益生菌耐药性作出明确的规定。从欧盟食品安全局对益生菌安全性的管理来看，如何评价益生菌的耐药特性对人群健康的影响将是对益生菌进行危险性评估最重要的内容之一。
5 参考文献
1. JAMES H，Janet HINDER， et al. Methods for antimicrobial dilution and disk susceptibility testing of infrequently isolated or Fastidious Bacreria[M] .Clinical and laboratory standards institute..2007,26(19):24-25.
2. ANJA S. Hummel, Christian Hertel, et al. Antibiotic resistances of starter and probiotic strains of Lactic acid bacteria[J]. Applied and Environment Microbiology, 2007, 73(3):730-739.
3. MOUBARECK C, GAVINI F, et al. Antimicrobial susceptibility of bifidobacteria[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2005(1)38-44.
4. 徐进,刘秀梅. 国内保健食品常用益生菌株的耐药性分析[J]. 中国食品卫生杂志, 2005,17（2）:108-112.
5. KATLA AK, KRUSE H, et al. Antimicrobial susceptibility of starter culture bacteria used in Norwegian dairy products[J]. International Journal of Food Microbiology, 2001;67(1-2):147-52.
6. TEMMERMAN R, SWINGS J, et al. Identification and antibiotic susceptibility of bacterial isolates from probiotic products[J]. International Journal of FoodMicrobiology, 2003; 81(1):1-10.
7. LIM K S , HUH S C, et al. Antimicrobial Susceptibility of Bifidobacteria[J]. Journal Dairy Science, 1993,76:2168-2174.
8. MASCO L, HOORDe K Van, et al. Antimicrobial susceptibility of Bifidobacterium strains from humans, animals and probiotic products [J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2005:185-94.
9. European food safety authority. Scientific committee on animal nutrition on the criteria for assessing the micro-organisms resistant to antibiotics of human clinical and veterinary importance. revised on 24 January 2003.