达能营养中心第十届学术研讨会论文集

葛声¹ 邝胜利¹ 蔡东联²

 

(1.上海交通大学附属第六人民医院营养科，上海,200233；2.第二军医大学附属长海医院，200433)

 

摘要:目的研究β-葡聚糖对CCl4诱导的大鼠肝纤维化组织Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA的表达的影响，及其对信号传导分子smad3 mRNA、smad7 mRNA表达的调控。方法80只雄性SD大鼠，70只腹腔注射40% CCl4油溶液制作肝纤维化模型，10只正常对照。8w后随机处死3只肝纤维化模型组大鼠，经肝组织HE染色证实肝纤维化形成。肝纤维化模型组大鼠随机分为β葡聚糖治疗组15只，以1ml/100g·BW的5% β葡聚糖生理盐水溶液灌胃；秋水仙碱治疗组用200ug/kg秋水仙碱生理盐水溶液灌胃，阳性对照组和正常对照组以10ml/kg生理盐水灌胃。干预8w。组织学检查观察肝组织炎症及纤维化程度，荧光定量PCR检测肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA及smad3、smad7 mRNA的表达。结果组织学检查结果表明阳性对照组肝脏纤维化程度明显高于β葡聚糖组；荧光定量PCR检测表明，阳性对照组大鼠肝组织 Ⅰ、 Ⅲ型胶原mRNA相对表达量明显高于正常组（p＜0.05）；β葡聚糖组大鼠肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA相对表达量明显低于阳性对照，（p＜0.05）。阳性对照组大鼠肝组织smad3 mRNA相对表达量明显高于正常组（p＜0.05）；而smad7 mRNA相对表达量明显低于正常组（p＜0.05），β葡聚糖组肝组织smad3 mRNA相对表达量低于阳性对照组，而smad7 mRNA相对表达量高于阳性对照组（p＜0.05）。结论口服β葡聚糖可减少CCl4诱导的SD雄性大鼠肝纤维化组织中胶原的表达，对肝纤维化有预防作用。其作用机制可能与调节smad3与smad7之间的失衡相关。

关键词：β-葡聚糖；肝纤维化；Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA smad3 mRNA smad7 mRNA

β（1→3）（1→4）D-葡聚糖（β-葡聚糖）是一种非淀粉类水溶性植物多糖,主要存在于大麦和燕麦麸皮中。其基本结构是D葡萄糖以β（1→3）（1→4）糖苷键连接而成的线性多糖，是一种低聚糖，属于可溶性膳食纤维。1997年，FDA指出每日饮食中含有3g以上β葡聚糖可降低血脂并能减少心血管疾病发生的危险[1]。实验研究证实，葡聚糖具有保护受损肝细胞的作用[2]。但β葡聚糖是否具有防治肝纤维化的作用，至今未见报道。

本研究观察了β葡聚糖对四氯化碳诱导SD雄性大鼠导致的肝纤维化的疗效。采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）测定Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA的表达，并对信号传导分子smad3、smad7 mRNA表达的调控情况进行了检验，探讨β葡聚糖对实验性肝纤维化的治疗作用及其可能机制。

1材料与方法

1.1 动物分组及造模处理

清洁级雄性健康SD大鼠80只，体重270±14g（220～285g）。购自上海西普尔-比凯实验动物有限公司，许可证号：沪动合格证字152号。

80只SD雄性大鼠，正常喂养1周后随机分为2组：即正常对照组及肝纤维化模型组。模型组70只，腹腔注射CCl4造模，剂量：0.2ml/100g，2次/w，首次剂量未加倍。对照组10只，采用茶油腹腔注射，剂量同40% CCl4茶油溶液，每周2次。造模后第8w随机抽取3只模型组大鼠，以氯胺酮腹腔注射麻醉后取门静脉血5ml，分离血清，置-20℃保存待测；肝脏右叶相同部位肝组织经苏木精-伊红染色，证实肝纤维化形成。造模过程中，模型组大鼠死亡22只。

 

1.2 干预实验分组及方法

将肝纤维化大鼠45只，随机分为阳性对照组15只，秋水仙碱治疗组15只，β葡聚糖治疗组15只，正常对照组10只。实验期间，β葡聚糖组每天用浓度为5%的β葡聚糖（江苏无锡新光化工有限公司提供）生理盐水溶液灌胃，剂量1ml/100g·BW；秋水仙碱组，用200ug/kg的秋水仙碱（西双版纳药业有限责任公司，产品批号：国药准字H53021369，0.25mg/片）生理盐水溶液灌胃；阳性对照组和空白对照组用生理盐水灌胃，剂量10ml/kg。干预8w后所有大鼠氯胺酮麻醉后门静脉采血，分离血清，-20℃保存待测，肝脏右叶相同部位取肝组织，一部分固定于10%中性甲醛中，一部分肝组织迅速置于液氮中保存。干预期间肝纤维化阳性组大鼠死亡1只、秋水鲜碱组死亡4只、葡聚糖组死亡2只。

2观察指标及测定方法

2.1 肝组织HE染色

右叶肝组织10%甲醛固定，石蜡包埋、切片，常规HE染色。光镜下观察病理变化。按照中华医学会传染病与寄生虫病学分会及肝病学分会2002年9月联合修订的《病毒性肝炎防治方案》[3]中慢性肝炎纤维化分期标准，根据肝结构破坏范围、程度和肝微循环影响的大小，分为1～4期（S1～4）。

2.2 肝组织胶原纤维染色

肝组织石蜡切片，常规脱蜡至水；Weigert苏木素液染5~10min，自来水冲洗，0.5%盐酸乙醇分化，蒸馏水冲洗，Van Gieson液染1~5min，95%乙醇分化脱水；无水乙醇脱水，二甲苯透明后，中性树胶封固。光镜下观察。

2.3 血清转氨酶检测

Beckman全自动生化分析仪检测血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）水平。

2.4 荧光定量PCR检测肝组织内Ⅰ型、Ⅲ胶原mRNA以及smad3、smad7 mRNA的表达

荧光定量PCR检测肝组织内Ⅰ型、Ⅲ胶原mRNA 以及smad3、smad7mRNA表达，设计合成Ⅰ型、Ⅲ型胶原及smad3、smad7的引物与探针，由广州达辉生物科技有限公司设计合成。引物序列见表1。所有标本培养24h后，经细胞mRNA抽提、逆转录cDNA后进行荧光定量PCR检测，反应体系：5×定量PCR反应缓冲液10μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，dNTPs0.5μL，Tag酶2μL，cDNA模板5μL。荧光定量PCR反应条件：93℃ 2min；93℃ 45s，55℃ 1min，10个循环；93℃ 45s，55℃ 1min，30个循环。产物分析：以βactin作为内参照，测定Ⅰ型、Ⅲ胶原及smad3、smad7的相对表达量。每个样本的Ⅰ型、Ⅲ型胶原的相对mRNA表达水平能直接用样品各自得内源控制物βaction（管家基因）表达标准化加入的初始RNA量。每个样品中靶基因Ⅰ型、Ⅲ型胶原、samd3、smad7的相对mRNA表达水平采用以下公式进行计算：相对mRNA表达=2-ΔCt。其中ΔCt值=靶基因Ct值-管家基因βaction Ct值。

 

表1引物序列

2.5 数据分析

数据用仪器自带软件：ABI Prism 7300 SDS Software进行分析。

2.6 统计学处理

计量资料以x-±s表示，多组间均数用LSD单因素方差分析两两比较，计数资料采用x2检验。SPSS10.0软件包进行统计分析。

3结果

3.1 肝脏标本病理改变

正常对照组大鼠肝脏，颜色深红，表面光滑，边缘锐利，质地较软；脾脏暗红，质软。肝纤维化组大鼠肝脏增大，颜色浅，边缘钝，质地硬，表面有粗颗粒状表现，与周围器官粘连广泛。

肝组织HE染色见正常组肝组织肝索结构清晰，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝组织内无脂肪空泡。肝小叶结构完好，肝细胞排列无异常，少数肝细胞脂肪变性，纤维组织无明显增生；肝纤维化大鼠门静脉增粗，脾脏明显肿大，呈暗红色，肝细胞肿胀，肝组织内弥漫性水样变性和脂肪变性，肝窦及中央静脉明显扩张，肝索排列紊乱，门管区及肝小叶内可见明显的灶性淋巴细胞浸润，间质细胞大量弥漫性增生，形成细胞纤维间隔或纤维细胞间隔，分隔包绕肝细胞，有假小叶形成；β葡聚糖组及秋水仙碱组肝细胞坏死较轻，灶性炎细胞浸润，可见再生肝细胞汇管区纤维组织增生，部分肝组织有假小叶形成，见图1。胶原纤维染色可见各组肝脏纤维增生的情况，见图2。

 

图1各组大鼠肝组织的病理检查

（HE染色×200）

 

Pathological analysis of SD rats liver tissue

(HE ×200）

A: Control group

B: Hepatic group

C: Colchicine treatment group

D: βglucan treatment group

 

图2各组大鼠肝组织的胶原特染检查

Pathological analysis of SD rats liver tissue(Van Gieson,×100）

A: Control groupB: Hepatic groupC: Colchicine treatment groupD: β-glucan treatment group

 

3.2 血清转氨酶水平

阳性对照组大鼠血清ALT、AST均较正常对照组升高（P＜0.05）；秋水仙碱治疗组及β葡聚糖治疗组均较阳性对照组下降（P＜0.05）。见表2。

3.3 大鼠肝纤维化分级的变化

肝纤维化分期显示，与正常对照组相比，肝纤维化阳性组、β葡聚糖组与肝纤维化阳性对照组纤维化程度明显增高，差异有统计学意义（p＜0.05）；与肝纤维化阳性对照组相比，β葡聚糖组与秋水仙碱组肝纤维化程度均明显减轻，差异有统计学意义（p＜0.05）。说明β葡聚糖对肝纤维化大鼠具有治疗作用。各组大鼠肝纤维化分期情况见表3。

 

表2各组大鼠血清转氨酶水平比较

表3各组大鼠肝纤维化分期

 

3.4 大鼠肝组织内Ⅰ型、Ⅲ胶原mRNA以及smad3、smad7mRNA相对表达量

与正常对照组比较，肝纤维化阳性大鼠肝脏Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA以及smad3 mRNA相对于其管家基因βactin表达量明显升高，smad7 mRNA则明显下降；相对于肝纤维化阳性对照组，β葡聚糖组大鼠肝脏Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA以及smad3 mRNA相对于其管家基因βactin表达量明显下降，smad7 mRNA则明显升高（p＜0.05），见表4。

 

表4各组大鼠肝组织Ⅰ型、Ⅲ胶原mRNA以及smad3、smad7 mRNA相对表达量

4

讨论

β-葡聚糖是禾谷类植物籽粒胚乳和糊粉层细胞壁的主要成分[4]，在燕麦胚乳和糊粉层细胞壁成分中占85%以上。β-葡聚糖具有黏度高，在一定条件下具有凝胶性[5]和乳化稳定性[6]的特点。β葡聚糖对人体具有重要的生理调节功能。研究显示，其能够有效降低高胆固醇血症患者血液胆固醇水平[7]、调节糖尿病患者血糖及糖代谢[8]以及增强免疫功能的作用。本实验采用 CCl4腹腔注射造成SD雄性大鼠肝纤维化模型之后，给予大鼠β葡聚糖灌胃，经肝组织病理学检查发现肝纤维化分级和胶原纤维沉积均较未施予任何治疗措施的肝纤维化阳性对照组大鼠明显减轻（p＜0.05），提示β葡聚糖对CC14所诱导的大鼠肝纤维化具有一定的治疗作用。作者认为β葡聚糖对肝纤维化的防治机制可能与以下因素有关：

 

4.1 β-葡聚糖可以调整肠道菌群，促进益生菌生长[9]。肝硬化后肠系膜动脉扩张、管壁通透性增加，肠道蠕动功能减退，容易发生细菌过度生长，导致内毒素血症[10]。循环内毒素又可进一步损伤肠粘膜屏障，导致细菌易位，形成恶性循环，加重肝损伤。β葡聚糖在肠道中可以发酵，产生短链脂肪酸，为结肠细胞提供能量，促进双歧杆菌在肠道中定植，抑制大肠杆菌的生长，修复受损肠粘膜，保护其屏障功能[11]，从而减轻毒素入血后对肝脏的损伤。

4.2 β-葡聚糖具有免疫调节作用。燕麦β葡聚糖可使小鼠淋巴细胞增殖，增强小鼠抵抗细菌侵袭的能力；可刺激小鼠腹膜巨噬细胞释放肿瘤坏死因子(TNF－α)和白介素-1及巨噬细胞p338d1的释放[12]。灌胃或肠外注射β葡聚糖，小鼠血清免疫球蛋白数量明显增加[13]。

4.3 β-葡聚糖下调Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA，减少胶原纤维的合成，而达到防治肝纤维化的作用。采用实时荧光定量PCR研究β葡聚糖对肝纤维化大鼠肝脏Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA表达影响的研究结果表明，肝纤维化时，实验大鼠Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA表达均明显高于正常对照组。肝纤维化是肝脏细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的合成与降解失衡导致其过度沉积的结果[14]。ECM包括胶原、非胶原蛋白以及蛋白聚糖三大成分，目前已确定有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、ⅪⅤ、ⅩⅧ型7种肝内胶原。在纤维化早期，Ⅲ型胶原较多，纤维化晚期则表现为Ⅰ型胶原含量较多[15,16]。肝星状细胞（HSC）是产生胶原的主要来源。正常情况下，HSC处于静息状态，肝脏受损后，HSC被激活转化为成纤维样细胞，其胞浆脂滴丢失、形态改变、表达平滑肌α肌动蛋白和多种细胞因子及其受体，并大量增殖，合成以Ⅰ型和Ⅲ型胶原为主的多种ECM。β葡聚糖下调了Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA，从而减少胶原纤维的合成，达到防治肝纤维化的作用。

4.4 本次实验提示β-葡聚糖通过调节TGF β-smads信号转导系统发挥抗肝纤维化作用。β葡聚糖治疗后，肝纤维化大鼠内smad7 mRNA表达丰富并接近正常组，而samd3 mRNA表达减少，说明β-葡聚糖能抑制smad3 mRNA而明显促进smad7 mRNA的表达，后者负反馈调节TGFβ的胞内信号传递，阻止HSC的活化及信号放大，阻止TGF-β1刺激所致的HSC活化及胶原合成有关。TGFβ是目前已知的最重要的致肝纤维化的细胞因子之一，在肝脏中主要由肝星状细胞、Kupffer细胞等多种细胞产生，能促进HSC活化，并分泌Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原，抑制ECM降解，抑制肝细胞DNA合成因而抑制肝细胞再生[17]。TGF βsmad信号通路是肝纤维化时主要的信号转导通路[18]，TGFβ1激活HSC的信息转导经过丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶受体及其下游效应分子，即Smads蛋白家族，启动胶原基因表达[19]。Smads蛋白是TGFβ1超家族的信号在细胞内转导的一组蛋白。其中，与受体结合的是Smad2、Smad3，具有抑制作用的是Smad6、Smad 7，阻断或干扰该信号转导通路有可能阻止肝纤维化进程[20]。TGF与其受体结合后，使其下游信号通道蛋白smad2、3磷酸化，与smad4形成异源寡聚体复合物，该复合物转移到胞核介导TGFβ的生物学效应[21]。抑制型smad6、smad7是细胞中TGFβ1型受体拮抗蛋白，阻止smad2、3磷酸化而阻断TGFβ的信号转导过程，在TGFβ信号转导中构成负反馈调节环路[22]。

本研究结果初步揭示了β葡聚糖具有防治实验动物肝纤维化的作用，探讨了其对在肝纤维化大鼠Ⅰ、Ⅲ胶原mRNA的调控作用以及对TGFSmad 信号通路的调控作用。为进一步研究食物营养因素在肝纤维化防治中的作用提供了实验依据。

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