达能营养中心第十届学术研讨会论文集

杨佳娟 白洁 胡科 王永超 马文娟 罗琼

(武汉大学公共卫生学院营养与食品卫生学系，武汉，430071)

 

摘要：目的探讨葡萄汁对人宫颈癌Hela细胞生长与凋亡的影响及其机制。方法白藜芦醇及不同浓度葡萄汁作用于宫颈癌Hela细胞48h；采用生长曲线及噻唑蓝（MTT）法检测葡萄汁、白藜芦醇对宫颈癌Hela细胞的增殖抑制作用；流式细胞仪检测细胞凋亡峰；彗星实验测定细胞的DNA链断裂情况，分析DNA的损伤作用；检测凋亡相关基因Bcl－2、Bax蛋白表达情况。结果本实验设浓度为16、32、64μl/ml的葡萄汁随浓度的增高，抑制人宫颈癌Hela细胞增殖作用明显；DNA迁移长度与彗星细胞拖尾率逐渐增高；诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡作用增强；诱导促凋亡基因Bax表达作用增强。32、64μl/ml葡萄汁组含白藜芦醇浓度较白藜芦醇组低，但作用强。结论葡萄汁可抑制人宫颈癌Hela细胞增长，诱导其细胞凋亡，能上调促凋亡基因Bax的表达,下调抑凋亡基因Bcl2的表达，并且存在包括白藜芦醇的各植物化学物间的交互作用。

关键词：葡萄汁；白藜芦醇；人宫颈癌Hela细胞；交互作用

 

Study on the effect of juice of grape on the apoptosis of

human cervical carcinoma Hela cellYang JiajuanBai JieHu KeWang YongchaoMa WenjuanLuo Qiong

(Department of Nutrition and Food Hygiene, School of Public Health，Wuhan University，Wuhan 430071)

 

Abstract:ObjectiveTo study the effect of juice of grape on the apoptosis of human cervical carcinoma Hela cell. MethodDifferent concentrations of juice of grape and resverotral were added to Hela cells which cultured in vitro. MTT assay was adopted to investigate the cytotoxic effect on Hela cel1. Single cell gel electrophoresis was used to measure the breakage of DNA strand of Helacell.Cell apoptosis was analyzed by flow cytometry, and then the expression of apoptosis relative gene Bax was determined as well. ResultsIn this study , the concentrations(16、32、64μl／ml)of Juice of grape as the concentration of tomato juice high could inhibit obviously the proliferation of Hela cell;the length and rate of DNA tail were significantly higher; The apoptotic peaks were increased;the expression of Bax gene also increased. The effect of 32, 64μl／ml grape juice is stronger than that of the resverotral group while the content of resverotral is fewer than that of the positive group. ConclusionJuice of grape could inhibit the proliferation of Hela cel1 and induce apoptosis of Hela cell，which was related to the modulating of expression of Bax gene, and also make it sure that there is synergistical anticancer effect of phytochemicals.

Keywords: grape juice;resverotral; human cervical carcinoma Hela cell,synergistical effect

 

宫颈癌的发病率占我国女性生殖系统恶性肿瘤的首位，成显著增长的趋势,其发病年龄也在显著的年轻化。在临床病理上，宫颈癌的发生是由子宫颈上皮内瘤变，原位癌，早期浸润癌,浸润癌的从量变到质变的连续发展过程，其间历经10年或更长的可逆转癌前病变阶段[1]。因此进行宫颈癌的早期预防对于减少其发生和降低其危险性显得极为重要。葡萄是一种世界性的水果，来源广泛。其中富含的植物化学物单体白藜芦醇，有研究表明能对人体具有抗多种癌细胞生长增殖的生物学活性，药用价值很大。除此之外，葡萄中还含有其他的植物化学物如原花青素、槲皮酮等，在保护人体健康的作用中也不可忽略。本研究旨在将葡萄制备成番茄汁，通过与植物化学物单体白藜芦醇比较研究，探讨葡萄汁对人宫颈癌Hela细胞生长的作用及其可能机制，确认果汁中植物化学物交互作用的存在，为果蔬汁作为人类便于接受、能长期坚持饮用、并可以有效预防和辅助治疗宫颈癌的饮品提供科学依据。

1对象和方法

1.1 研究对象

1.1.1 葡萄汁的制备：选用市售新疆成熟7~9月巨峰葡萄，洗净后用双蒸水冲洗三次，用纱布拭去表面水分，称重，匀浆压榨出汁，六层纱布包裹挤汁，过滤除菌，得淡黄色葡萄汁，其汁中白藜芦醇的含量按8mg/100ml计[2]。

1.1.2 白藜芦醇：购于湖南省洪江华光生物有限责任公司，为纯度99%标准品。

1.1.3 人宫颈癌Hela细胞株：购于武汉大学典藏中心，用在含10%新生牛血清的DMEM培养液中，于37℃，含5%CO2培养箱中培养。

1.2 实验分组

实验设6个组：

（1）空白对照组：仅含培养液；

（2）溶剂对照组：加入含PBS、0.5%DMSO的培养液；

（3）葡萄汁低剂量实验组：终浓度为16μl/ml，白藜芦醇的含量约为0.128μg/ml；

（4）葡萄汁中剂量实验组：终浓度为32μl/ml，白藜芦醇的含量约为0.256μg/ml；

（5）葡萄汁高剂量实验组：终浓度为64μl/ml，白藜芦醇的含量约为0.512μg/ml；

（6）阳性对照组：白藜芦醇用DMSO溶解后于培养液中的终浓度为4.56μg/ml。加入PBS使各组终体积一致，同时用饱和NaHCO3调节PH值。

1.3 细胞抑制实验

取对数生长期的Hela细胞接种于96孔培养板中（5×103/孔）培养24h，待细胞贴壁后加入不同浓度的葡萄汁、白藜芦醇，总体积为每孔200μl，每一剂量设6个复孔，于48h后，每孔加入5mg/ml MTT 20μl继续孵育4h，弃去培养液，每孔加入DMSO100μl，充分混匀振荡10min，酶标仪在570nm处测吸光度值（A），实验重复4次。计算平均A值和抑制率：抑制率（inhibitory rate, IR）=[（1－实验组A值）／对照组A值]×100%。

1.4 彗星实验

取对数生长期的PC3细胞1×104个/ml接种于培养瓶培养24h，待细胞贴壁后加入不同浓度的番茄汁，葡萄汁，48小时后，消化离心，制备细胞悬液于PBS中，调浓度为1×106个/ml,用于彗星实验。进行制板，碱变性，电泳，中和，染色，并在荧光显微镜下观察结果，每张片子随机计数100个细胞，记录拖尾细胞数，用目镜测微尺随机测量25个拖尾细胞的尾长，并计算拖尾率（彗星细胞数/总细胞数）。

1.5 流式细胞仪分析细胞凋亡峰

细胞接种于6孔板中，12h后，加入不同浓度葡萄汁、白藜芦醇作用48h，800r/min离心3min，弃上清液。用PBS洗涤1次，细胞沉淀用预冷的70%乙醇1ml在4℃固定24h。固定后的细胞用PBS洗涤2次，加入终浓度为50mg/L的RNaseA 37℃水浴30min，再加入PI染液至终浓度为50mg/L，进行染色。300目尼龙网过滤后，转流式测量管。于FACSort流式细胞仪进行细胞分析，在G0期左侧的峰为凋亡峰。

1.6 凋亡相关基因Bcl－2、Bax蛋白表达的检测

制作细胞爬片：以1×105/ml的细胞浓度接种于在6孔板中预置的无菌玻片上，经作用48小时后取出，PBS洗涤2次，待干燥，冷丙酮固定10min后。按北京中山生物有限公司生产的Bcl－2、Bax蛋白试剂盒说明方法进行。胞浆中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，随机计数200个细胞，计算阳性率＝（阳性细胞/200）×100%。

1.7 统计分析

采用SPSS软件包分析数据。用检验比较组间抑制率、细胞凋亡率、拖尾率及Bax阳性细胞表达率。

2结果

2.1 葡萄汁与白藜芦醇对Hela细胞生长增殖

毒性的比较

溶剂与空白对照组的吸光度值相比差异无统计学意义(P＞0.05)，表明溶剂（PBS）对Hela细胞无抑制作用。葡萄汁低、中、高剂量组抑制率逐渐增高，表明随葡萄汁剂量增大，抑制作用增强，存在着剂量依赖关系。白藜芦醇的抑制率居于中剂量组与低剂量组之间，与低、中剂量相比差异有统计学意义(P＜0.05)，说明其也能抑制Hela细胞的增殖，且作用强于葡萄汁低剂量组，弱于葡萄汁中剂量组。结果见表1。

表1葡萄汁和白藜芦醇对Hela细胞的增殖毒性作用(x-±S, n=4)

 

2.2 葡萄汁与白藜芦醇对Hela细胞DNA链

断裂情况的比较

荧光显微镜下观察，空白、溶剂对照组的细胞为橘红色圆形状，无拖尾现象；空白对照组与溶剂对照组相比，细胞拖尾率及DNA迁移长度差异无统计学意义(P＞0.05)。随着葡萄汁浓度增大，各剂量组彗星细胞拖尾现象愈明显，且与对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.01)，各剂量组之间的拖尾率有极显著性(P＜0.01)。葡萄汁低、中、高剂量组拖尾细胞DNA迁移长度逐渐增加，且均高于对照组，其中中剂量组的DNA迁移长度高于白藜芦醇，差异有统计学意义(P＜0.05)。结果见表2。

 

表2葡萄汁及白藜芦醇对Hela细胞DNA损伤影响的比较

2.3 葡萄汁与白藜芦醇对Hela细胞凋亡影响的比较

图1所示，葡萄汁低、中、高剂量及白藜芦醇作用于人Hela细胞后均能出现亚二倍体凋亡峰，而对照组则无凋亡峰出现，表明葡萄汁与白藜芦醇能诱导Hela细胞凋亡；其凋亡率分别是7.04%、27.20%、30.40%、12%，表明随葡萄汁剂量增大，凋亡细胞增多，葡萄汁诱导Hela细胞凋亡的作用随剂量增加而增强；葡萄汁低剂量组凋亡率与空白对照组（0.22%）相比，差异有极显著性(P＜0.01)；中剂量组葡萄汁与白藜芦醇组比作用强，差异有显著性(P＜0.05)；实验组凋亡率两两比较差异有显著性(P＜0.05)。

 

图1葡萄汁与白藜芦醇诱导Hela细胞凋亡

Fig.1Effect of grape juice and resverotral on

Apoptosis of Hela cells by flowcytometry

 

2.4 葡萄汁与白藜芦醇对Hela细胞凋亡相关基因表达影响的比较

显微镜下可见，胞浆中明显的黄棕色颗粒及黄染的细胞轮廓的Bcl2、Bax阳性表达细胞，随葡萄汁剂量的增加，Bax阳性细胞数则明显增多,但Bcl2阳性细胞数明显减少。由表3可知：葡萄汁低、中、高剂量组Bcl2阳性表达率依次降低，Bax阳性表达率依次增高，表明葡萄汁能通过上调促凋亡基因Bax的表达，下调抑凋亡基因Bcl2的表达来诱导Hela细胞凋亡。白藜芦醇的Bax阳性细胞率较番茄汁中剂量组低，而Bcl2阳性细胞率明显增高，表明白藜芦醇上调促凋亡基因Bax的表达，下调抑凋亡基因Bcl2的表达来诱导Hela细胞凋亡的能力较葡萄汁中剂量组弱。

 

表3葡萄汁及白藜芦醇对Hela细胞凋亡相关基因、Bcl2表达的影响的比较

 

3讨论

Imran等[3]研究10μM、25μM白藜芦醇对人宫颈癌Hela细胞的增殖抑制作用和电离辐射增敏作用发现，两种剂量的白藜芦醇能连续7天抑制Hela的生长增殖，能使细胞周期发生S期阻滞，并能增强HeLa细胞对电离辐射的毒性反应。朱振勤等[4]通过MTT及流式细胞仪分析白藜芦醇作用后的HeLa细胞，结果表明白藜芦醇能强烈抑制HeLa细胞增殖，并阻断HeLa细胞由S期向G2期转变而引起Hela细胞凋亡。Nakagawa等[5]报道白藜芦醇能够抑制3种人乳腺癌细胞株(KPL1，MCF7和MKLF)增殖，此增殖抑制与诱导细胞凋亡有关。除此之外，白藜芦醇诱导人宫颈癌Hela凋亡的作用已经有研究证实[3,4]。本研究以白藜芦醇浓度4.560μg/ml为作为阳性对照组，进行体外培养发现白藜芦醇能抑制人宫颈癌Hela细胞的增殖，调节Bcl－2和Bax基因的表达而诱导肿瘤Hela细胞的凋亡，从而起到了抗Hela细胞生长的作用，与以上研究相吻合。

葡萄汁中不仅存有具抗癌作用的白藜芦醇，还存有其他植物化学物如多酚类等，Koki等[6]检测发现在葡萄果汁中白葡萄汁的全酚含量为176mg/kg，红葡萄汁的为206mg/kg。白藜芦醇与其他物质的交互的抗肿瘤作用，已早有研究。MertensTalcott等[7]研究表明葡萄中的鞣花酸、五羟黄酮与白藜芦醇能协同抑制白血病细胞的生长，并认为天然食物中的抗癌作用不是基于某一成分而是各成分的协同作用；Koichi Igura的实验[8]表明五羟黄酮与白藜芦醇能协同抑制淋巴瘤细胞的生长；研究白藜芦醇联合5FU促进人乳腺癌MCF7细胞凋亡的作用，发现白藜芦醇与5FU合用可协同促进MCF7细胞凋亡[9]。邓红等[10]观察吐鲁番无核白葡萄提取(10-1kg/L~10-6kg/L)对人宫颈癌细胞Hela生长抑制作用的功效成分进行检测，发现其含的维生素C、多糖及黄酮含量分别为51.8mg/kg、68.1mg/kg及45.6mg/kg，提示其体外抑癌效果可能与所含有的维生素C、多糖及黄酮等成分有关。本研究以富含白藜芦醇的葡萄汁作为受试物，作用于体外培养的Hela细胞时发现，在本实验所设浓度范围内，葡萄汁及白藜芦醇均能抑制人宫颈癌Hela细胞的生长增殖，并且随浓度增加，增殖抑制作用增强；葡萄汁可能通过DNA损伤的发生，上调促凋亡基因Bax的表达而诱导Hela细胞凋亡产生增殖抑制作用，且白藜芦醇组相比，葡萄汁中剂量组中所含的白藜芦醇为0.256μg/ml，低于其数倍之多，但效果强；说明葡萄汁中可能存在除白藜芦醇外的其他物质的交互抗癌作用，与以上研究相符。

本研究将含皮、籽的葡萄制成葡萄汁，发现其抗宫颈癌作用比高浓度的白藜芦醇效果强，则原花青素、维生素C、其他多酚类等物质可能在其中发挥着交互的抗肿瘤作用，但目前其交互抗肿瘤作用的机制仍未明了。

参考文献

[1] Wiston J Craig.Phytochemicals:Guardians of our health.Journal of American dietetic association,1997,97(suppl2):199-204.

[2] 罗琼,庞雅琴,杨明亮,等.葡萄汁对人前列腺癌PC3细胞增殖和凋亡的影响.营养学报,2006,28( 5):56-60.

[3] Imran Zoberi, C. Matthew Bradbury, Heather A. Curry, et al. Radiosensi tizing and antiproliferative effects of resveratrol in two human cervical tumor cell lines. Cancer Letters, 2002,175:165-173.

[4] 朱振勤, 张小轶, 陈季武等.白藜芦醇抑制HeLa细胞肿瘤活性的自由基机理. 华东师范大学学报(自然科学版),2002,2:98-101.

[5] 温志震,于宝海,魏虎来,等.白藜芦醇诱导K562细胞凋亡过程中Bcl2蛋白水平的改变.中国临床药理学与治疗学,2006,11(4):421-423.

[6] Koki Yokotsuka.日本食品科学工学会志（日）,1995,42(4):288-295.

[7] Susanne U.MertensTalcott,SusanS. Ellagic acid and quercetin interact synergisti cally with resveratrol in the induction of apoptosis and cause transient cell cycle arrest in human leukemia cells.Cancer Letters, 2005,218 (2):141-151.

[8] Koichi Iguraa,Toshiro Ohtaa,Yukiaki Kuroda,et al. Resveratrol and quercetin inhibit angiogenesis in vitro.Cancer Letters ,2001, 171(5):11-16.

[9] 李燕,邢克飞,李福洋,等. 白藜芦醇联合5FU对人乳腺癌细胞系MCF7的促凋亡作用.第四军医大学学报,2006,27(7)：658-661.

[10] 邓红,张月明,宋旭红等.吐鲁番无核白葡萄抑癌作用及其相关成分分析.营养学报,2003,3(25):275-278.