达能营养中心第十届学术研讨会论文集

应晨江 杨年红 许明佳 李彦荣 衣卫杰 刘烈刚 孙秀发

 

(华中科技大学公共卫生学院营养与食品卫生学系,湖北武汉,430030)

 

摘要:目的窖蛋白1（Cav-1）是内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的负调节蛋白，影响到心血管功能的多个方面。本研究旨在了解高脂膳食对血管Cav-1表达和eNOS活性的影响。方法雄性SD大鼠随机分为对照组和试验组。试验组用高脂饲料喂养15周，诱导肥胖（DIO）和肥胖抵抗（DR）后，再将DIO组大鼠一半改用基础饲料饮食喂养干预（DIO-LF），另一半继续维持高脂饮食（DIOHF）。对照组大鼠一直用基础饲料喂养。第23周实验结束时处死动物，取主动脉用RTPCR、免疫印迹及免疫组化方法检测血管Cav-1表达水平，Griess试剂测定NOS活性，蛋白激酶B(PKB/Akt)磷酸化及eNOS表达和磷酸化通过免疫印迹检测。结果(1）高脂膳食上调DIO大鼠主动脉Cav-1蛋白表达，下调eNOS表达，在DR大鼠中未见到此作用；(2）DIO大鼠主动脉中NOS活性下降，而DR大鼠中未见到此现象；(3）DIO大鼠（不论是DIOHF,还是DIO-LF）主动脉中PKB/Akt、和eNOS（ser1177）磷酸化作用增强。结论本研究结果提示高脂饮食喂养大鼠主动脉中NOS活性下降，至少部分是和Cav1表达增强有关。

关键词：饮食诱导肥胖;内皮型一氧化氮合酶;窖蛋白1;蛋白激酶B

 

肥胖是引起心血管疾病最重要的危险因素之一[1]。但是其内在机制尚不十分清楚，有研究揭示出超重者中存在着血管内皮功能失调的现象，并推测体内过量储存的脂肪引发的代谢和炎症反应可能涉及其中[2]。发现受损的内皮细胞功能远早于血管异常的临床表现和症状[3]。

健康的内皮有赖于一系列抗炎症，抗纤维化，血管舒张功能的平衡，而这些平衡功能很大程度上需要一氧化氮（NO）来维持。在内皮中NO由内皮型NO合酶（eNOS）合成，许多生理病理过程，包括剪切应力（shear stress），血中高胆固醇，以及葡萄糖和脂肪酸等代谢物都能对eNOS产生影响[4-7]。尽管已知内皮功能障碍部分是由NO产生受损引起的，但是eNOS本身的表达和活性调控相当复杂，其中的过程还未被充分认识。在基础状况下，大部分eNOS是结合在窖蛋白1（Cav1）上的，其活性中心被束缚在胞膜窖上，Cav1是胞膜窖中主要包被蛋白和组成部分[8]。对Cav1敲出小鼠的研究表明Cav1可能对出生后的动物心血管功能至关重要，比如和内皮屏障功能，NO合酶的调节，胆固醇代谢和心脏功能等息息相关[9]。还有研究认为eNOS就是通过蛋白质——蛋白质相互作用，受到Cav-1的负调节[10,11]。

 

先前有报告显示缺乏Cav-1的小鼠体型瘦小并能抵抗饮食对肥胖的诱导[12]。Cohen AW等人[13]进一步揭示出这种瘦小体型的成因是由于缺少胰岛素调控的脂肪合成。但是，据我们所知，尚未见在非遗传学手段造成Cav1缺陷的动物中，即在普通动物中有高脂饮食诱导肥胖对心血管系统Cav1表达的研究，因此我们对高脂饮食诱导肥胖大鼠心血管Cav1表达和eNOS活性等进行研究。

 

材料与方法

1.实验动物

雄性SD大鼠36只，体重160～170g，购自上海西普尔—必凯实验动物有限公司（准SCXK(沪)2003-0002）。各大鼠均单笼饲养，自由摄食、摄水，动物房温度（22±5）℃，相对湿度（50±10）%，明暗周期12比12，每周定时称体重。（1）肥胖模型制备[14]：购入大鼠适应性饲养1周后，按体重随机抽取9只喂养基础饲料作对照组（CF），其余27只大鼠喂以高脂饲料作试验组。第15周时，高脂实验组大鼠体重基本稳定，体重大于对照组体重均值+1.96s的14只为DIO（肥胖）大鼠，体重小于对照组体重均值+1s的7只为DIOR（肥胖抵抗）大鼠。另有6只体重在肥胖敏感和肥胖抵抗之间，未进入本次实验研究。（2）低脂饮食干预实验：DIO组再随机分为2组，1组改为基础饲料饮食（DIOHF/LF，7只），另一组维持高脂饮食（DIOHF，7只）。CF及DIOR大鼠仍维持原来饮食。继续喂养8周。

2.饲料配方

基础饲料由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，总热能13.77kJ/g（蛋白质21.88%、脂肪13.68%、碳水化合物64.44%）；高脂饲料配制：100g含基础饲料60g、猪油15g、鸡蛋黄粉10g、脱脂奶粉8g、干酪素5g、白沙糖2g，总热能19.33kJ/g（蛋白质20.00%、脂肪49.85%、碳水化合物30.15%）。

3.组织样品的准备

第23周实验结束时，过夜禁食10h后断头处死，分离腹腔内脂肪称重记录，取胸主动脉60mg左右，迅速置液氮冷冻，然后转入-80℃超低温冰箱以备Cav1的检测。

4.主要试剂

Trizol试剂盒（Promega），RTPCR引物（北京奥科生物公司合成），BioRad DC蛋白定量试剂盒（BioRad），caveolin1兔抗（Sant Cruz），羊抗兔IgG（Sigma），αtubulin鼠抗（Sigma），羊抗鼠IgG（Sigma）；ECL Plus显影剂（Amersham Biosciences），宝丽来T667相纸（Polaroid），Biometra成像系统（Biometra），免疫组化试剂盒（中杉公司）。

5.血样分析

实验期间过夜禁食后于上午8时到12时之间采集尾静脉血,所有样品分析前置于-80℃超低温冰箱。血糖浓度采用糖氧化法[15]，血清总胆固醇和总甘油三脂分别用CHODPAP和GPOPAP法测定。

6.NOS活性

NOS活性用Griess反应测定[16]，采用南京建成公司试剂盒。

7.免疫印迹[17]

冰冻保存的主动脉组织取出后在三重细胞裂解液中匀浆，4℃离心（12000r/min×10min）提取蛋白上清液。用BioRad试剂盒进行蛋白定量（Lowrys法），将蛋白量调成一致后加上样缓冲液100℃变性5min，总蛋白上样量为30μg，于12%SDSPAGE凝胶电泳2h，转至硝酸纤维膜上。用含5%脱脂奶粉的TBST4℃封闭过夜，分别与一抗和二抗孵育2h。Caveolin1一抗兔抗1∶200，二抗羊抗兔1∶6000；内参αtubulin一抗鼠抗1∶3000，二抗羊抗鼠1∶10000。与ECL显影剂反应，于宝丽来成像系统曝光显影于P667相纸，用扫描仪收集图像，并用Biometra凝胶成像系统进行图像分析，Cav1蛋白表达水平用目的蛋白条带光密度值与αtubulin条带光密度值之比表示。

8.Cav-1mRNA的测定[18]

按Trizol说明书从50mg主动脉组织中提取总RNA。在25ul逆转录反应体系中，以1.0μg mRNA为模板将mRNA逆转录为cDNA。PCR反应以βactin作为内参照，βactin上游引物为5CAT CAC TAT CGG CAA TGA GC3，5GAC AGC ACT GTG TTG GCA TA3（156bp）；caveolin1上游引物为5TCT ACA AGC CCA ACA ACA AGG3，下游引物为5AGG AAA GAG AGG ATG GCA AAG3(304bp)。RCR反应首先在95℃预变性5min，72℃延伸7min；95℃变性1min，55℃退火40s，72℃延伸40s，30个循环；最后一次循环在72℃延伸5min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳并与DNA标准分子量比较鉴定，用Biometra凝胶成像系统进行成像和图像分析，Cav1 mRNA表达水平用目的基因条带光密度值与βactin条带光密度值之比表示。

9.免疫组化[19]

主动脉样品于同济医院病理科行冰冻切片，丙酮固定10min后用3%H2O2孵育10min，在柠檬酸钠中行抗原修复，羊血清封闭30min，加一抗(Anticaveolin1)4℃孵育过夜，加生物素化二抗孵育30min后，与辣根酶标记链霉卵白素（SA/HRP）反应30min，DAB显色后苏木素复染，封片后成像记录。

10.统计学处理

全部数据录入Microsoft Excel 2000，用SPSS 11.0统计软件进行统计分析，相关数据以x-±s表示，多个样本均数间比较用方差分析。

 

结果

1.高脂饮食对大鼠体重和内脏脂肪的影响

统计结果显示四组动物的体重存在显著差异(F=18.846,P=0.000,Fig.1A)，DIO大鼠（包括DIOHF和DIOLF）的平均体重明显高于对照大鼠(P＜0.01)或DR大鼠(P＜0.01)。在饮食诱导期（实验前15周），DIO大鼠体重增加明显高于DR大鼠和普通饲料喂养的对照大鼠，DIO大鼠和对照之间体重的差异从第7周开始出现一直维持到整个实验结束(P＜0.05)，尽管从第15周后DIO大鼠换回到普通饲料，这种体重的差异仍然存在(DIOLF大鼠与对照大鼠相比,P＜0.05)。尽管饮食上存在巨大差别，DR大鼠在整个实验期间和对照组大鼠之间没有发现体重上的差异。在实验结束时，DIOLF大鼠的体重低于DIOHF(P＜0.05)但是高于DR大鼠的平均体重(P＜0.05)。

在实验结束时，DIOHF大鼠的内脏脂肪分别显著高于对照组(P＜0.05),DIOLF(P＜0.05)和DR(P＜0.05)大鼠(Fig.1B)，但同时没有观察到DIOLF,DR和对照大鼠之间在内脏脂肪重量上的差异。

Fig.1Effects of highfat dietfed on body weight in male SpragueDawley rats.

The highfat dietfed rats were divided into three groups, namely, DIOLF(n=7),DIOHF(n=7),and DR(n=7) at the end of 15thweek according to the protocol in Materials and Methods.(A) Body weights were measured weekly and the data were presented as means   SEM.Symbol (*) represents significant differences comparing with the control group (n=9) and different letters (a, b) attached to DIOLF group represents significant differences comparing with DIOHF and DR group, respectively(P＜0.05).(B)White adipose tissue from visceral fat deposits were measured and wet weight was presented as means   SEM.* P＜0.05 compared with the bars indicated. DIOLF, highfat diet induced obesity rats shift back to lower fat normal chow diet; DIOHF,highfat diet induced obesity rats continue to be fed with highfat diet; DR, highfat diet resistance rats.

 

2.高脂饮食对大鼠血糖和血脂浓度的影响

如Fig.2A所显示的：高脂饮食在饮食诱导结束时（即实验第15周），以及整个实验结束时（第23周），高脂饮食使DIO和DR大鼠的血糖均明显升高(P＜0.05，与对照大鼠相比)。换回到普通饲料使DIOLF大鼠的血糖回落到对照大鼠的水平(DIOLF和对照组相比，P＞0.05)。虽然DIO大鼠（而非DR大鼠）的血胆固醇有升高的趋势，但是没有发现和对照大鼠血胆固醇之间有差异(Fig.2B)。至于血清甘油三脂水平，DIO大鼠（而非DR大鼠）明显高于对照大鼠(P＜0.05，Fig.2C)，换回到普通饲料后，DIOLF大鼠的血清甘油三脂水平回落到和对照大鼠没有差别的水平(P＞0.05)。

Fig.2Serum glucose (A), cholestrol (B), and triglycerides (C) concentrations

in DIOLF, DIOHF, DIR and the control rats.

Values represent mean±SEM. Different letters (a,b,c) in Fig.2A represent significant differences of serum glucose in DIOHF, DIOLF and DR rats comparing with the control rats, respectively(P＜0.05). Different letters (a,b,c) in Fig.2C represent significant differences of serum triglyceride in DIOHF rats comparing with the control, DIOLF and DR rats, respectively(P＜0.05).

3.胸主动脉NOS活性

我们对DIO,DR,和对照大鼠(n=5)的胸主动脉中NOS活性进行测定，各组动物的NOS活性测定结果表明：DIO大鼠的总NOS（tNOS）和结构型NOS（cNOS）活性明显低于对照组(P＜0.05)，但是没有观测到DR大鼠和对照大鼠之间存在差异(Fig.3)。

4.胸主动脉Cav1 mRNA和蛋白表达

Cav1和胞膜窖在eNOS活性调节和胆固醇运输方面起着重要的作用，Cav-1水平的增减可以影响到胞膜窖的数目，进而影响到eNOS的活性。因此我们对高脂饮食影响Cav-1水平进行分析，结果显示高脂饮食可以增加DIOHF大鼠的Cav1mRNA和蛋白表达水平（Fig.4A和Fig.4B），但在DR组大鼠中没有发现这种调节作用，当DIO大鼠换回到普通饲料8周后，增加的Cav-1 mRNA或是蛋白表达都回复到对照组的水平(DIO-LF vs. DIO-HF, P＜0.05；DIO-LF vs. Control,P＞0.05)。

5.胸主动脉Cav-1免疫组织化学分析

我们进一步对对胸主动脉中Cav1的分布进行分析，Fig.5显示所有各组对Cav1的免疫反应广泛分布在胸主动脉的整个横断面，其中DIOHF大鼠的染色比其它各组深，这表明高脂饮食诱导了大鼠胸主动脉Cav1蛋白表达。这一结果和上述Western blot和RTPCR分析的结果是一致的。

Fig.4Effects of highfat diet on caveolin1 protein and mRNA expressions in thoracic aorta.

(A) Representative Western blot analysis of caveolin1 and alphatubulin proteins in thoracic aorta of rats. The bar graph represents four combined experiments. *p＜0.05 compared with the bars indicated. (B) Representative RTPCR analysis of caveolin1 and betaactin mRNA in thoracic aorta of rats. The bar graph represents three combined experiments. *P＜0.05 compared with the bars indicated.

Fig.5Immunohistochemistry for Cav1 in rat aorta.

Transversal sections of thoracic aorta from the control, DIO-LF, DIOHF and DR rats were immunolabeled with antibodies against caveolin1 and biotinylated secondary antibodies as described in Methods. 3, 3diaminobenzidinetetrahydrochloride was used to locate Cav1. Magnifications of indicated length are shown in each picture. The results are representative of three separate experiments.

 

6.胸主动脉eNOS表达,eNOS(Ser 1177)和Akt1(Ser473)磷酸化

我们再对高脂饮食影响胸主动脉eNOS表达和磷酸化状况进行分析。

Fig.6Effects of highfat diet and genetic nature on eNOS expressions,eNOS (Ser 1177) and Akt1 (Ser473) phosphorylations in thoracic aorta. (A)

Representative Western blot analysis of eNOS and alphatubulin proteins in thoracic aorta of rats . (B)the bar graph represent four combined experiments. *P＜0.05 compared with the bars indicated. (C) Representative Western blot analysis of peNOS and pAkt1in thoracic aorta of rats.

 

Western blot结果显示高脂饮食下调DIOHF组大鼠胸主动脉eNOS表达，但在DR组大鼠中没有发现类似的变化(Fig.6A, DIOHF vs. Control, P＜0.05)。另外，DIO大鼠换回到普通饲料8周后，这一作用消失(DIOLF vs. DIOHF, P＜0.05 and DIFLF vs. Control, P＞0.05)。在DIO组中(Fig.6B,包括DIOLF和DIOHF vs.对照组)，胸主动脉的eNOS(Ser 1177)和Akt1(Ser473)磷酸化水平均明显提高。

 

讨论

本部分研究的主要发现是:(1)高脂饮食增加大鼠胸主动脉组织中Cav1表达,减少eNOS表达和活性；(2)换回到普通饲料可以恢复上述Cav1和eNOS的水平；(3)在饮食诱导抵抗大鼠（DR）中，高脂饮食喂养时未观察到上述Cav1或eNOS表达的改变；(4)高脂饮食加强肥胖诱导大鼠胸主动脉中eNOS(Ser 1177)和Akt(Ser473)磷酸化。

和人类似，大鼠对于饮食诱导肥胖的敏感性有很大差人类异，而肥胖诱导大鼠（DIO）表现出许多在人类身上出现的肥胖综合症相关生理特点[20]。当一群杂交的SD（SpragueDawley）大鼠处于高脂饮食环境时，各个体在体重增长上表现出很大的差异，一部分动物成为肥胖大鼠（DIO），而另一部分维持和低脂饮食喂养动物相同的体重，即对饮食诱导肥胖产生抵抗（DR）[21]。人类患糖尿病型血脂代谢异常或肥胖者常常可见到中血浆甘油三脂和脂肪酸升高的现象[22]，有证据显示高血糖和高血甘油三脂对动脉管壁产生直接作用，能导致血管内皮功能障碍[23,24]。我们本部分研究中观察到的甘油三脂和空腹血糖升高，也见于其他研究报道[25,26]，但是，喂以高脂饮食的DR大鼠，其血中甘油三脂和胆固醇水平与普通饲料喂养的对照动物之间未见有明显的差异，类似结果也见于Farley用高脂饮食研究(脂肪占能量的比例为45%)本[14]，这种现象背后的机制尚不清楚，已有研究表明DR大鼠比DIO大鼠或对照大鼠血中含有更高浓度的PYY（peptide YY,一种小肠源性的食欲减退物质）[27]。这表明食欲控制的差别可能减低DR大鼠食物的摄入和体重的增加，在内分泌和脂肪代谢方面，对其中的差异进行研究可能会得到一些有价值的线索。

在心血管系统中，内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞和成纤维细胞都含有丰富的胞膜窖，在这些细胞中，胞膜窖在作为蛋白脚手架、细胞信号转导、胆固醇和脂肪动态平衡中起重要作用[28]。随着在内皮细胞浆膜面胞膜窖中确认有内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的存在，使胞膜窖中富集分子参与eNOS调节和信号转导的认识得到新的关注[10,11]。有学者认为：在未受刺激的内皮细胞中，Cav1可能通过蛋白质和蛋白质之间相互作用束缚eNOS活性。在Cav1缺失小鼠中乙酰胆碱刺激的血管舒张和NO依赖的微血管渗漏显著增强[29,30]，这些结果都显示Cav1抑制NO的合成。因此，改变Cav1的多少就可以调节eNOS活性，进而调节血管功能。在本研究中，我们观察了DIO大鼠主动脉中Cav1 mRNA和蛋白水平呈现一致性地增加，可以认为这是由高脂饮食所致的结果，免疫组织化学分析的结果也支持了这一点。在DIO组大鼠中，无论是总NOS还是结构型NOS的活性都明显降低，这也进一步说明高脂饮食导致的主动脉Cav1高表达抑制了cNOS(其中主要是eNOS)的活性。和DIO大鼠相反的是，虽然同样给予高脂饮食，在DR组大鼠中没有观察到Cav1水平、eNOS表达、以及NOS活性的改变，而且也没有观察到血糖以外的其它血液指标发生改变。综合这些结果表明Cav1的调节不仅受高脂饮食的影响，遗传背景造成的个体差异也在其中起到重要作用。原先有高脂饮食能增加猪冠状动脉Cav1表达的报道[31]，也有对雌性Fischer大鼠主动脉Cav1表达没有影响的报道[32]，在我们的研究中，证实了高脂饮食对Cav1的调节作用，而且我们还发现DIO大鼠回复到普通饲料后能使增加的Cav1水平恢复到对照组同样的水平，这说明了低脂的普通饮食的有利作用。

除了对Cav-1的调节作用，对eNOS表达和PI3K/Akt细胞信号通路及其下游eNOS磷酸化(ser 1177)，对于NO的产生也是很重要的。Molnar等[33]还报道过：是对eNOS双聚体的破坏而不是损害胰岛素介导的eNOS磷酸化，才是饮食诱导肥胖/患糖尿病小鼠内皮功能障碍的原因，不过从他们发表的Western blot结果来看，高脂饮食喂养的小鼠主动脉还是有eNOS表达下降的现象。在我们研究中，高脂饮食降低了DIO大鼠主动脉eNOS表达的同时，还使蛋白激酶B(PKB/Akt)和eNOS磷酸化信号加强，这种作用不能通过回复到普通饲料加以改善。综合这些结果和报道，表明高脂饮食调节NO产生有着相当复杂的机制，可能存在多种机制共存的现象。

总之，高脂饮食加强Cav1表达，可能与肥胖个体心血管疾病危险性的增加有关，其中至少部分原因是通过Cav1对eNOS的负调控有关。

 

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