达能营养中心第十届学术研讨会论文集

李增宁¹骆彬¹康为均²勉丽娜²胡环宇¹

(1.河北医科大学第一医院，河北，050031;2.河北医科大学公卫学院，河北，050017)

 

摘要：目的建立一种准确、简便、快速的高效液相色谱法用于测定肠内制剂中谷氨酰胺（GLN）的含量。方法以邻苯二甲醛作柱前衍生剂，反相C18柱为固定相，以10mmol/L磷酸盐缓冲液（Ph6.85）：甲醇=50：50为流动相进行洗脱，在λ340nm处测定L谷氨酰胺的含量。结果在100—1500μmol/L范围内线性关系良好（r=0.9995）。回收率为98.43%-101.26%。结论该方法简便、准确，适用于肠内制剂中谷氨酰胺含量的分析。

 

关键词：反相高效液相色谱法；谷氨酰胺；肠内营养剂

 

The determination of GLN in enteral nutrient by HPLC Li zengningLuo binKang weijunMian linaHu huanyu

 

(First hospital of Hebei Medical University)

 

Abstract：ObjectiveTo establish a new high performance liquid chromatography (HPLC) method for determining the contents of LGLN in enteral nutrient. MethodsLGLN was derived with Ophthaldehyde(OPA) and eluted with 10mmol/L phosphate buffer (pH 6.85) containing methanol on reverse phase C18 column. The derivative was detected at 340nm. Resultscalibration curves of GLN was linear from 100 to 1500 μmol/L (r=0.9995), and the recovery ratio was 98.43%-101.26%.ConclusionThe method is simple, rapid and effective, which can be used for determining LGLN of enteral nutrient.

 

Keywords: HPLC; GLN; enteral nutrient

 

 

谷氨酰胺（glutamine,GLN）是一种十分重要的具有特殊营养作用的条件性必需氨基酸[1]，谷氨酰胺是免疫细胞的营养底物，研究表明补充外源性谷氨酰胺可以改善脓毒血症病人免疫细胞；谷氨酞胺在增强免疫细胞功能的同时不会增加促炎因子的产生。另外，还能促进肌肉蛋白的合成，改善氮平衡。对ICU病人应用谷氨酰胺的研究发现，使用谷氨酰胺的患者6个月存活率获得显著改善，而对照组病人更多地死于真菌感染和多脏器功能衰竭[2]。因此，谷氨酰胺被广泛用于肠道营养剂中，成为肠道营养剂中的重要成份。本文建立了一种更为简便、迅速、准确的高效液相色谱法测定肠道营养剂中的GLN，通过几种样品中GLN含量的测定表明此种方法是准确、有效的。

 

1资料与方法

1.1 仪器

HITACHI高效液相色谱仪（日本），低速离心机，超声清洗器。

1.2 试剂

（1）邻苯二甲醛（OPA）（北京亚太精细化工公司，分析纯）、二巯基乙醇（天津市光复精细化工研究所）；甲醇（美国honeywell international inc，色谱纯），GLN标准品（由中国药品生物制品检定所提供）；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硼酸等均为分析纯；实验用水均为双蒸水，其他所用试剂均为分析纯。

（2）衍生剂配制，称取13.5mg OPA溶于1ml甲醇中混匀，然后加40mmol/L硼酸缓冲液（pH 9.5）9ml混匀后再加入0.2ml 2巯基乙醇混匀，经0.45μm滤膜过滤后备用。

1.3 色谱条件

色谱柱SUNTEK，C18，250×4.6mm,5μm；流动相：10mmol/L磷酸盐缓冲液（Ph6.85）：甲醇=50：50，流速1.0ml/min；柱温：室温；紫外检测波长340nm；灵敏度0.08；进样量20μl；全程10分钟。磷酸缓冲液经.45μm滤膜过滤。

1.4 样品处理及衍生

1.4.1 样品处理：粉末状样品处理方法是准确称取0.1g样品，加入10ml 10mmol/L磷酸盐缓冲液（Ph6.85），摇匀后超声5分钟，再以5000r/min速度离心10分钟，将中层液用0.45μm滤膜过滤后立即衍生检测或在-20℃冰箱保存；乳状液体样品的处理方法是准确吸取1ml样品，加入9ml 10mmol/L磷酸盐缓冲液（PH6.85），摇匀后超声5分钟，再以5000r/min速度离心10分钟，用0.45μm滤膜过滤后立即衍生检测或在-20℃冰箱保存。

1.4.2 衍生：准确吸取滤液20μl，加100μl OPA衍生剂，旋涡混匀器混匀，室温下反应90秒，取20μl进样进行色谱分析。

 

2结果

2.1 定性

取20μl一定浓度的GLN标准品加100μl衍生剂衍生后进样检测，见图1；取20μl纯水加100μl衍生剂混匀后进样检测，见图2；同时，取20μl GLN标准品加100μl 10mmol/L磷酸盐缓冲液（PH6.85）混匀后进样检测，见图3。由图2可知纯衍生剂在340nm也有紫外吸收，并且出现三个峰；而图1中，GLN标准品经衍生后，图中出现四个峰，其中保留时间与图2中的保留时间不同的一个峰在3.636min；由图3可知，GLN未经衍生时在3.636min是没有紫外吸收的，由此证明此峰是GLN标准品衍生后的峰。

2.2 标准曲线及线性范围

配制浓度范围为100-1500μmol/L GLN系列标准溶液，按上述方法测定，外标法定量，其浓度与峰面积的线性关系良好，工作曲线方程为：Y=2123.7607+18.26X，r=0.9995，检测限是10nmol/L。

2.3 回收率与精密度测定

取一样品进样检测，然后分别加入三种已知浓度（高，中，低）的标准品进样检测，计算回收率，回收率范围在98.43%-101.26%之间；取同一样品重复测定5次，计算变异系数为5.09%。

2.4 样品测定

通过上述方法共测定了10种常用肠内营养制剂及1种谷氨酰胺颗粒，样品图谱见图4，其中有五种样品未检出GLN，其余样品的含量分别为：930mg/100g；4658mg/100g；98.5g/100g；943mg/100g；2339mg/100g；1581mg/100g。

 

3讨论

血浆中谷氨酞胺含量测定，有较多报道[3-4]，但对营养成品制剂中Gln的报道不多，我国目前对谷氨酰胺含量测定为定氮法，但方法较费时费力，操作时需同时空白校正，且稍不谨慎易漏气或接收体积不够均可造成含量偏低。采用专用氨基酸分析仪进行分析，但仪器昂贵，成本很高。本方法对制剂中Gln含量测定的准确度提高，有利于更好地监测相关产品质量；保证准确给予有关患者足量Gln的供应。

 

参考文献

[1] 蒋朱明，蔡威主编.临床肠外与肠内营养.第1版.北京：科学技术文献出版社，2000，123-152.

[2] 危重病人危重病人营养指导意见（2006）中华医学会重症医学分会.中华实用外科杂志.2006年10月第26卷第10期,721-732.

[3] 董光龙，王为忠，尚刚伟，等.快速测定组织、血浆中谷氨酰胺及其临床意义[J].肠外与肠内营养，2000,7(2):93-96.

[4] 朱明炜，肖路延，刘蕾，等.谷氨酰胺颗粒剂在健康人体的药代动力学研究[J].中国临床营养杂志,2003,11(2):88-91.