达能营养中心第十届学术研讨会论文集

应晨江 李彦荣 易海维 孟依衣 卫杰 孙秀发

(华中科技大学公共卫生学院营养与食品卫生学系,湖北武汉,430030)

 

摘要：目的来自内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的NO，在血管生成、血管重构、以及内皮细胞渗透性方面有着深远的影响，NO下降是内皮功能失调的重要标志，同时也是高血压、动脉粥样硬化、糖尿病人血管病变的病理基础，而内皮细胞窖蛋白-1（Caveolin1,Cav-1）又是eNOS的负调控开关。因此我们在前面证实茶多酚通过调控ROS,影响内皮细胞功能的基础上，进一步探讨绿茶茶多酚(GTP)对eNOS和Cav1表达的影响。方法在体外培养BAEC中，加入终浓度为4μg/ml GTP，分别作用0、4、8、12、16和24小时；另用不同浓度的GTP作用于内皮细胞；用免疫印迹法检测eNOS和Cav1蛋白表达水平，RTPCR检测eNOS和Cav1 mRNA表达水平。结果eNOS mRNA水平的表达从GTP作用4小时后开始上升；eNOS蛋白表达在8小时后开始增加，并可以维持到24小时。剂量－效应关系表明4μg/ml的GTP对eNOS蛋白和mRNA的表达上调作用最明显。Cav1 mRNA表达水平在GTP作用4小时开始下降，可以维持到8小时，Cav1蛋白水平在GTP作用12小时开始下降，可以维持到24小时以上。结论GTP可以增加内皮细胞eNOS mRNA和蛋白水平，同时GTP可降低内皮细胞Cav-1 mRNA和蛋白表达，提示茶多酚可能通过NO产生途径改善内皮功能。

关键词：茶多酚；内皮细胞；内皮型一氧化氮合酶；窖蛋白-1

 

血管内皮中的NO由内皮型一氧化氮合酶（eNOS）产生，对于维持血管正常紧张度有重要的意义。eNOS产生的NO和其他的一些激素及信号物质共同参与血管紧张度和血压的调节，是一种主要的舒张血管的分子。内皮细胞产生的NO还可以与活性氧族反应，减少活性氧族对血管组织的损伤，起到维护血管功能的作用。另外，近来发现NO还具有抗动脉粥样硬化的作用，主要是抑制血小板聚集、白细胞粘附、平滑肌细胞增生和粥样形成涉及的基因表达[1]。活性氧的增加和NO生物功能的丧失,进而产生内皮功能障碍对于高血压和动脉粥样硬化等心血管疾病的发生发展有重要意义[2]。因此eNOS功能损伤是心血管疾病的主要病理表现，也是心血管药物药理作用的靶点之一[1]。

胞膜窖（caveolae）是胞膜上直径约50-100nm，富含胆固醇，鞘磷脂和鞘磷糖的烧瓶状膜内陷区域[3]。Caveolin1（Cav1）是胞膜窖的标志性蛋白，在血管内皮细胞和脂肪细胞中含量最高，Cav1可以调节胞膜窖中的胆固醇含量，参与胆固醇在内质网到胞膜之间的穿梭运动[4]；还参与脂肪代谢；更为重要的是它参与并且在细胞信号转导中发挥“主宰调节者”的作用。许多信号分子（G蛋白、激酶等）与Cav1结合，这种结合可以让这些信号分子处于静止或抑制状态，例如产生NO的eNOS就位于Cav1的脚手架区，使其处于无活性状态[5]。一些具有重要生理功能的分子，如胰岛素受体，血管紧张素II受体I型（AT1）也存在于胞膜窖中。

茶多酚是茶叶中的主要活性成分，近些年的实验表明茶多酚具有抗癌、清除氧自由基、抑制血压升高、降低血糖和降低血胆固醇的作用[6]。流行病学调查已经证实茶的消费和心血管疾病危险性之间呈负相关[7]。临床交叉试验表明短期和长期饮用红茶可以改善冠状动脉疾病的内皮收缩功能失调[8]。最近已经有实验揭示了绿茶茶多酚的重要成分EGCG通过短时间作用内皮细胞，激活PI3激酶、蛋白激酶B（PKB/Akt）和PKA进而增加eNOS的活性[9]。然而，绿茶茶多酚长时间作用对内皮细胞产生有益作用的机理还不清楚，本研究部分探讨茶多酚对内皮细胞eNOS和Cav1基因表达水平的影响。

 

材料与方法

1．材料

绿茶茶多酚由联合利华健康研究所（荷兰）惠赠。DMEM低糖培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自Hyclon公司。脱氧胆酸钠、过硫酸胺、SDS和NaVO3购自Sigma；DTT、PMSF、Aprotinin购自Roche公司；Leupeptin、Tween20、TEMED、二巯基乙醇和双丙烯酰胺购自Promega公司；丙烯酰胺购自Fluka；硝酸纤维素膜购自PALLGelman公司（美国）；蛋白定量试剂盒、电泳和转膜装置为BioRad公司产品；ECL化学发光剂和显影暗盒购自Amersham公司，显影胶片为购自宝丽莱T667胶片。eNOS抗体购自Cayman公司，Cav1抗体购自Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗购自Sigma公司。其他试剂均为国产分析纯级试剂。PCR仪和图形分析仪为Biometra公司产品。

 

2.方法

2.1 细胞培养

牛胸主动脉内皮细胞（BAECs）采集方法见第三部分，原代培养方法参照文献[10]，选用5－15代细胞用作实验用。细胞用含10％胎牛血清的DMEM低糖培养基培养于37℃、含5％CO2的培养箱中。

 

2.2 细胞处理

当细胞长到80％时，DMEM培养基中加入4μg/ml的绿茶茶多酚分别作用细胞0、4、8、12、16和24小时，每组中随机选取三皿细胞刮下加入细胞裂解液处理，另外三皿细胞加入Trizol处理提取mRNA。另外一组实验DMEM培养基中加入0、0.04、0.4、4、40μg/ml的茶多酚，作用8小时后，每组三皿细胞用Trizol处理提取mRNA；另外每组三皿细胞作用12小时后，用细胞刮刮下加入细胞裂解液处理。

 

2.3 免疫印迹检测

细胞用细胞裂解液溶解后提取全细胞蛋白。经蛋白质定量，蛋白质电泳分离（SDSPAGE）和免疫印迹按参考文献[11]的方法进行，eNOS一抗反应滴度为1∶4000，α－tubulin一抗反应滴度为1∶1000，Cav1一抗反应滴度为1∶400，二抗用滴度为1∶30000。免疫反应带用ECL试剂盒检测，化学发光信号用自显影胶片记录，扫描仪扫描，用Biometra图形分析仪对条带积分光密度定量分析。

 

2.4 RTPCR检测eNOS和Cav1的mRNA水平

Trizol提取细胞mRNA的方法依说明书操作。逆转录反应体系为25μl反应体系，将mRNA逆转录为cDNA。eNOS上游引物为5GGA GAG GCT GCA TGA CAT TG 3，下游引物为5GGT AGA GCC ATA GTG GAA TGA C 3，反应产物599bp；Caveolin1上游引物为，5TAC AAG CCC AAC AAC AAG G3下游引物为5ACA GTG AAG GTG GTG AAG C3，反应产物 209bp;GAPDH上游引物为5ATG ACC ACT GTC CAC GCC AT 3，下游引物为5GCC TGC TTC ACC ACC TTC TT 3。PCR反应体系为25μl反应体系，eNOS反应条件为：94℃变性1分钟，59℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，30个循环；GAPGH反应条件为94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，29个循环。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳并与DNA标准比较，然后在数字成像仪上照相分析。

 

2.5 统计分析

组间比较采用方差分析，统计分析软件为SAS 8.0。

结果

1.绿茶茶多酚与内皮细胞eNOS基因表达水平的时间关系

与0小时相比，4μg/ml绿茶茶多酚作用内皮细胞4、8、12小时的eNOS mRNA表达水平明显增加，于8h出现峰值,而在16小时和24小时时没有显著差异（Table 1和Fig.1）。与0小时相比，4μg/ml茶多酚作用内皮细胞8小时、12小时、16小时和24小时的eNOS蛋白表达水平显著升高，差异具有极显著性（Table 1和Fig.2）。上述结果表明了绿茶茶多酚可以上调内皮细胞eNOS的表达,在时间上符合先mRNA后蛋白表达的特点。

 

2．绿茶茶多酚与内皮细胞eNOS基因表达水平的剂量—反应关系

与对照组相比，0.04、0.4、4和40μg/ml的GTP作用于BAEC后8小时均可增加eNOSmRNA的表达水平，差异具有显著性（Table 2和Fig.3），且4μg/ml组的增加作用最强。0.4、4和40μg/ml的GTP作用BAEC12小时可以明显增加eNOS的蛋白表达水平，差异具有显著性（Table 2和Fig.4），4μg/ml组的增加作用最强。上述结果表明了绿茶茶多酚上调内皮细胞eNOS的表达,在一定范围内存在剂量-反应关系。

3.绿茶多酚对内皮细胞Cav-1基因表达的影响

4μg/ml的绿茶多酚作用于BAECs，与0h相比，Cav1的mRNA水平在4h开始下降（P＜0.05），8h降到最低（P＜0.05），12、16、24h的Cav1的mRAN表达水平与0h相比没有统计学意义（P＞0.05，Table 3和Fig.5）。4h时Cav1的蛋白降到最低，8h时有所增加，但仍比0h低（P＜0.05），

 

本实验表明绿茶茶多酚可以提高内皮细胞eNOS的蛋白表达和mRNA水平，并可以维持较长时间；且存在剂量反应关系,实验表明浓度为4μg/ml绿茶茶多酚增加其表达作用最强。绿茶中的主要活性成分是多酚类，主要认为是儿茶酚，占绿茶茶多酚重量的大约30％[12]。本实验揭示的茶多酚作用的最佳浓度为4μg/ml，则儿茶酚的浓度为1μg/ml。而以前研究显示人血清中儿茶素的最高浓度可以达到约1μg/ml[13]。因而本实验所揭示的最佳剂量水平同人体水平很接近，具有重要的实际指导意义。

我们曾报道过茶多酚可以抑制内皮细胞的NADPH氧化酶亚基P22phox和P67phox的表达，减少内皮细胞活性氧的产生，起到保护内皮细胞的作用[14]。本试验显示茶多酚可以提高内皮细胞的eNOS的蛋白和mRNA水平，说明茶多酚对内皮细胞中氧化还原体系的多种酶的表达有调控作用。天然多酚类抗氧化剂对内皮细胞的eNOS的表达有调节作用已有相关报道，如Jürgen F. Leikert发现红酒多酚处理人脐静脉内皮细胞可以提高eNOS的mRNA和蛋白水平，并可以增加NO的释放[15]。Xu等研究发现Cy3G（一种花青素）作用牛内皮细胞后，可以时间和剂量依赖性增加内皮细胞的eNOS的表达，而且是通过SrcERK1/2Sp1信号途径对eNOS进行调控的[16]。最近已经有学者提出氧化损伤是心血管疾病、糖尿病和胰岛抵抗的共同土壤学说，认为氧化损伤是这些疾病的共同原因[17]。作为抗氧化体系中重要的成分NO在抵抗活性氧的损伤中有重要的意义，茶多酚提高内皮细胞eNOS的基因和蛋白表达为增加NO的产生量和改善内皮功能提供了物质基础。茶多酚增加内皮细胞eNOS的表达和以前实验显示的茶多酚抑制NADPH氧化酶亚基和增加SOD的表达可以揭示饮茶改善内皮功能的内在机理。茶多酚对eNOS的mRNA和蛋白表达均有增加作用，说明茶多酚至少在转录水平上提高了eNOS的表达，进而增加蛋白表达。对eNOS转录水平的调节主要是调节转录因子的活性和对转录后的mRNA的稳定性的调节。茶多酚的主要成分EGCG作用的目标是转录因子和转录因子相关的信号转导。有研究表明EGCG可以通过调控P38MAPK等多条信号通路提高AP1的蛋白水平及其与DNA启动子的结合能力[18]。另一方面,我们在前面部分研究中观察到,红茶茶多酚能推迟和减弱AngII刺激的p38MAPK磷酸化,通过改变ROS水平影响细胞信号转导,由于细胞信号具有的复杂性,值得进一步研究。

Cav1作为eNOS的上游抑制分子[19]，而本实验的研究表明，绿茶多酚可以降低BACEs的Cav1蛋白和mRNA水平，因此初步得出绿茶多酚可以通过减弱Cav1对eNOS的活性抑制，为茶多酚应用于心血管疾病的预防的信号分子机理上有了进一步的了解，也为在其它细胞（如脂肪细胞）中研究茶多酚调控Cav1的机理提供可能性。

总之，本实验表明茶多酚可以提高牛内皮细胞eNOS的mRNA和蛋白表达，减低Cav1的mRNA和蛋白表达,这对于维持NO的水平,抵抗氧自由基对内皮的损伤，维持血管内皮的正常功能有重要的意义。

 

参考文献

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