达能营养中心第十届学术研讨会论文集

陈菲 张伟利 蒋明华 何稼敏

(上海交通大学医学院附属上海新华医院，上海市儿科医学研究所，上海，200092)

 

摘要：目的采集婴儿口腔颊粘膜细胞来测定婴儿体内的脂肪酸成份，来了解测定婴儿口腔颊粘膜细胞中的脂肪酸成份能否反映婴儿体内的脂肪营养状况。方法从2005年9月1日至12月30日采集了在上海交通大学医学院附属新华医院新生儿病房住院的新生儿共32例，其中足月儿27例（胎龄37-41周），早产儿5例（胎龄32-36周）。日龄0－30天（平均20天）。每例婴儿均同时采集口腔颊粘膜细胞和血液标本。采用气相色谱法测定婴儿口腔颊粘膜细胞，血浆和红细胞膜中的脂肪酸成份并进行比较。采用SPSS11.5版软件进行统计学分析。结果气相色谱法可测出婴儿口腔颊粘膜细胞中多种脂肪酸成份，婴儿口腔颊粘膜细胞中的AA和DHA的含量与血浆中AA和DHA的含量有显著相关，相关系数r分别为0.36（p=0.042）和0.38 (p=0.033)。口腔颊粘膜细胞中的AA/DHA比值与血浆和红细胞膜中的AA/DHA的比值无显著性统计学差异（p=0.134）。结论测定新生儿口腔颊粘膜细胞中的脂肪酸成份能反映新生儿体内的脂肪营养状况，由于采集口腔颊粘膜细胞较为简便易行，对婴儿无创伤，易为家属接受，因此特别适用于对新生儿和小婴儿的营养调查。

关键词：颊粘膜细胞；血浆；红细胞；脂肪酸；婴儿

 

必需脂肪酸对婴儿营养十分重要，尤其一些长链多价不饱和脂肪酸（LCPUFA），如二十二碳六烯酸（DHA）和花生四烯酸（AA）是婴儿脑和视网膜的重要组成成份[1，2，3]。以往我们要了解婴儿体内的脂肪营养状况主要是通过采集婴儿的血液标本来进行测定。由于婴儿采血比较困难，而且是创伤性的，家属往往不容易接受。尤其要对某地区婴儿进行较大样本的营养调查时，就需要有一种简单、方便、易行的方法。最近我们通过采集婴儿口腔颊粘膜细胞的方法来测定婴儿体内的脂肪酸成份。为了解测定婴儿口腔颊粘膜细胞能否反映婴儿体内的脂肪营养状况，我们将口腔颊粘膜细胞中脂肪酸的测定结果与血浆和红细胞膜中脂肪酸的测定结果进行比较。现将婴儿口腔粘膜细胞中脂肪酸的测定方法，以及与血浆和红细胞膜中的测定结果比较如下：

 

1 对象与方法

1.1 对象

从2005年9月1日至12月30日采集了在上海交通大学附属新华医院住院的新生儿共32例，其中早产儿5例（胎龄32-36周），足月儿27例（胎龄37-41周），日龄0-30天（平均20天）。所有入选的新生儿需符合以下标准(4)：

(1)无窒息抢救病史。

(2)婴儿未进行静脉营养，无输血及影响肠道营养吸收的病史。

(3)其母亲在孕期无糖尿病，结核病，高脂血症或已知对婴儿脂肪代谢造成影响的围产期疾病。

1.2 仪器和设备

采用日本岛津公司生产的GC-2010气相色谱仪，使用石英毛细管柱（0.32mm×60m），柱内涂有0.25μ二氧化硅熔胶（SP2330），采用氢焰离子化检测器（FID）。分析条件：进样室温度为250℃，压力为150KPa，总流量30.7ml/min；进样方式为分流进样，分流比为1∶12，进样量1μl；检测室温度为280℃。采用程序升温法：初始温度为140℃，维持3min，以4℃/min升温至212℃后，以2℃/min升温至220℃，维持15min至分析结束，总程序时间40min。

1.3 婴儿口腔颊粘膜标本的采集

使用适用于新生儿和婴儿的乳牙刷（台湾林哥婴儿用品有限公司生产）。该婴儿刷可戴在操作者的手指上伸入婴儿口腔内采集婴儿颊粘膜标本。在采血当天同时采集婴儿口腔颊粘膜标本。为了避免婴儿口腔中奶汁对测定的干扰，口腔颊粘膜细胞的采集在进食前进行，采集前用生理盐水清洁婴儿口腔。用消过毒的乳婴刷轻刮婴儿口腔粘膜表面，每刮2-3下后将婴刷放在生理盐水中洗涤，如此反复约3-4次，然后再采集另一侧的口腔颊粘膜细胞。两侧可交替进行。将采集的颊粘膜细胞收集在清洁的玻璃试管中，在4℃下3000转/分，离心10分钟，将离心后的细胞沉淀物在-80℃冰箱中保存[4]。

血标本采集：将采集到的婴儿血标本放在含有EDTA的抗凝管中，4℃下6000转/分，离心10min分离血浆和红细胞，将血浆置于-80℃冰箱冷藏待测。红细胞用生理盐水反复洗3次并离心，最后将上清液弃去。再加入l蒸馏水使红细胞溶血，然后在4℃下4000转/分离心1小时，用移液管将上清液吸去，留在试管底部的乳白色红细胞膜沉淀物在氮气下吹干，然后放入-80℃冰箱冷藏待测。

1.4 脂肪酸成份的测定

采用直接酯化一步法对上述各种标本中的总脂肪酸进行抽提和酯化。将脂肪的抽提物通过气相色谱仪进行脂肪酸成份的分析[5]。

1.5 统计学方法

所有实验数据用均值±标准差表示，采用SPSS11.5版统计软件。差异分析用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有显著统计学意义。LSD检验进行组间两两比较。当数据不满足方差齐性检验时，则进行LOG转换后再进行方差齐性检验。若仍不满足方差齐性要求，则用非参数统计方法，kruskalWallis和MannWhitney检验进行组间两两比较，结果用计算后所得的校正后的检验水准α分析。两两相关分析采用Pearson相关检验。若满足相关则进一步用Fishers检验回归方程的显著性。

2 结果

表1显示采用气相色谱法可测定婴儿口腔颊粘膜细胞中和血液中的多种脂肪酸成份，根据各脂肪酸百分含量的高低排序，列出含量占前8位的脂肪酸。从表中可见各组中占前几位的均是含16和18碳的长链脂肪酸。颊粘膜细胞与血浆中含量较多的前四位脂肪酸的排序相同，分别是油酸(18∶1n9)，软脂酸(16∶0)，亚油酸(18∶2n6)和硬脂酸(18∶0)。在红细胞膜中较长链的脂肪酸,如花生四烯酸（AA，20∶4n6）和二十二碳六烯酸（DHA，22∶6n3）的百分含量较高。

表1颊粘膜细胞中和血标本中脂肪酸

颊粘膜细胞和血浆及红细胞中脂肪酸的组成情况见表2。在n3系脂肪酸中α亚麻酸（LNA,18∶3n3）和DHA在各组间的含量均有显著性差异。口腔颊粘膜细胞中DHA的百分含量最低(0.74%)，而血浆和红细胞中的百分含量较高(分别是2.93%和7.08%,p＝0.00)。另外，口腔颊粘膜细胞中LNA的含量较高(1.29%)，而血浆和红细胞中较低(分别为0.60%和0.09%,p=0.00)。口腔颊粘膜细胞中的二十碳五烯酸(EPA,20∶5n3)(0.07%)低于血浆(0.16%)和红细胞膜中的含量(0.16%),(p=0.00)。n6系脂肪酸中，花生四烯酸在各组间均有显著性差异,口腔颊粘膜细胞中的含量(0.93%)低于血浆(4.53%)和红细胞(10.12%)中的含量。亚油酸在血浆中含量最高(21.19%)，其次为口腔颊粘膜细胞(13.86%)和红细胞(7.67%)，各组间有显著性统计学差异(p=0.00)。总的n6系脂肪酸的含量在血浆中最高（26.04±4.55），口腔颊粘膜细胞其次（15.02±3.70）。总的n3系脂肪酸在红细胞中最高（7.33±1.45），口腔颊粘膜细胞中最低（2.10±0.66）。AA/DHA的比值在各组间均无显著性统计学差异(p=0.134)。

 

 

表2颊粘膜细胞与血浆和红细胞中脂肪酸成份的比较（％）

表3显示口腔颊粘膜细胞中DHA和AA的含量与血浆和红细胞膜中含量的相关关系，口腔颊粘膜细胞中的AA和DHA的含量与血浆中的含量均相关，相关系数r分别为0.36(p=0.042),0.38(p=0.033),而与红细胞膜中的AA和DHA的含量均不相关。表4是比较早产儿与足月儿的口腔颊粘膜细胞，血浆和红细胞膜中的AA与DHA的含量。早产儿颊粘膜细胞中的DHA含量显著高于足月儿，有显著统计学差异（p＝0.014），颊粘膜细胞中的AA的含量也高于足月儿，但无统计学差异（p＝0.156）；早产儿与足月儿在血浆和红细胞膜中DHA和AA含量的比较均无显著性统计学差异。

表3颊粘膜细胞中AA和DHA的含量与血浆和红细胞膜中含量的相关分析

 

表4早产儿与足月儿AA与DHA含量的比较（％）

3

 

讨论

多年来对婴儿脂肪营养的研究均需采集婴儿的血标本，婴儿采血较为困难，而且是一种创伤性的方法，人们希望能有一种无创的方法来进行婴儿脂肪营养的研究，特别是对较小的婴儿和新生儿。通过口腔颊粘膜细胞来测定婴儿体内的脂肪酸成份是一种无创伤、方便易行、同时又易为病儿家属接受的方法。但口腔颊粘膜细胞中的脂肪酸含量较低,本实验采用较灵敏的气相色谱方法来测定新生儿口腔颊粘膜细胞中的脂肪酸成份并与婴儿血浆和红细胞膜中的脂肪酸成份进行比较,研究发现气相色谱方法可测出婴儿口腔颊粘膜细胞中的脂肪酸成份,并与婴儿血浆和红细胞膜中的脂肪酸成份显著相关。采集婴儿口腔颊粘膜细胞的方法简单易行，便于推广应用，可作为检测婴儿体内脂肪营养状况的一种新的方法。本实验的血标本采集仅在新生儿进行其它实验室检查时进行，减少了病儿的痛苦。口腔颊粘膜细胞的采集需与血标本的收集在同一时间进行。

Hoffman等报道给不同饮食喂养的婴儿测定其口腔颊粘膜细胞中的脂肪酸，如n3系和n6系脂肪酸及它们之间的比值，发现口腔颊粘膜细胞中的脂肪酸成份与他们饮食中的脂肪酸成份相关，口腔粘膜细胞中DHA的含量与血浆中的DHA含量高度相关（r＝0.83）；早产婴儿口腔粘膜细胞中的DHA含量与其视觉诱发电位的灵敏度显著相关(4)。Connor等也报道了婴儿口腔粘膜细胞中AA和DHA的含量与食物、血浆和红细胞中的含量都显著相关[6]。但也有一些作者在动物实验中发现小猪口腔粘膜细胞中的DHA含量与血浆和红细胞膜中的含量无明显相关[7]。各种研究报告结果不同的原因可能与食物中的脂肪酸对机体不同组织的作用时间长短不同有关。不同组织细胞的代谢周期不同，口腔颊粘膜细胞的更新周期较快约为5天，这与血浆成份的更新周期相似（约7-8天），而红细胞的更新周期较长（约为120天）。所以口腔粘膜细胞和血浆中的脂肪酸成份可能反映近期食物中的脂肪酸成份，而红细胞膜中的脂肪酸成份可能反映较长期饮食中的脂肪营养状况。[4、8、9]。本实验也显示新生儿口腔颊粘膜细胞中的AA和DHA的含量与血浆中的AA和DHA的含量显著相关。本实验也显示口腔颊粘膜细胞中AA/DHA的比值与血浆和红细胞膜中的AA/DHA的比值无显著的统计学差异，表明口腔粘膜细胞中AA/DHA的比值能反映血浆和红细胞膜中AA/DHA的比值。

本实验发现早产儿口腔颊粘膜细胞中DHA的含量显著高于足月儿，与足月儿有显著性差异，而其它脂肪酸无统计学差异。由于早产儿的例数较少还有待进一步研究。由于口腔颊粘膜细胞中脂肪酸的含量较低，本次实验仅仅是首次尝试对颊粘膜细胞中脂肪酸成份的测定，还未比较与食物中脂肪酸成份的关系。AA和DHA目前是人们研究的热点，它们不仅与人体许多生理功能有关，而且是组成细胞膜的重要成份[10]。

总之，本研究结果显示，采用气相色谱法可测定新生儿口腔颊粘膜细胞中的脂肪酸成份来反映新生儿体内的脂肪营养状况，口腔粘膜细胞中的DHA和AA的含量与血浆中的含量显著相关。口腔颊粘膜细胞中的AA/DHA比值能反映血浆和红细胞膜中的AA/DHA的比值。由于口腔粘膜细胞的采集较为简便易行，而且是无创性的，对于采血较为困难的人群，如新生儿和小婴儿可进行较大范围和较大样本的营养调查。为了进一步提高实验的正确度，避免婴儿口腔中残留的食物对测定结果的影响，下一步实验我们准备测定婴儿口腔颊粘膜细胞中的磷脂来进行脂肪酸成份的分析。

 

参考文献

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[2] Hoffman DR, Theuer RC, Castaneda YS, et al. Maturation of visual acuity is accelerated in breastfed term infants fed baby food containing DHAenriched egg yolk. J Nutr. 2004;134(9):2307-2313.

[3] Birch EE, Castaneda YS, Wheaton DH, et al. Visual maturation of term infants fed longchain polyunsaturated fatty acidsupplemented or control formula for 12 mo. Am J Clin Nutr. 2005;81(4):871-879.

[4] Hoffman DR, Birch EE, Birch DG, et al. Fatty acid profile of buccal cheek cell phospholipids as an index for dietary intake of docosahexaenoic acid in preterm infants. Lipids. 1999;34(4):337-342.

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[8] Josoph Sampugna, Luise Light, Mary G, et al. Cheek Cell Fatty Acids as Indicators of Dietary Lipids in Humans. Lipids. 1988, 23(1): 131-136.

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[10] Lund EK, Harvey LJ, Ladha S, et al. Effects of dietary fish oil supplementation on the phospholipid composition and fluidity of cell membranes from human volunteers. Ann Nutr Metab. 1999;43(5):290-300.

[11] Yoshida S, Yoshida H. Noninvasive analyses of polyunsaturated fatty acids in human oral mucosa in vivo by Fouriertransform infrared spectroscopy. Biopolymers. 2004;74(5):403-412.