达能营养中心在全球

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达能营养中心第十届学术研讨会论文集

不同剂量铁对小鼠肝脏损伤作用的实验研究

朱航1张守华2雷蕾1罗海吉1

（1．南方医科大学公共卫生与热带医学学院营养与食品卫生学系，广州，510515；
2．南方医科大学南方医院肝胆外科，广州，510515）

摘要：目的探讨不同剂量的右旋糖酐铁对小鼠肝脏抗氧化水平和病理损伤的影响。方法将雌雄各半的昆明小鼠随机分为4组，以不同浓度的右旋糖酐铁隔日腹腔注射（IP），注射6周后，测定肝组织中丙二醛(MDA)的含量、超氧化物歧化酶(SOD)以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)的活性，测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)活性，并做肝脏病理组织学检查。结果与正常对照组相比，肝组织中MDA的含量较对照组明显升高(P＜0.001),SOD和GSHPX的活性则明显下降(P＜0.001)。血清ALT、AST活性较对照组明显升高(P＜0.001),且有剂量效应关系；而血清AKP、ACP活性较对照组则无显著性差异(P＞0.05)。病理组织学检查，经铁染色后镜下可见低剂量组有少量铁均匀分布，中高剂量组则有大量铁存在。结论过量的铁可对肝脏造成严重的损害，且呈剂量依赖性，其机制可能与铁在肝脏内代谢释放出铁离子，游离的铁离子介导脂质过氧化而造成肝脏损害有关。
关键词：铁；肝损伤；脂质过氧化

Study of the Liver Damage Effect of Different Dosage of Iron Dextran
Zhu Hang1Zhang Shou Hua2Lei Lei1Luo Haiji1

(1.Department of Nutrition and Food Hygiene,Public Hygiene and Tropical Medicine School, 
Southern Medical 
University; Guangzhou 510515；
2.Departmen of Hepatobiliary，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515, China)

Abstract：ObjectTo stuty the level of mice liver antiooxyged and the degree of mice liver pathological damage through intraperitoneal injection 0f different dose of iron dextran. in mice．MethodMale and female mice were randomly divide into four groups and were ntraperitoneally injected with different doses of iron dexyran every the other day, for six weeks．The levels of MDA，SOD and GSHPX in the liver and the levels of ALT，AST，AKP and ACP in the bloodserums were measured．Pathohistology analysis of the liver was also performed．ResultComparing with the nomal group, the MDA level in the liver was significantly increased (P＜0.001), and the levels of SOD and GSHPX were dramatically decreased (P＜0.001)．There is no significant difference the levels of AKP and ACP between the normal group and the treated group．The pathohistology examination result showed that iron scatter in the lowdose treated group was more than that in the highdose group．Conclusion.Excess iron cause severe damage of the liver in a dose dependent manner． The  mechanism may be the ferrous which release from liver cause lipid peroxidation.
Keywords：iron; liver damage; lipid peroxidation 

口服铁剂是治疗缺铁性贫血等铁缺乏疾病的常用治疗方法，对口服无效或缺铁病人和怀孕妇女则需要注射铁剂治疗。临床上右旋糖酐铁是常用的注射用铁剂。然而长期注射会导致体内铁储留，形成慢性铁过载现象[1]，使组织和血清中的铁含量增加，引起器官的广泛受损[2,3]，其中首先受损的器官是肝脏[4]。目前在全世界，铁代谢疾病如血色素沉着症[5]是最普遍的铁代谢遗传性疾病之一，且此类患者体内组织和血清中铁含量的高低还没有一个有效的措施进行调控[6,7]，唯一的方法就是进行定期的放血治疗[8]。因此，增强对铁毒性致病机制的了解，对于为此类患者提供一个安全有效的治疗措施至关重要。本实验通过采用全价颗粒饲料(含铁量为370mg/kg)，辅以定期、定量腹腔注射右旋糖酐铁的方法建立了不同浓度铁对小鼠造成肝脏损害的动物模型[9]，并对此模型小鼠的各项指标等与正常小鼠进行比较，从而说明高铁对对肝脏的毒性作用，并对其致毒机制做初步探讨。

1 材料和方法
1.1 材料
实验于2006年5月7日在南方医科大学公共卫生与热带医学学院营养与食品卫生学系实验室进行。选择昆明小鼠40只，SPF级，雌雄各半，体质量18～22g，由南方医科大学动物实验中心提供(许可证号：2002-009 2004B023 2004A063)。随机（雌雄分养，不分体重）分成4组：对照组（腹腔注射生理盐水,0.8ml/次）10只，低剂量组（腹腔注射右旋糖酐铁,6.25mg/ml，0.8ml/次）10只，中剂量组（腹腔注射右旋糖酐铁，12.5mg/ml，0.8ml/次）10只，高剂量组（腹腔注射右旋糖酐铁，25mg/ml，0.8ml/次）10只。全价颗粒饲料，含铁量为370mg/kg，购自南方医科大学动物实验中心。右旋糖酐铁制剂，规格为2mL含50mg元素铁，浙江瑞安市制药厂出品，批准文号为国药准字H33021758。SOD、MDA试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。721分光光度计（上海第三分析仪器有限公司生产）、低温高速离心机（Bechman,MODEL AllegraTMX-22R,USA）、全自动生化仪（奥林巴斯AU5400）。
1.2 方法 
1.2.1 将4组小鼠雌雄分养于塑料不锈钢笼内，室内温度（23±3）℃，自由进食，喂以去离子水。各组以不同浓度（mg/ml）的右旋糖酐铁隔日腹腔注射（IP），注射6周。观察动物的一般状况。6周末，将所有动物处死，解剖。测定肝组织中丙二醛(MDA)的含量、超氧化物歧化酶(SOD)以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)的活性，全自动生化仪测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)活性；并做肝脏病理组织学检查。
1.2.2 生化指标的测定①肝匀浆丙二醛（MDA）含量:采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法；②肝匀浆超氧化物歧化酶（SOD）活性:采用黄嘌呤氧化酶法。③肝匀浆谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)的活性:采用二硫代双乙硝基苯甲酸(DTNB)显色法。④血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)活性：采用金氏比色法。
1.2.3 病理组织学检查①肉眼观察；②光镜检查（×100，×400）：常规切片，HE染色，观察其病理形态学改变；③铁染色分析：常规切片用Schmeltzer法进行铁染色，光镜下（×100，×400）观察铁的分布情况。
1.2.4 统计学分析文中数据采用SPSS10.0软件进行统计学处理，统计方法有单向方差分析，各组均数的多重比较等，结果用（x-±s）表示，以P＜0.05认为差异有统计学意义。


2结果
2.1 各组小鼠肝匀浆SOD、MDA、GSHPX
含量变化情况与正常对照组相比，肝组织中MDA的含量较对照组明显升高(P＜0.001),SOD和GSHPX的活性则明显下降(P＜0.001，表1)。
2.2 各组小鼠血清ALT、AST、AKP、ACP
活性变化情况
血清ALT、AST活性较对照组明显升高(P＜0.001),且有剂量效应关系；而血清AKP、ACP活性较对照组则无显著性差异(P＞0.05，图1)。
表1各组小鼠肝匀浆SOD、MDA、GSHPX含量


图1各组小鼠血清ALT、AST、AKP、ACP活性变化情况
fig.1The condition of activity changes for each group of rats serum ALT、AST、AKP、ACP

2.3 各组小鼠肝脏病理组织学检查
①对照组小鼠的肝脏肉眼观察未见明显的病理改变，光镜下细胞排列整齐，细胞形态规则，切片经Schmeltzer法染色后未见被染成蓝色的铁(图1,图5)；②低剂量组小鼠的肝脏有轻度增大，光镜下可见各脏器的细胞边界不清，排列紊乱，铁染色后可见有点状被染成蓝色的铁，分布均匀(图2,图6)；③中剂量组小鼠的肝脏可见轻度淤血，肝脏表面散在少量芝麻大小的黄色斑点；光镜下可见各脏器的细胞核消失，铁染色后，被染成蓝色的铁广泛存在(图3,图7)；④高剂量组小鼠肝脏有明显的淤血现象，整个肝脏呈黑色，脾脏也呈现铁褐色，两者的重量已达到体质量的10%左右；高倍镜下（×400）细胞出现坏死，汇管区有多处凝固性坏死灶，出现核固缩、溶解，大量细胞水样变性；铁染色可见普遍存在被染成蓝色的铁(图4,图8)。



3讨论
 含铁类物质引起的各种损害都与膜脂质过氧化有关。铁为过渡金属元素，有两种价态，铁能够通过改变价态而释放和接收电子在许多反应中起着传递电子的作用。铁在脂质过氧化中起着非常重要的作用〔10,11]。MDA是一种生物毒性很强的脂质过氧化作用的代表产物，可间接反应出细胞受损伤的程度[12]。Afanasev IB[13]等用体外实验的方法证明，当培养液中铁的浓度升高时，培养液中MDA的含量迅速升高。本实验高铁小鼠血清中MDA的含量较对照组分别升高了约3至4倍。说明右旋糖酐铁释放的铁离子能介导膜脂质过氧化产生大量的脂质过氧化产物。此外，机体内还存在对氧自由基的各级防御体系，其中SOD和GSHPx对机体的氧化与抗氧化平衡起着重要的作用，机体内的自由基会消耗肝脏中的SOD和GSHPx，当机体脂质过氧化水平升高时，SOD和GSHPx的活性会发生改变。周炯亮[14]等报道当肝细胞内的MDA含量升高时，GSH的含量下降。本实验组各组肝脏中MDA含量升高时，SOD和GSHPx的活性与正常组相比明显降低。这与大多数学者关于MDA与SOD、GSHPx在含量和活性上相关联的报道一致[15,16,17]，说明由于脂质过氧化作用消耗了大量的SOD和GSHPx，肝脏对自由基的清除能力下降，造成机体对自由基的防御体系被破坏。
肝细胞中内有许多与代谢有关的酶类，当肝细胞膜受到损害时细胞内的酶会渗漏到血液中，其中ALT和AST是肝脏受损最灵敏的指标，RONALD[18]等用含二茂铁的饲料喂食小鼠15周后,发现染毒组肝脏铁含量升高时,血清ALT活性较对照组升高了约4倍。VALERIO[19]等用含0.2%二茂铁的食物喂食小鼠115d后也发现血清中ALT活性明显升高。本实验高剂量组动物血清ALT活性与对照组相比升高了约7倍，说明辛基二茂铁对肝细胞膜的损伤较重，致使大量的ALT释放到血清中。
小鼠各肝脏病理学检查表明过多的铁可以损伤细胞，使细胞排列紊乱、边界不清，发生变性、坏死等病理改变。铁染色分析结果显示，实验组各脏器内含铁物质增多，光镜下可见染成蓝色的铁存在，且随剂量的增加而分布广泛。由于铁在细胞、组织内沉积，作为一种刺激因子，直接或间接地影响组织细胞代谢，组织内炎症改变十分明显，外观组织充血水肿，这与文献报道的结果相一致[20]。
总之，过量的铁在体内贮存可造成肝脏的广泛损伤，其作用机制可能与释放出的铁离子所诱导的膜脂质过氧化等有关，确切机制还有待于进一步研究。


参考文献
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