达能营养中心第十届学术研讨会论文集

何芳 冯磊 沈健

（浙江大学营养与食品安全研究所，杭州，310006）

前言
20世纪30年代Wernen根据50岁以上男子出现的神经心理症状、血管运动症状、体能下降和性功能减退症状症状(和妇女更年期综合征相似)首先提出了“男子更年期综合征”，开始引起了人们对男性健康的关注。随着微量检测技术的进步，近20年来许多学者纷纷从不同的角度证明血浆睾酮水平确实随年龄老化而减低，马萨诸塞大学和巴尔的摩大学则分别从横向和纵向研究进一步证明血浆睾酮水平随年龄老化而下降[1-2]。众多的研究证实了男子的雄激素分泌在青年期达到高峰后逐渐下降这一事实。世界上60岁以上的人口将由1999年的5.93亿（约占总人口的10%）增加到2050年的19.7亿（约占总人口的22%）[3]。随着世界人口老龄化的加快，中老年男子的健康问题也越来越引起人们的关注。
1998年2月第一届国际老年男性医学会议上，中老年男子部分性雄激素缺乏综合征（partial androgen deficiency of the aging male, PADAM）被提出。PADAM是指中老年男子随着年龄的增加而雄激素生成进行性下降，血清睾酮水平低于健康青年男性的正常范围（可以伴有或不伴有基因组对雄激素及其活性代谢产物敏感性的降低），并出现一系列雄激素部分缺乏的相应临床症状和体征的一组综合征。主要包括神经心理症状、血管运动症状、体能下降和性功能减退症状等，实验室检查表现为体内雄激素水平下降。目前国内外多采用睾酮补充治疗，睾酮治疗改变身体组成，提高体能、能提高性欲、纠正情绪障碍、提高骨密度，增加脂质代谢等，但是雄激素补充治疗引起的红细胞增多、前列腺增生症以及前列癌的潜在影响也引起人们的密切关注[4-6]，从而影响了睾酮补充治疗的临床应用。
研究证明，许多微营养素对于机体具有抗氧化作用，与人体的生殖功能、精子生成、雄激素合成与分泌都有一定的关系，尤其是维生素A、维生素C、维生素E、微量元素锌和硒[7-10]。但目前对于如何建立PADAM的动物模型还没有报道，通过查阅文献发现在衰老的动物模型中动物的雄激素水平是下降的，因此本实验通过建立衰老的动物模型来研究补充维生素A、维生素C、维生素E、微量元素锌和硒几种微营养素复合制剂对致衰雄性小鼠雄激素水平的影响和抗氧化作用。

实验材料
1.实验动物
实验动物为ICR小鼠，雄性，三个月龄体重30g~40g，清洁级，由浙江省实验动物中心提供。动物饲料由浙江大学实验动物中心提供，执行标准GB12924-94。饲养条件符合浙实动设施标准第2001001号的要求。

2.主要试剂
2.1. 硫酸锌（ZnSO4·7H2O）：批号：2005年2月23日由杭州诺金食品有限公司提供。

2.2. 维生素C：批号：2005年2月23日由杭州诺金食品有限公司提供。

2.3. 维生素A：批号：2005年2月23日由杭州诺金食品有限公司提供。

2.4. 维生素E：批号：2005年2月23日由杭州诺金食品有限公司提供。

2.5. 亚硒酸钠（1%Na2SeO3）：批号：2005年2月23日由杭州诺金食品有限公司提供。

2.6. 游离睾酮（0.25g/支）：批号：20050305由浙江省计划生育研究所提供。

2.7. 睾酮测定试剂盒（DSL-10-4000）：LOT：03295，DSL公司出品。

2.8. 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力测试盒：批号：200500514购南京建成生物有限公司。

2.9. 超氧化物歧化酶（SOD）活性测试盒：批号：20050514购南京建成生物工程研究所提供。

2.10.D半乳糖：批号：20030828上海试剂二厂

2.11.其他试剂均为国产（分析纯）。

3.主要试剂配制

3.1 剂量换算
根据人（70kg）与小鼠（20g）剂量换算比例为0.0026[11]，根据人体微营养素摄入量UL值，计算小鼠所需剂量。维生素A：0.39μg/g；维生素E：0.104mg/g；维生素C：0.13mg/g；ZnSO4·7H2O：0.029mg/d；1%Na2SeO3：8.34μg/g；睾酮：0.0325mg/g。

3.2 微营养素复合制剂的制备
称取维生素E 1.26g，维生素A 2.4mg，用研钵将维生素A和维生素E研磨加入两滴助溶剂吐温-80和少量蒸馏水，使其充分混合再加入维生素C 0.78g、ZnSO4.7H2O 0.3mg、Na2SeO384.3μg使均匀混合后用蒸馏水定容至60mL，放在4℃冰箱中备用。

3.3 D半乳糖溶液的配制
取D半乳糖25g，生理盐水250mL，将25g D半乳糖倒在500mL的烧杯中，倒入生理盐水200mL，用玻璃棒搅拌使其充分溶解，放入试剂瓶中。用剩下的生理盐水冲洗烧杯和玻璃棒，将冲洗液也倒入试剂瓶中摇晃使其充分混合。放置4℃冰箱中备用。

3.4 游离睾酮稀释液的配制
取游离睾酮1mL，加几滴无水酒精使其溶解，再加生理盐水153mL充分混合后，放置4℃冰箱中备用。

实验方法
1.亚急性衰老动物模型的建立及处理

1.1 亚急性衰老动物模型建立的方法：
给三个月龄ICR雄性小鼠，每天颈背部皮下注射D半乳糖（配制同前）1mg/g，连续8周即可造成亚急性衰老模型，其衰老程度接近与21个月龄水平[11]。

1.2 实验处理及分组
将三个月龄的ICR雄性小鼠60只，按体重随机分成两个组，即正常对照组（12只）、衰老模型组（48只）。正常对照组和造模组每天颈背部皮下按0.1ml/10g剂量分别注射生理盐水和D半乳糖。两个组小鼠均自然进食正常饲料，自由饮水。持续8周后取尾血测定全血中谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）和红细胞中超氧化物歧化酶（SOD）酶活性，将确定造模成功小鼠取尾血测定血清中雄激素。按血清雄激素水平将致衰小鼠分为模型对照组、微营养素组、雄激素组、微营养素+雄激素组四个组,每组12只。模型对照组小鼠每日给予蒸馏水灌胃，微营养素组小鼠每日用微营养素复合制剂灌胃，雄激素组小鼠每周背部皮下注射一次游离睾酮，微营养素+雄激素组小鼠每日用微营养素复合制剂灌胃且每周背部皮下注射一次游离睾酮。四组小鼠每日均自然进食普通饲料，自由饮水，每周称量体重一次，持续4周。取小鼠血清及肺、心、脑、肝脏组织测定血清睾酮水平、组织中谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）活性、超氧化物歧化酶（SOD）酶活性。

2.观察指标，原理及方法

2.1 组织匀浆制备
将所有试验小鼠以颈椎脱臼法处死，迅速进行解剖，以眼科小剪将肺、肝、心以及脑组织剪下，而后立即将组织块置入冰冷的生理盐水中漂洗，以除去血液，用滤纸拭干后，将其放入冰浴的小烧杯中。用量筒取出少量预冷的生理盐水（0.86%的氯化钠溶液），为组织重量的9倍，用组织捣碎机上下研磨制成10%组织匀浆。而后将所有的组织匀浆都置入-70℃冰箱保存备用。

2.2 红细胞超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定：按试剂盒测定步骤进行。

2.3 全血中谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）活力的测定：按试剂盒测定步骤进行。

2.4 组织匀浆中超氧化物歧化酶（SOD）的测定：按试剂盒测定步骤进行。

2.5 睾酮水平测定：按试剂盒测定步骤进行。

统计分析
采用SPSS12.0 for windows统计软件。计量资料分别经正态分布和方差齐性检验，方差齐性采用方差分析两两比较得到相应的P值，方差不齐采用非参数检验。同组样本实验前后比较采用t检验。P＜0.05为显著性差异。所有数据以(x-±SD）表示。
实验结果
3.1 D半乳糖致衰模型的建立
每天给模型组小鼠于颈背部皮下注射D半乳糖，连续8周，取尾血测定血中的谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）活力和红细胞超氧化物歧化酶（SOD）活力。进一步确定模型成功建立。
衰老模型组与正常对照组比较，全血中的谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）活力和红细胞超氧化物歧化酶（SOD）活力两项生化指标都降低，并具有明显差异，说明模型建立成功。见表1。

表1正常对照组与衰老模型组GSHPx
和SOD活力的比较（x-±SD）

3.2 微营养素对致衰小鼠雄激素水平的影响
微营养素对致衰小鼠血清雄激素水平实验前后比较，三个实验组血清雄激素水平在实验后较实验前均有升高，且实验后血清雄激素升高具有显著性差异。实验后三个实验组间雄激素比较无显著性差异。见表2。

表2微营养素对致衰小鼠雄激素水平
实验前后比较（x-±SD）

3.3 微营养素对致衰小鼠肺、心、脑、肝脏
GSHPx活力的影响
微营养素对致衰小鼠不同脏器GSHPx活力均有升高，微营养素组在心、肺、脑匀浆中GSHPx的活力明显高于模型对照组在统计学上有显著性差异。见表3。

表3微营养素对致衰小鼠肺、心、脑、肝脏GSHPx活力的影响（x-±SD）

3.4 微营养素对致衰小鼠肺、心、脑、肝脏
总SOD活力的影响
微营养素对于致衰小鼠不同脏器SOD活力有升高的趋势，特别在心和脑匀浆SOD的活力微营养素组与模型对照组比较具有显著性差异。见表4

表4微营养素对致衰小鼠肺、心、脑、肝脏总SOD活力的影响（x-±SD）

讨论
D-半乳糖致衰模型是国内外众多学者研究后提出的一种“早衰老”动物模型，是基于衰老的代谢学说而复制的衰老模型，该模型系在一定的时间内给动物连续注射D-半乳糖，使其细胞内半乳糖浓度增高，在醛糖还原酶催化下，还原成半乳糖醇，后者不能被细胞进一步代谢而堆积在细胞内，影响正常渗透压，导致细胞肿胀，功能障碍，代谢紊乱，最终机体衰老[12]。其各项指标已具备老年小鼠的特征，以往的众多实验也充分证明了它是稳定、可靠的衰老模型。动物实验表明，大鼠经皮下注射D-半乳糖后，免疫与性器官重量明显减轻及性激素水平降低。衰老的免疫学说认为免疫功能与性功能的逐渐变低导致机体衰老[13]。自从Harman在1955年提出了自由基理论，阐明了其在衰老过程中的可能机制以来[14]，经过半个多世纪的进一步研究，大量的流行病调查[15]、动物试验[16]以及人群干预试验都表明，自由基导致的损伤，不仅影响人体的衰老过程，而且在许多疾病，比如心脑血管疾病[17,18]，肿瘤[19]，糖尿病等[20]的发生发展过程中都起到了至关重要的作用。自由基的强氧化活性引发脂质过氧化，改变细胞膜的稳定性，从而使细胞的结构和功能发生退行性改变，还可以与蛋白质形成复合物，积累成脂褐质，直接或者间接危害人体器官的功能，导致代谢失调，和机体的衰老；同时，自由基还可能导致类似于放射暴露所造成的DNA损伤[21]包括DNA的单链或者双联的断裂，DNA的氧化损伤及DNA加合物的形成，从而通过基因突变，或者原癌基因激活及抑癌基因的失活在肿瘤的引发和促进阶段发生作用，并最终导致肿瘤的形成。自由基能够导致脂质过氧化，从而损伤膜的功能和完整结构，并使一些能够识别膜上受体而发挥生物学活性的酶失活，造成细胞损伤[22]。除此以外，它还会导致蛋白质的氧化失活，造成DNA的氧化损伤，从而使基因易于发生突变。衰老或老化机体存在着一定的抗氧化能力衰退或下降趋势，具体表现为自由基代谢异常，体内MDA含量升高，SOD、GSHPx等抗氧化酶活性降低，使积聚过多的自由基首先对线粒体内膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化发应，最终可导致维持正常生命活动的能力减少，新陈代谢紊乱，自身内外环境调节功能失衡，加快了机体的衰老和死亡[23]。SOD广泛存在于生物体内，SOD是体内重要的抗氧化酶，是唯一能够特异性地清除重要的衰老启动因子超氧自由基（·O2-）的抗氧化物。SOD是人体抗氧化的一线酶，起到至关重要的作用，它能够歧化·O2-为H2O2，从而减少了形成氧化型更强也更难清除的·OH形成的危险[24]。SOD能够阻断由·O2-或由外界进入体内的一些药物或毒物及由辐射产生的氧离子起到积极的作用[25]。它的活性下降使自由基产生过量，引起不饱和脂肪酸氧化生成过氧化物，形成脂褐素和使DNA、蛋白质和酶等改变、破坏，从而加速衰老[26]。GSHPx是动物体内的一种含硒酶，具有清除过氧化物和保护细胞免于氧化损伤，通过阻断LOOH引发自由基的二级反应，从而减少LOOH对生物体的损害，保护细胞膜系统免遭过氧化的损伤[27]。GSHPx的主要生理功能是维持细胞内较低氢过氧化物水平，减少潜在的自由基损伤，它是氢过氧化物的第二道防线，能够催化还原型的谷胱甘肽转变成为相应的氧化态，即二硫化谷胱甘肽[28]，通过谷胱甘肽还原酶和黄素腺嘌呤脱氢酶将氢过氧化物分解为水[29]。
研究发现，许多微营养素与机体的生殖功能、精子生成、雄激素合成与分泌、自由基的清除、及抗氧化作用都有一定的关系，尤其是维生素A、维生素E、维生素C、微量元素锌和硒。
锌是人体必需的微量元素，它是人体多种酶的辅因子，并调控其活性。它可能并不与氧化剂直接作用，而主要是通过稳定细胞膜的结构和作为SOD的一种结构成分，间接地发挥作用[30]。缺锌使DNA、RNA聚合酶活性降低,DNA、RNA和蛋白质合成障碍,使细胞增殖受阻。同时使3β羟类固醇脱氢酶活性降低,则使睾酮合成障碍[31]。试验表明，给小鼠富锌饲料或给予锌补充，其血浆，肝和胰腺的MDA水平较对照组显著降低，而其中血、肝中GSH含量和SOD活性则明显升高，表明锌在控制体内过氧化脂质的过程中起到重要作用[32]。

锌是存在于精液中的一种重要的微量元素，精浆锌对男性生殖功能有非常重要的作用：参与生殖系统多种酶的组成；可延缓精子细胞膜的脂质氧化，以维持胞膜结构的稳定和通透性，在精浆缺乏锌时，精浆超氧化物歧化酶含量降低，氧自由基产生增加，精浆抗氧毒性能力下降。研究表明，锌缺乏的动物，睾丸活检发现间质细胞减少，长时间锌缺乏可导致血清睾酮和LH水平降低[33]。锌不足可影响下丘脑—垂体—性腺轴，而使垂体分泌的促进腺激素减少，影响了Leydig细胞睾酮合成功能，体内睾酮水平下降；睾酮的合成需要多种与锌有关的酶的参与才能完成，因而锌缺之可使睾酮合成减少[34]；缺锌对睾丸有特殊损害作用，影响间质细胞（Leydig细胞）产生和分泌睾酮。
硒是人体重要的微量元素，其主要生物学作用是构成谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)的重要成分，催化还原型谷胱甘肽(GSH)为氧化型谷胱甘肽(GSSG)，使有毒的过氧化物变成无毒的羟基化合物。硒在男性生殖过程的作用已经越来越引起人们的重视。据最新研究报道[35]，人类精子线粒体囊泡中存在一种特异GSHPx称为磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)，硒是其重要组成成分。在精子细胞中，PHGPx具有与其他GSHPx相同的过氧化物酶活性，但随着精子的成熟，其过氧化物酶活性逐步失活，并最终成为精子线粒体结构蛋白的一部分，对维持精子鞭毛结构和功能的完整性有重要作用。精液缺硒引起的精子质量下降可能与缺硒引起的抗氧化作用下降有关[36]。它作为一种抗氧化物质,在体内外均有抑制脂质过氧化作用，认识硒对性腺细胞睾酮的合成具有一定的影响,为从营养角度防治PADAM开劈新途径。近年来，硒作为是谷胱甘肽的活性结构含硒半胱氨酸的必要组成成分，其抗氧化特性受到了广泛的关注。硒是近年来受到广泛关注的一种微量元素。含硒蛋白，包括许多有重要功能的酶都是硒依赖的，硒代半胱氨酸占据着其中的活性位点，作为氧化还原中心，在含硒酶如硫氧还蛋白还原酶，在DNA合成过程中还原核苷酸，以及维持细胞内的氧化还原状态中都起到了重要的作用。硒最众所周知的氧化还原功能，是通过硒依赖的谷胱甘肽过氧化物酶家族还原氢过氧化物和已发生损伤的脂质和磷脂氢过氧化物转化为无害的产物如水和乙醇这些功能有助于维持细胞膜结构的完整性，并保护前列环素产物和脂质，脂蛋白以及DNA等免受氧化损伤[37]。
维生素E又名生育酚（tocopherol），具有α、β、γ、δ四种异构体，其中以α生育酚的生理活性最高。其C6上的-OH及易被氧化，是其具备抗氧化作用的关键结构，维生素E在自然界分布广泛，主要存在于植物油中。
维生素E作为人体一种必需维生素，它具有较强的抗氧化作用，即能清除自由基，对抗生物膜磷脂中多不饱和脂肪酸的过氧化反应，避免脂质过氧化物产生，从而保护生物膜结构和功能[38]。对生殖功能又有重要作用。当人类缺乏维生素E时，体内过氧化物增多而引起蛋白质、基因损伤，影响Leydig细胞合成睾酮的功能导致体内睾酮水平下降。由于脑垂体和肾上腺内有很高浓度的维生素E，能刺激这两个腺体的促性腺激素，并在中枢神经内调节性腺功能[39]，对于治疗男性性功能减退有很好的疗效，大鼠缺乏维生素E时，生殖器官受损,雄鼠睾丸萎缩[40]。
维生素A是一种具有β白芷酮环的不饱和一元醇。天然维生素A包括A1及A2两种，A1即视黄醇，A2即3脱氢视黄醇，其前身物质为胡萝卜素，通常以β胡萝卜素为代表，但它只有视黄醇1/6的生物学活性。
维生素A的基本作用包括：促进发育及维持健康；参与糖蛋白合成，作为单糖转运载体；抗癌和抗氧化作用；以及对于调节细胞的生长、分化与分裂等都具有重要作用。在生殖功能方面的作用与其对生殖系统上皮组织的影响有关。维生素A在生长发育以及在维持机体正常生理功能方面都发挥重要作用。维生素A缺乏会导致暗适应力下降、生长迟滞、睾丸、卵巢等器官萎缩、影响雄性动物精子的生成、上皮细胞角化过度等，还可导致大鼠精子生成量、支持细胞和精曲小管生精功能的改变[41]。维生素A缺乏阻碍各级生精细胞生长发育，导致睾丸组织萎缩（脏器系数下降），睾酮生成水平下降，精子数也减少，畸形精子数增多，对精子发育有明显作用[42]。
维生素C又名抗坏血酸（ascorbic），是一种含有6个碳原子的酸性不饱和多羟化合物，以内酯形式存在，具有酸性，能防治坏血病。维生素C在细胞内，是一个强还原剂或电子供体，抗氧化是维生素C的一个主要功能，它可以还原超氧化物、羟基、次氯酸及其他活性氧化物，这些氧化物可损伤DNA，并可影响DNA转录、蛋白质或膜结构，维生素C由于其还原性质，可使双硫键（-S-S-）还原为巯基（-SH），在体内与其他抗氧化剂一起清除自由基。另外，维生素C可促进维生素E再生（维生素C可能在脂质颗粒或膜中把电子传递到生育酚），减少低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）的氧化，有利于胆固醇存储于胞质脂质体内，促进睾酮的生成。
综上所述，本实验主要通过对致衰雄性小鼠补充维生素A、维生素E、维生素C、微量元素锌和硒五种微营养素的复合制剂观察小鼠雄激素水平的变化及抗氧化酶的活性，结果发现致衰小鼠的雄激素水平实验后高于实验前，在微营养素组这种差异具有显著性。本实验造模成功的小鼠也显示SOD和GSHPx活力下降，给予微营养素复合制剂后SOD和GSHPx活力均有升高且具有显著性差异。维生素A、维生素E、维生素C、微量元素锌和硒是机体必需的营养素，它们是机体多种酶的辅因子，并调控其活性。通过不同的途径直接或间接地调节机体雄激素的生成和自由基的清除发挥抗氧化的作用。对于以上五种微营养素作用机制已有相关报道但将其复配后研究尚少。本研究也只是将复合制剂对雄激素影响及抗氧化作用做了一个初步的研究，然而对其机理方面还需进一步的探讨。

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