达能营养中心第十届学术研讨会论文集

（第三军医大学营养与食品卫生学教研室，重庆，400038）

摘要:目的探讨膳食脂肪酸摄入及体内脂肪酸组成对乳腺癌发生的影响，为从膳食途径上预防乳腺癌的发生提供科学依据。方法通过病例-对照研究，采用半定量食物频数表调查试验人群的膳食脂肪酸摄入情况，并通过气相色谱法及电化学发光法检测血浆脂肪酸及性激素的水平，使用SPSS13.0软件比较各组脂肪酸及性激素水平的差异并分析不同暴露水平与乳腺癌发生风险的相关性。同时，通过动物实验研究不同组成及配比的膳食脂肪酸干预对化学致癌剂MNU诱导下大鼠乳腺癌发生的促进/抑制效应。结果人群试验显示乳腺癌组在绝经前、后的膳食纤维及MUFA摄入水平显著低于对照组，而n6 PUFA摄入水平及n6/n3比均显著高于对照组(P＜0.05)。同时，绝经前、后女性血浆C16∶0及C18∶1水平与乳腺癌的发生呈显著的负相关，而高水平的C18∶2则是乳腺癌发生的危险因素。此外，绝经前期女性血浆高水平的C18∶0也能增加乳腺癌的发病风险。动物实验发现，n6 PUFA和n3 PUFA之间的1∶1平衡摄入较过多摄取n6 PUFA或n3 PUFA以及摄取单一的SFA、MUFA等更能有效预防乳腺肿瘤的发生。结论n6 PUFA在膳食及血浆水平的升高均可增加乳腺癌发生的风险，而MUFA水平则能降低该风险，这提示合理的n6/n3比例以及SFA：MUFA：PUFA比例可能是影响乳腺癌发生的主要因素。居民应当在合理控制总脂肪、总SFA的前提下，适当降低n6 PUFA的摄入而增加n3 PUFA及MUFA的摄入。

第一部分人群研究材料与方法
1.研究对象
通过与重庆市多所三甲医院乳腺中心、普外科及体检中心的合作，在2004年6月至2006年12月间选取以往未经过任何治疗的乳腺癌、乳腺良性疾病的新发病例作为病例组，所有病例均经过组织病理学确诊。同时，选取经全面体检排除患有营养相关疾病、内分泌系统疾病以及肿瘤的女性作为健康对照，并将病例组和对照组按照月经状态分层。调查对象均为在当地住满5年的重庆市女性居民，且同意配合本课题全部的调查内容并提供相应标本。

2.研究内容及方法

2.1 常规危险因素调查
结合国内外乳腺癌危险因素的研究现状，选择与乳腺癌发生有明显关联的因素并结合其医学及社会学特征将其定量或分等级调查。调查内容主要包括以下四个方面：(1)人口社会学特征：年龄、文化程度、BMI值、家庭收入、Engel系数等；(2)月经、生殖因素：初潮年龄、初婚年龄、初产年龄、产次等；(3)生活方式：饮酒、吸烟及被动吸烟、饮茶、人际关系等；(4)既往疾病史及家族史：内科病史、外科病史、生殖系统疾病史、乳腺良性疾病史等共54项指标。

2.2 膳食调查
采用周紫垣等[1]制定的重庆地区人群半定量食物频数问卷调查表，该表包括了谷类、瓜茄类、豆类及豆制品、水果类、坚果类等12大类共119种食物的食用频率以及每次食用相当于份重的倍数。所有的问卷调查均由经培训的调查员按统一标准实施。调查过程中主要询问被调查者过去1年(乳腺疾病患者调查患病前1年)的膳食摄入情况以及近年来膳食结构的变化情况，同时还兼顾了食物的季节供应系数和个人饮食习惯。当天完成的调查记录由专职核查员核查并输入。

2.3 标本搜集和处理
所有研究对象在抽血前晚均进行低脂饮食，并于当日上午7时～9时抽取空腹静脉血5～7ml，EDTA抗凝。对于绝经前女性，就近抽取卵泡中期或黄体中期的血样。乳腺癌及乳腺良性疾病组抽血均在术前完成。血样经专人用冰盒运回实验室，并在低温条件下分离成血浆、白细胞和红细胞后分装并置于液氮中保存。

2.4 试验人群体内脂肪酸组成谱检测
2.4.1 样品的预处理
血浆的预处理按照Masood等[2]的方法，按照甲酯化一步法进行。
2.4.2 气相检测
通过色谱条件优化，保证混合脂肪酸甲酯标准品(Sigma公司)中的37个组分具有良好的分离度和重现性。色谱条件为Agilent 6890N气相色谱仪并配置氢离子火焰检测器（FID）。采用DB-23石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm，Agilent J&W Scientific公司)，载气为高纯氮气（99.999％）。运用程序升温法，初始温度50℃，保持1min，以25℃/min升至175℃，再以4℃/min升至230℃，保持5min。进样口温度为250℃，检测器温度为260℃，分流比采用50 ∶1。
2.4.3 气相结果分析
在相同色谱分析条件下进行样品的检测，根据样品与标准品的保留时间对比确定样品色谱图中各峰的种类。再用面积归一化法来计算各脂肪酸的相对百分含量。各脂肪酸的百分含量＝(各脂肪酸峰面积/脂肪酸峰面积总和)×100%。
2.5 血浆性激素水平检测
为了排除其它因素对性激素水平的干扰，本研究部分剔除了各试验人群中月经紊乱者、近6个月内哺乳或妊娠者以及近6个月内服用过雌激素或进行激素替代治疗者。各组样品采用电化学发光法(Elecsys 2010，罗氏公司)检测血浆中雌二醇(Estradiol, E2, pg/ml)、孕酮(Progestrone, P, ng/ml)以及睾酮(Testosterone, T, ng/ml)的水平，试剂代码如下：E2(03000079)、P(12145383)、T(11776061)。
所有的血浆样品均在同一个实验室、同一个批次内检测完。激素的检测限如下：E2(5.0pg/ml)、P(0.03ng/ml)、T(0.02ng/ml)。参照Hankinson等(1998)的方法，对于样品激素水平在检测限以下的，取该检测限的一半作为检测结果。

3.统计分析
运用SPSS13.0软件进行实验资料的统计分析。采用相对危险度的近似估计值比数比(OR)及其95％可信限(CI)来估计各危险因素与乳腺癌发生的关联强度。乳腺癌相关危险因素转化成等级资料表示，并用非条件logistic回归经单因素和多因素检验来判断绝经前、后乳腺癌及乳腺良性疾病的主要危险因素。正态分布的连续型变量(如膳食营养素摄入水平)的水平以x-±s表示，用方差分析比较各组之间的差异。非正态分布的指标(如血浆游离脂肪酸水平以及性激素水平)用中位数及P25~P75的百分位间距表示，并用秩和检验来比较三组人群的水平差异。
主要研究结果
1.研究对象的人口社会学特征
在2004年6月至2006年12月期间，通过以医院和社区为基础的病例-对照调查，剔除拒绝参加全部调查内容者、客观上无法配合者以及资料(包括SQFFQ调查、血样)丢失或不全者，按月经状态分层后，最后纳入研究的人数及各组人群的年龄、居住地、教育水平、家庭收入等人口社会学特征见表1(其中A组代表乳腺良性疾病组，B组代表乳腺癌组，C组代表健康对照组，以下表格与此同)。
2.乳腺癌的常规危险因素研究
将常规因素调查表中的54个变量逐个引入非条件Logistic回归模型进行单因素分析，在α＝0.10的水平上筛选出具有显著意义的变量，随后对此单因素分析的结果以年龄作为协变量进行多因素回归，最终在α＝0.05水平上选择回归模型的危险因素。经分析，绝经前、后乳腺癌发生的共同危险因素为教育程度高(OR:8.49,5.95)、精神伤害史(OR:2.08,9.03)、经常痛经(OR:4.15,16.67)、乳腺良性疾病史(OR:8.70,5.68)以及恶性肿瘤家族史(OR:3.41,8.23)，而人际关系好(OR:0.27,0.15)和月经规则(OR:0.47,0.19)为共同的保护因素；此外，影响绝经前乳腺癌发生的因素还有流产次数多(OR:3.55)、初潮年龄大(OR:0.16)和累计哺乳时间长(OR:0.26)，而绝经后BMI值大(OR:3.66)、行经年数长(OR:3.95)和生殖系统疾病史(OR:3.77)亦为乳腺癌发生的危险因素，具体结果见表2。影响乳腺良性疾病发生的主要因素与此类似，主要是教育程度高、职业接触少、人际关系好、初产年龄大、累积哺乳时间长、行经年数长以及恶性肿瘤家族史等。
3.膳食脂肪酸摄入与乳腺癌发生的相关性
3.1 各组人群膳食营养素摄入水平及其与乳腺癌发生的风险
结合半定量食物频数表的调查结果运用中国食物成分表(2002，2004)来计算该对象平均每天的能量、总蛋白、总脂肪、膳食纤维等常量营养素以及各种脂肪酸的摄入量，计算结果按照人群分组和月经状况分类保存。经方差分析发现，各组间的膳食总能量、碳水化合物、蛋白质、总脂肪、胆固醇、SFA及n3 PUFA的摄入水平在绝经前、后均无明显差异。同时，乳腺癌组的膳食纤维及MUFA摄入水平在绝经前显著低于乳腺良性疾病组和健康对照组(P＜0.05)，而n6 PUFA摄入水平及n6/n3比均显著高于乳腺良性疾病组和健康对照组(P＜0.05)，乳腺良性疾病组和健康对照组之间无显著性差异；在绝经后期，乳腺癌组及乳腺良性疾病组的膳食纤维及MUFA摄入水平显著低于健康对照组(P＜0.05)，而n6 PUFA摄入水平及n6/n3比均显著高于健康对照组(P＜0.05)，乳腺癌组和乳腺良性疾病组之间无显著性差异。
各组人群膳食摄入营养素的水平以及组间比较的结果见3。进一步分析膳食营养素摄入水平与乳腺癌发生的风险，采用Logistic回归分析并以年龄、总能量和各组相应的危险因素来调整OR值，结果发现与最低分位数相比，绝经前、后期最高分位水平的膳食纤维(OR:0.52,0.48)及MUFA(OR:0.64,0.59)摄入对乳腺癌发病具有保护作用，而高水平的n6 PUFA摄入(OR:1.67,2.15)及n6/n3比(OR:1.54, 2.89)则是乳腺癌的危险因素。

表1研究对象的人口社会学特征

Table 1Baseline characteristics of cases and control subjects

表2乳腺癌的多因素logistic回归分析结果
Table 2Multifactors logistic regression analysis of the breast cancer group

表3各组人群膳食营养素的摄入水平
Table 3Baseline characteristics of average daily nutrients intake among cases and controls

3.2 各组人群膳食脂肪酸的摄入水平

根据膳食调查结果计算乳腺癌组、乳腺良性增生组以及健康对照组平均每日摄入的总脂肪酸以及各种脂肪酸的质量，换算成单一脂肪酸占总脂肪酸的比例，得到各组人群的膳食脂肪酸摄入水平，并以方差分析比较差异。结果显示，乳腺癌组的膳食C18∶1摄入比例在绝经前显著低于乳腺良性疾病组和健康对照组(P＜0.05)，而C18∶2摄入比例显著高于乳腺良性疾病组和健康对照组(P＜0.05)，乳腺良性疾病组和健康对照组之间无显著性差异；在绝经后期，乳腺癌组及乳腺良性疾病组的C18∶1摄入比例显著低于健康对照组(P＜0.05)，而C18∶2摄入比例显著高于健康对照组(P＜0.05)，乳腺癌组和乳腺良性疾病组之间无显著性差异，具体结果见表4。

4.血浆脂肪酸组成谱与乳腺癌发生的相关性
计算各脂肪酸占总脂肪酸的百分比并建立各组人群血浆脂肪酸组成谱的本底数据库，结果见表5-6。进一步分析血浆总的SFA、MUFA、PUFA以及主要游离脂肪酸的不同水平与乳腺癌发病的相关性，并用年龄、总能量以及各期内乳腺癌相应的危险因素作为协变量调整OR值，结果发现与最低分位数相比，绝经前、后期最高水平的C16∶0(OR:0.34,0.48)、C18∶1(OR:0.57,0.42)对乳腺癌的发生具有保护作用，而高水平的C18∶2则是乳腺癌发生的危险因素(OR:2.31,2.67)。此外，绝经前期女性血浆高水平的C18∶0也能增加乳腺癌的发病风险(OR:2.35)，具体结果见表7-8。

表4各组人群膳食脂肪酸的摄入水平
Table 4Baseline characteristics of average daily fatty acid intake among cases and controls

表5绝经前期试验人群血浆脂肪酸的组成谱
Table 5Plasma fatty acid profile in the premenopausal study population

表6绝经后期试验人群血浆脂肪酸的组成谱
Table 6Plasma fatty acid profile in the postmenopausal study population

续表6

表7绝经前期试验人群血浆脂肪酸水平与乳腺癌发生的风险
Table 7Levels of plasma fatty acids and risk of breast cancer in the premenopausal study population

表8绝经后期试验人群血浆脂肪酸水平与乳腺癌发生的风险
Table 8Levels of plasma fatty acids and risk of breast cancer in the postmenopausal study population

* OR adjusted for age, energy and the conventional risk factors of breast cancer in postmenopausal period.

表9试验人群血浆性激素水平
Table 9Plasma sex hormone levels in the study population

5.血浆性激素水平与乳腺癌发生的相关性
按照月经状态及采血时间将研究时期分成卵泡期、黄体期及绝经后期，此时重新筛选各个时期的乳腺癌的危险因素。性激素的检测结果用中位数及百分位间距表示，用Wilcoxon秩和检验比较三组人群的水平差异，结果发现，乳腺癌患者三个时期内的雌二醇水平、黄体期的孕酮水平和绝经后期的睾酮水平均显著高于健康对照组(P＜0.05)，其余时期的水平比较均无显著差异，结果见表9。进一步分析性激素的不同暴露水平对乳腺癌发病的影响并用年龄及各期内相应的危险因素调整OR值，结果发现与最低分位数相比，三个时期血浆高水平的雌二醇(OR:2.71,4.46，3.62)、黄体期内高水平的孕酮(OR:4.71)以及绝经后期高水平的睾酮(OR:2.16)与乳腺癌的发病呈正相关，结果见表10。

表10血浆性激素水平与乳腺癌发生的风险
Table 10Levels of plasma sex hormone and risk of breast cancer in the study population

讨论
在本次病例-对照研究中，由于乳腺癌的发病年龄主要在围绝经期，而要以年龄为匹配因素进行乳腺癌-乳腺良性疾病-健康对照的配对试验可能会导致部分良性疾病患者以及健康对照者无法纳入研究，在此本课题仅以疾病类型和月经状态作为试验人群的纳入标准，经统计发现绝经前的乳腺癌组平均年龄显著低于乳腺良性疾病组以及健康对照组，而绝经后期三组人群之间的年龄水平无显著性差异。因此，对于绝经前人群我们主要是针对各种营养素的供能比例以及摄入比例进行讨论，而绝经后人群可同时针对摄入量和比例进行讨论。此外，在探讨营养素摄入、体内脂肪酸以及性激素水平与乳腺癌发生的风险时，我们使用年龄、总能量以及各组相应的危险因素作为协变量来调整OR值以尽可能地排除干扰因素对营养素暴露风险的判定，由此我们可以认为本次研究能够较好地判断各组人群之间膳食脂肪酸摄入、体内脂肪酸组成、性激素水平的差异以及相应指标暴露水平与乳腺癌发生的相对风险。
1.乳腺癌常规危险因素探讨
乳腺癌是危害女性健康的主要疾病，其发生率和致死率占恶性肿瘤之首。近年来，包括发展中国家在内的所有国家乳腺癌的发病率都出现显著升高，这表明非遗传因素的改变对乳腺癌发生有重要影响。国内外学者对乳腺癌的病因进行了广泛研究[3,4]，但由于各种危险因素在不同地区的分布及暴露水平存在差异，同时各类研究在调查设计、人群来源/规模、研究方法以及指标检测/评价方法等方面本身也存在较大差异，因此目前关于生活方式、月经生殖因素以及脂肪酸和性激素的暴露水平对乳腺癌影响的结论并不统一。有基于此，本课题首先探讨了重庆地区乳腺癌的主要危险因素及其暴露水平，为进一步的脂肪酸和性激素研究提供理论基础，并为重庆市女性乳腺癌的防治策略提供科学依据。本研究结果提示，乳腺癌发病多为教育程度高、精神压力较大、经常痛经且有乳腺良性疾病史以及恶性肿瘤家族史的妇女，而流产次数多的绝经前妇女和BMI值大、行经年数长及有生殖系统疾病史的绝经后妇女亦为乳腺癌发病的高危人群。此外，人际关系好、月经规则、初潮年龄大以及累积哺乳时间长等因素能在绝经前、后不同程度地预防乳腺癌的发生。

2.脂肪酸水平与乳腺癌发生的相关性研究
我们结合近年来居民膳食结构变迁的实际以及各种脂肪酸对健康的不同影响，采用半定量食物频数表调查并比较了重庆地区健康女性及乳腺癌患者膳食营养素的摄入水平，并进一步分析膳食营养素摄入水平与乳腺癌发生的风险。研究发现，各组间的膳食总能量(绝经前期乳腺癌患者膳食摄入能量降低主要是由于该组年龄偏大所致，实际差异并无显著性)、碳水化合物、蛋白质、总脂肪、胆固醇、SFA及n3 PUFA的摄入水平在绝经前、后均无明显差异。同时，乳腺癌组的膳食纤维及MUFA摄入水平在绝经前显著低于乳腺良性疾病组和健康对照组，而n6 PUFA摄入水平及n6/n3比均显著高于乳腺良性疾病组和健康对照组，乳腺良性疾病组和健康对照组之间无显著性差异；在绝经后期，乳腺癌组及乳腺良性疾病组的膳食纤维及MUFA(C18∶1)摄入水平显著低于健康对照组，而n6 PUFA(C18∶2)摄入水平及n6/n3比均显著高于健康对照组，乳腺癌组和乳腺良性疾病组之间无显著性差异。进一步分析膳食营养素摄入水平与乳腺癌发生的风险，发现绝经前、后期高水平的膳食纤维及摄入对乳腺癌发病具有保护作用，而高水平的n6 PUFA摄入和n6/n3比则是乳腺癌的危险因素。该结果还提示，膳食因素在绝经前、后的乳腺癌发生中均起着重要作用，其中膳食纤维、MUFA及n6 PUFA能显著影响乳腺癌的发生，而该类因素仅在绝经后期与乳腺良性疾病的发生相关。
由于膳食调查过程中，疾病的诊断和治疗可能会对调查对象膳食的回忆产生影响，同时不同个体在摄入同样种类和数量的脂肪酸后，其体内吸收、代谢以及储存的程度也可能存在差异，因此脂肪酸摄入水平的估计并不能等同于脂肪酸的体内组成水平。为了进一步分析脂肪酸水平与乳腺癌发生的相关性，我们用气相色谱法建立了各组人群血浆脂肪酸组成谱的本底数据库，并分析了血浆总的SFA、MUFA、PUFA以及主要游离脂肪酸的不同水平与乳腺癌发病的相关性。研究发现，血浆高水平的n6 PUFA(C18∶2)是绝经前、后乳腺癌发生的危险因素，而MUFA(C18∶1)对乳腺癌的发生则有保护作用。研究同样未发现总SFA以及各种n3 PUFA水平与乳腺癌发生的相关性，但针对SFA的分类研究显示，血浆高水平的C16∶0对绝经前、后的乳腺癌发生具有较显著的保护作用，而血浆高水平的C18∶0可以增加绝经前乳腺癌发生的风险。
脂肪酸膳食摄入以及血浆水平的检测结果一致发现n6 PUFA(主要是C18∶2)可增加乳腺癌发生的风险，而MUFA(主要是C18∶1)水平则与该风险呈负相关。研究认为，n6 PUFA，主要是C18∶2，可促进乳腺癌的发生并通过增加环加氧酶和脂氧合酶的活性从而促进癌细胞的增殖和转移。动物试验表明n6 PUFA摄入增加会上升乳腺癌发生的风险[5]，而人群研究中亦发现膳食及体内高水平的n6 PUFA会上升乳腺癌发生的风险[6]。同时，一些动物实验提示橄榄油中的MUFA相对于其它能量来源而言，可能对乳腺癌的发生具有保护作用，而西欧的病例-对照研究中也观察到乳腺癌患病危险性与MUFA水平呈负相关[7,8]。本研究未观察到n3 PUFA在膳食摄入以及血浆水平上与乳腺癌发生的相关性，这可能与n3 PUFA的含量较少有关，同时考虑到n3 PUFA与n6 PUFA在体内效应的相互作用，研究认为n6/n3比例的改变值得关注[9]，且n6/n3比例较单纯的n3或n6 PUFA水平与乳腺癌的发生有更好的相关性。结合上述结果，本研究认为，合理的n6/n3比例以及SFA∶MUFA∶PUFA比例可能是影响乳腺癌发生的主要因素。居民应当在合理控制总脂肪、总SFA的前提下，适当降低n6 PUFA的摄入而增加n3 PUFA及MUFA的摄入。国际脂类学会推荐的膳食n6/n3比为4～6∶1。重庆地区居民膳食中n3系列脂肪酸的来源比较少，这提示居民在日常膳食中应适量增加深海鱼类以及富含α亚麻酸的食物(包括紫苏油)的摄入。同时，针对美国心脏协会推荐的膳食脂肪中SFA∶MUFA∶PUFA比例为1∶1∶1而2000年日本的脂质比例推荐量为3∶4∶3，张坚等[10]在调查我国居民膳食脂类摄入量时认为我国居民的摄入比为1∶1.5∶1更为合理。因此，居民应控制动物性油脂和植物油的摄入，同时增加调和油以及橄榄油的使用以预防乳腺癌的发生。
3.性激素水平与乳腺癌发生的相关性研究
乳腺组织是性激素的主要靶器官，大量研究显示性激素水平在乳腺癌的发生、发展中起着重要作用，同时月经、生殖因素如初潮年龄、首次妊娠年龄、行经年数等也主要是通过影响女性雌、孕激素的暴露水平来影响乳腺癌的发生。然而，目前关于性激素水平与乳腺癌发生的相关性研究结果并不统一，这可能与不同研究间的研究人群、样本数目、研究方案以及实验室检测方法的差异有关。由于绝经前妇女体内的性激素水平受下丘脑-垂体-性腺轴的周期性调节，因此雌、孕激素的水平在卵泡期及黄体期内的差异较大。为了尽可能多地纳入研究样本，本试验根据绝经前妇女的具体情况就近抽取了卵泡中期(月经周期第7±1d；或是从月经第一天起，在＜平均月经周期天数－14＞/2天后取血)或黄体中期(月经周期第21±1d；或是从月经第一天起，下次月经第一天的日期往回推7天取血)的血样，并在该部分的探讨时排除了月经紊乱者、近6个月内哺乳或妊娠者以及近6个月内服用过雌激素或进行激素替代治疗者以避免混杂因素对检测结果的判断。按照月经状态及采血时间将研究时期分成卵泡期、黄体期及绝经后期，此时重新筛选各个时期的乳腺癌的危险因素(结果略)。比较三组人群的血浆性激素水平的差异，结果发现乳腺癌患者三个时期内的雌二醇水平、黄体期的孕酮水平和绝经后期的睾酮水平均显著高于健康对照组，其余时期的水平比较均无显著差异；而乳腺良性疾病组仅在黄体期和绝经后期内雌二醇水平显著高于对照组，其余各期内的激素水平均无差异。进一步分析性激素的不同暴露水平对乳腺癌发病的影响并用年龄及各期内相应的危险因素调整OR值，结果发现三个时期血浆高水平的雌二醇、黄体期内高水平的孕酮以及绝经后期高水平的睾酮均能增加乳腺癌发生的风险。以上结果提示，雌二醇水平升高与乳腺癌发生呈显著的正相关，同时黄体期内孕酮水平的升高以及绝经后期睾酮水平的升高亦能增加乳腺癌发生的风险。对于乳腺良性疾病，本研究发现黄体期以及绝经后期雌二醇水平上升可导致该类疾病风险增加，并未发现孕酮和睾酮水平与其发生的相关性。

Hulka B认为膳食脂肪影响乳腺癌发生的机制可能是通过改变机体的体脂分布进而影响循环雌激素水平来完成[11]。高脂膳食的摄入会导致总能量摄入的增加和体重增长，而对于绝经后妇女其体内的雌激素水平主要来自于脂肪组织的合成。研究发现，乳腺组织中脂肪含量与雌激素合成的关键酶-芳香化酶的活性呈正相关，而脂肪细胞本身也可以分泌胰岛素样生长因子和瘦素等激素从而促进乳腺细胞的增殖并上调芳香化酶的活性[12]。此外，人群干预试验也发现低脂、高膳食纤维膳食能够显著降低循环雌激素水平，并推测这可能与膳食纤维摄入较多而导致粪便中雌激素排泄增加有关[13]。本研究未观察到各组人群间膳食总脂肪以及总SFA的摄入水平的差异，但是乳腺癌组膳食纤维的摄入水平显著低于健康对照组，这可能与该组人群的雌激素水平升高有一定的关系。我们将在后续性试验中进一步分析脂肪酸的摄入及体内组成水平与体内性激素水平的相关性，同时研究不同脂肪酸摄入对雌激素合成、代谢的影响以探讨脂肪酸影响雌激素水平的相关分子机制。

第二部分动物实验
在动物实验方面，已成功复制出MNU诱导的SD大鼠乳腺癌模型。通过严格的对喂控制，持续喂养18周并相应记录大鼠的体重、摄食量及肿瘤发生情况。分别在实验的第8和18周处理大鼠，留取乳腺(癌)组织，－80℃保存备用。实验数据用x-±s表示，已采用SPSS10.0建立数据库并完成对大鼠体重、摄食量、肿瘤发生率、肿瘤多发率及乳腺组织脂肪酸构成等指标的统计分析。
2.1 动物饲料
实验动物采用人工合成饲料喂养。SFA主要由猪油提供；MUFA主要由橄榄油提供；n6 PUFA主要以葵花籽油提供；n3 PUFA主要以鱼油提供。根据实验设计，使总脂肪达到进食量的15％(wt/wt)，基础饲料按GB14924.3-2001进行修改，配制成85％的无脂饲料。各饲料组均含有0.5％以上的亚油酸以满足大鼠对必需脂肪酸的需要。同时各组饲料除脂肪酸构成不同外，其它营养素含量和组成相同(蛋白质、碳水化合物和粗纤维含量分别为18.7％、46.2％和5％)，且能量供给保持一致(4.12Kcal/g)。饲料每月配制1次，真空包装后置于-20℃下避光保存。实验前采用气相色谱法分析猪油、橄榄油、葵花籽油和鱼油的脂肪酸含量，并按比例调配。同时根据不同油脂中维生素E含量，将各组维生素E添加至同一浓度（300mg/100g）。饲料每月配制一次，真空包装后置于-20℃避光保存，每次喂养前将饲料放至室温后再喂饲动物。各组饲料脂肪酸构成见表2.1。

表2.1动物饲料的脂肪酸构成（％，wt/wt）
Table2.1Percentage of fatty acids in diets(% total fatty acids, wt/wt)

2.2 动物分组和模型复制
45d龄的清洁级SD雌性大鼠186只，购于第三军医大学野战外科研究所实验动物中心，置于标准动物房普通饲料适应性喂养5d后，剔除体重过高和过低的大鼠各8只后，随机分为SFA组、MUFA组、n6 PUFA组、n3 PUFA组、n6/n3的1∶1、5∶1、10∶1组，以及1∶2∶1(SFA∶MUFA∶PUFA为1∶2∶1，且n6∶n3为1∶1)组，共计8组。同时每组又分为实验组(MNU组，13～14只)和对照组(生理盐水组/对喂组，8只)。

参照Lu S等人(2002)方法，选用50天鼠龄的SD雌性大鼠，采用化学致癌剂甲基亚硝基脲(methylnitrosourea, MNU)50mg/kg体重的剂量单次腹腔注射给药诱导大鼠乳腺癌发生，对照组注射等体积的无菌生理盐水。给药后即喂以不同脂肪酸组的饲料，持续喂养18周。分别在实验的8和18周处理大鼠，留取并分装乳腺(癌)组织。

2.3 观察指标
2.3.1 大鼠进食量和体重
大鼠在标准动物房中饲养，自由饮水。每2天记录一次大鼠进食量。根据前2天各组大鼠的摄食情况，以摄食量少者为标准，给予同样重量的饲料以保证每组能量摄入相当。每周称取一次体重。
2.3.2 大鼠肿瘤发生情况
每周检查一次大鼠乳腺肿瘤发生情况，包括肿瘤发生时间、数目以及部位以便在实验末期统计大鼠乳腺肿瘤发生潜伏期、多发率以及发生率。实验过程中，如果大鼠的乳腺肿瘤直径超过1cm，也直接进行处理并留取相应标本。
实验数据用x-±s表示，采用SPSS10.0软件建立数据库，对大鼠体重、摄食量进行重复测量资料的方差分析，肿瘤潜伏期和多发率进行方差分析，肿瘤发生率进行χ2检验。
2.3.3气相色谱内标法分析各组大鼠乳腺组织脂肪酸构成
取各组三只大鼠乳腺组织40mg，入匀浆器用2∶1(v/v)氯仿/甲醇和0.05mol/L NaCl碾磨提取脂质后，在N2下加入内标C17∶0和14％ BF3MeOH(含1g/L BHT)，66℃水浴2h进行甲酯化，再用正己烷和饱和NaCl提取甲酯化的脂肪酸，N2吹干后加入100μl正己烷重溶。取1μl采用程序升温条件进行检测，即50℃保持1min，以25℃/min升至175℃，再以4℃/min升至230℃，保持5min。进样口温度250℃，检测器温度260℃，分流比50∶1，分析35min。每个样品重复测定三次。然后根据各组脂肪酸和内标色谱峰峰面积的比值，用不同脂肪酸甲酯化单标的标准曲线线性回归方程计算各组乳腺组织脂肪酸的含量。
2.4 实验结果
2.4.1膳食脂肪酸对大鼠摄食量以及体重的影响
自其实验6周起，n3 PUFA组大鼠出现食欲抑制和体重增长受阻的情况。为保障其余组大鼠的正常生长以及摄食量的对喂控制，在其余组间选取摄食量少者为喂饲标准。统计学分析显示，自其实验6周起，n3 PUFA组大鼠摄食量及体重增长显著低于其余各组(P＜0.01)，而其余各组的摄食量和体重均无明显差异(P＞0.05)。实验期间，不同构成比脂肪酸对大鼠体重增长的影响见图2.1。
图2.1不同膳食脂肪酸及构成对SD雌性大鼠体重增长的影响
Fig 2.1Effects of different dietary fatty acids and ratios of n6/n3 PUFA
on the body weight of SD female rats

**: P＜0.01 compared with other groups

2.4.2 膳食脂肪酸对大鼠乳腺肿瘤发生的影响
实验末期，不同脂肪酸喂养的各对喂组大鼠均无乳腺肿瘤发生。在各MNU处理组中，除n3 PUFA组无乳腺肿瘤发生，其余组均有乳腺肿瘤发生，其中SFA组、MUFA组、10∶1 n6/n3组和S/M/P组的乳腺肿瘤诱发率都为92.31％（12/13），n6 PUFA组和5∶1 n6/n3组乳腺肿瘤诱发率分别为83.33％和84.62％（10/12，11/13），均约是1∶1 n6/n3组乳腺肿瘤诱发率42.86%（6/14）的2倍（χ2=17.869，P＜0.01）。此外，1∶1 n6/n3组大鼠的肿瘤多发率为0.79±1.25，显著低于其余各组(P＜0.01)，而其余各组间无显著性差异(P＞0.05)。此外，1∶1 n6/n3组MNU给药至出现首发肿瘤的时间即潜伏期也最长。提示，1∶1 n6/n3能有效抑制MNU诱导的乳腺肿瘤发生。见图2.2，表2.2。

图2.2不同膳食脂肪酸及构成对MNU诱导SD雌性大鼠乳腺肿瘤发生的影响
Fig 2.2Effects of different dietary fatty acids and ratios of n6/n3 PUFA on MNUinduced mammary tumor incidence in SD female rats

表2.2不同膳食脂肪酸及构成对MNU诱导SD雌性大鼠
乳腺肿瘤发生情况的影响
Table 2.2Effects of different dietary fatty acids and ratios of n6/n3 PUFA on the
occurrence of MNUinduced mammary tumors in SD female rats

2.4.3 各组大鼠乳腺组织形态学观察
2.4.3.1组织病理学观察(HE染色)
处理各组大鼠并分离乳腺(肿瘤)组织，经10％福尔马林溶液固定24h后，石蜡包埋切片，常规HE染色，并在光镜下观察各组大鼠乳腺(肿瘤)组织的组织形态行。实验发现，未发生肿瘤的各对喂组以及n3 PUFA实验组大鼠乳腺组织呈细米粒样大小外观，光镜下可见乳腺组织结构与同鼠龄正常大鼠相同，即腺管在乳腺组织内散在分布，结构清楚，导管上皮细胞呈单层有序排列，腺腔宽大而清晰(图2.3A)。MNU诱导的乳腺肿瘤组织表面凸凹不平，内面可呈脂肪样变性。经HE染色确定各组诱发的乳腺肿瘤均为乳腺导管癌，其病理变化为乳腺腺腔的导管上皮细胞呈恶性增生，出现排列紊乱、层次不清等现象，腺腔变狭窄甚至消失(图2.3B)。

2.4.3.1组织超微结构的改变(透射电镜)
相同倍数下，对喂组乳腺组织可见完整的单个乳腺导管上皮细胞轮廓，细胞间连接紧密，细胞间质增多，表面有丰富的微绒毛，见图2.4A。而MNU诱导的乳腺肿瘤细胞轮廓不清，细胞核大、深染，呈不规则形，有明显的核分裂相，核浆比例增大，胞浆内有大量的分泌颗粒、粗面内质网及标志腺癌的微腺腔存在，细胞膜上的突起少，少见或无细胞间连接，见图2.4B。

2.4.4 不同膳食脂肪酸对大鼠乳腺组织脂肪酸组成的影响
不同膳食脂肪酸及构成能导致大鼠乳腺组织脂肪酸组成发生明显变化，其变化趋势与膳食脂肪构成基本一致，且不同喂养组间的脂肪酸含量有显著差异(P＜0.05)。虽总的SFA含量在各喂养组间无显著变化趋势，但SFA喂养组大鼠乳腺组织储有大量的MUFA和n6 PUFA；MUFA喂养组乳腺组织C18∶1含量明显高于其余组；n6 PUFA喂养组乳腺组织C18∶2和C20∶4的含量也显著高于其余组，且这三组n3 PUFA含量极低；而在n3 PUFA喂养组乳腺组织EPA、DHA含量最多，C20∶4含量最少；在n6/n3不同构成比中，其显著特征为1∶1 n6/n3喂养组乳腺组织DHA含量依次明显高于5∶1和10∶1 n6/n3喂养组，C20∶4含量则依次低于5∶1和10∶1 n6/n3喂养组；而S/M/P组乳腺组织含有较多的MUFA和n6 PUFA，n3 PUFA含量明显少于n3 PUFA和1∶1 n6/n3喂养组。此外，发现对喂和MNU诱癌组间大鼠乳腺组织脂肪酸组成变化具有相同趋势。见图2.5。