达能营养中心第十届学术研讨会论文集

(深圳市慢性病防治院，深圳，518020)

摘要：目的探讨胃促生长素(Ghrelin)在高脂饮食诱导大鼠肥胖中的作用。方法采用40只健康雄性SD大鼠，按体重随机分为高脂实验组和基础对照组，分别给予高脂饲料(30只)和基础饲料(10只)喂养12周。实验结束时，将高脂组大鼠根据体重分为饮食诱导肥胖（DIO）和饮食诱导肥胖抵抗(DIR)大鼠，观察各组大鼠能量摄入、体重增长情况，比较血浆ghrelin、血糖、胰岛素及血脂水平的差异；逆转录聚合酶链反应(RTPCR)测定胃壁组织ghrelin前体信使核糖核酸(mRNA)的表达水平。结果DIO大鼠能量摄入、体重增长显著高于DIR和对照组大鼠（P＜0.05），而DIR大鼠与对照组相比差异无显著性（P＞0.05）；DIO大鼠血浆ghrelin和胃壁preproghrelin mRNA的表达水平均低于DIR大鼠和基础对照组（P＜0.01）。结论高脂饮食下ghrelin表达和释放减少与能量摄入过多和肥胖的发生密切相关。
关键词：高脂饮食；肥胖；胃促生长素

Ghrelin and highfat diet induced obesity in rats

Liu Xiaoli
(Chronic Disease Hospital of Shenzhen)

 Abstract: Objective To explore the effects of expression and secretion of ghrelin on highfat diet induced obesity in rats.  Methods Forty male SD rats were randomly divided into highfat diet group (n=30) and chow fed control group (n=10), and given either highfat diet or chow for twelve weeks. Then the highfat diet group was subdivided into Dietary Induced Obesity (DIO) and Dietary Induced Obesity Resistant (DIR) group according to the final body weight. Fasting plasma ghrelin were determined by RIA. Reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR) was used to measure the expression of preproghrelin mRNA in gastric tissue.  Results Cumulative caloric intake, body weight in DIO group were significantly higher than those in DIR and control group. Both fasting plasma ghrelin concentration and the preghrelin expression in gastric tissue were significantly lower in DIO group than in DIR and control group.  Conclusion Lower expression and secretion of ghrelin were closely associated with highfat diet induced obesity and their higher caloric intake.

Keywords highfat diet；obesity；ghrelin

Ghrelin是由28个氨基酸组成的肽类激素，主要由胃和十二指肠分泌，为内源性生长激素促分泌素受体的天然配体，故称作胃促生长素[1-2]。研究发现，外周或中枢注射ghrelin均可引起动物摄食增加和利用脂肪产热减少，出现以脂肪组织蓄积为主的体重增加和肥胖，提示ghrelin对调节能量平衡起重要作用[3-4]。人和动物血液循环中均有一定浓度的ghrelin,进餐前，血液中ghrelin水平最高，进食后，ghrelin迅速下降至较低的水平，由此推测ghrelin可能与饥饿感的产生及进食行为的启动密切相关。
高脂饮食喂养的同种系大鼠,部分表现为多食和肥胖，称为饮食诱导肥胖(Dietary Induced Obesity, DIO)大鼠,部分则相应减少摄食量而不肥胖，称为饮食诱导肥胖抵抗(Dietary Induced Obesity Resistant, DIR)大鼠。本研究探讨高脂饮食喂养条件下内源性ghrelin表达和分泌水平与其肥胖易感性差异性的关系。
1 材料和方法
1.1 实验动物
雄性SD大鼠40只，体重155-165g，购于上海西普尔—必凯实验动物有限公司（准SCXK(沪)2003-0002）。
1.2 饲料配方
基础饲料购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，总能量3.3kcal/g（蛋白质21.88%、脂肪13.68%、碳水化合物64.44%）；自行配制的高脂饲料，每100g含基础饲料60g、猪油15g、鸡蛋黄粉10g、脱脂奶粉8g、干酪素5g、白沙糖2g，高脂饲料总能量4.6kcal/g（蛋白质20.00%、脂肪49.85%、碳水化合物30.15%）。

1.3 实验动物的饲养与分组
购入大鼠适应性饲养一周后，按体重随机分为两组：基础对照组（10只），喂以基础饲料；高脂实验组（30只），喂以高脂饲料。各组大鼠均单笼饲养，自由进食、摄水，动物房温度（22±5）℃，相对湿度（50±10）%，明暗周期12∶12h。每周定时称体重。第12周末，将高脂实验组大鼠按体重排序，以体重较大的1/3（10只）为DIO大鼠，体重较小的1/3（10只）为DIR大鼠，体重居中的1/3弃之不用。
1.4 资料及样品收集
实验期间每日观察大鼠一般情况，记录给食量和撒食量，计算摄食量，每周称体重，于实验开始和结束时隔夜禁食12h，次晨取尾血，加入预冷的含乙二胺四乙酸二钠（EDTA二钠，7.5%,每3毫升全血40μl)抗凝管中，加抑肽酶（每毫升全血500U），混匀，4℃离心15min（3000rpm）分离血浆，‐80℃保存待测。实验结束时将大鼠断头处死,取胃体部胃壁组织,用0.9%生理盐水冲洗后液氮速冻,‐80℃保存待测。
1.5 血浆ghrelin及其它生化指标的测定
采用液相竞争放射免疫检测法测定血浆ghrelin和胰岛素水平，葡萄糖氧化酶法测血糖,酶比色法测定甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)水平,ghrelin和胰岛素放免试剂盒分别购自美国Phoenix公司和北京科美东雅生物技术有限公司，血糖、TG、TC、HDLC检测试剂盒购自北京中生生物工程科技公司，均按公司提供的说明书进行测定。
1.6 胃组织preproghrelin mRNA的测定
按Trizol说明书从50mg胃组织中提取总RNA。在25μl逆转录反应体系中，以1.0μg mRNA为模板将mRNA逆转录为cDNA。PCR反应以βactin作为内参照，βactin上游引物为5cat cac tat cgg caa tga gc3，下游引物为5 gac agc act gtg ttg gca ta 3（156bp）；preghrelin上游引物为5-GGA ATC CAA GAA GCC ACC AGC-3，下游引物为5-GCT CCT GAC AGC TTG ATG CCA-3(247bp)。PCR反应首先在95℃预变性5min，72℃延伸7min；95℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；最后一次循环在72℃延伸5min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳并与DNA标准分子量比较鉴定，用Biometra成像系统进行成像和图像分析。preghrelin mRNA表达水平用目的基因条带光密度值与β actin条带光密度值之比表示。
1.7 统计学处理
全部数据录入Microsoft Excel 2000,用SPSS 12.0统计软件进行统计分析，相关数据以x_±s表示，多个样本均数间比较用方差分析。
2 结果
2.1 实验各组大鼠体重变化趋势分析
由图1可知，随着喂养时间的推移，DIR大鼠与DIO大鼠的体重差别逐渐增大。从第3周开始，DIR大鼠与DIO大鼠的体重已经具有显著性差异（P＜0.05），但是DIOR大鼠与对照组大鼠体重始终未见显著性差异（P＞0.05）。

图 1各组大鼠体重变化趋势

Fig. 1The body weight of rats in each group

2.2 各组大鼠能量摄入量的比较
各组大鼠的累计摄食量和能量摄入量见表1。

表1各组大鼠进食量和能量摄入量的比较
Table 1Cumulative food intake and caloric intake of different groups

同样摄入高脂饲料的情况下，DIO组的累计摄食量显著高于DIR组。因基础饲料和高脂饲料的能量密度不同，将食物摄入量换算成能量摄入量进行比较，结果DIO大鼠累计能量摄入量显著高于对照组和DIR组，差异有极显著性（P＜0.01），而DIR和对照组相比，累计能量摄入差异无统计学意义（P＞0.05）。提示高脂饮食喂养条件下，肥胖易感大鼠摄入能量较多，而肥胖抵抗大鼠可自发性减少进食量，使能量摄入不致过多。

2.3 各组大鼠实验前后血浆ghrelin及其它生化指标的比较

如表2，实验开始时各组大鼠血浆ghrelin水平无显著性差异，喂养12周后，DIO组大鼠血浆ghrelin水平均显著低于DIR大鼠和基础饲料喂养组，而DIR组与基础对照组差异无显著性意义。此外，DIO组空腹血糖、胰岛素、TG水平均显著高于对照组。

2.4 各组大鼠胃组织preproghrelin mRNA表达的比较
实验结束时各组大鼠胃组织preproghrelin mRNA表达的结果见图2和表3，DIO组显著低于DIR和对照(P＜0.05），而DIR和对照组之间未见显著性差别（p＞0.05）。

表2各组大鼠实验前后空腹血浆ghrelin、胰岛素、血糖、血脂谱水平（x-±s）

图2大鼠胃组织preproghrelin mRNA表达电泳图

Fig 2gastric tissue preproghrelin mRNA

表3.各组大鼠胃组织preproghrelin mRNA定量结果
Table 3.gastric tissue preproghrelin mRNA level

3 讨论
本研究中，同样用高脂饲料喂养的SD大鼠，自由摄食情况下，部分表现为能量摄入增加和肥胖（DIO），另一部分则可通过摄食量的减少，使能量摄入水平及体重增长与基础饲料喂养组无显著性差异（称之为DIR），再次证实能量过剩是肥胖的根本原因。
导致DIO和 DIR大鼠自发性能量摄入量差异的原因很多，食欲调节激素对饱腹感和饥饿感的调节在其中起着非常重要的作用。Ghrelin是迄今所发现的唯一的一个具有增进食欲生理活性的胃肠道激素，动物和人体试验都已证明：注射外源性ghrelin可引起饥饿感，使摄食明显增加[5]。其作用机制与促进下丘脑弓状核神经肽Y（NPY）神经元活性及NPY表达和释放有关[6]，也可能由下丘脑侧区的增食欲素（orexin）通路介导[7]，且外周注射ghrelin产生的促食欲作用有赖于传入迷走神经的完整性[8]。而内源性ghrelin表达和分泌水平与高脂饮食诱导的肥胖动物摄食过多和能量过剩的关系目前尚未见相关报道。本研究结果显示：DIO大鼠空腹血浆ghrelin水平显著低于DIR组及基础饲料对照组。与此一致，人类肥胖者也表现为空腹ghrelin水平下降[9]，这是否与肥胖者中枢神经系统对ghrelin的敏感性发生改变有关还有待研究。Beck B等认为：食物中不同的宏量营养素对胃肠道ghrelin的释放有不同的影响，长期摄入高脂饮食可抑制ghrelin的释放，而血浆ghrelin水平低与食物选择上偏爱高脂肪有关[10]。本研究表明长期高脂饮食条件下，DIO组ghrelin表达和分泌明显下降，而DIR组ghrelin表达和分泌与对照组无显著性差异，这可能与DIO大鼠喜食高脂饲料，高脂饲料喂养时能量摄入过多有关，而同样饲以高脂饲料的DIR大鼠，ghrelin分泌下降不明显，可能与其对高脂饲料无明显偏爱，可根据能量摄入水平自发性减少摄食量有关。此外，进食后ghrelin分泌下降可能对饱腹感的产生有关，Lindqvist等认为高脂饲料喂养致空腹时低水平ghrelin表达和分泌还影响进食对ghrelin表达和分泌的抑制作用[11]，使进食后血浆ghrelin浓度下降不明显，不能及时产生饱腹感而至摄入过多。DIO和DIR大鼠摄入不同饲料后ghrelin表达和分泌谱的变化是否也存在差异有待进一步研究。