学术报告厅

摘要 目的探讨老年男性肠脂肪酸结合蛋白（intestinal fatty acid binding protein, IFABP）基因exonⅡ54位点编码丙氨酸或苏氨酸（A/T）单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNP）与血清血脂水平的关系。方法研究对象为114例老年男性，平均年龄71.3±7.2岁；对照组102例年轻男性，平均年龄38.2±3.1岁。利用聚合酶链反应（PCR），HhaI内切酶酶切，基因测序等技术检测各组IFABP基因型；血清总胆固醇(TC)、三酯酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)、载脂蛋白AⅠ(Apo AⅠ)、载脂蛋白B(Apo B)等指标的检测采用生物化学方法。结果老年男性组IFABP基因型A/A、A/T、T/T频率为0.29，0.53，0.18；对照组IFABP基因型A/A、A/T、T/T频率为0.52，0.35，0.13。突变型54T等位基因频率分别为：老年男性组0.45，对照组0.30。与对照组比较，老年男性组54T等位基因频率明显增高，差异显著（x2=9.41,p＜0.01；）。在老年男性组，与54A等位基因携带者比较，54T等位基因携带者血清三酯酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白B明显升高（分别为1.83±0.67 vs 1.48±0.67mmol/L, p＜0.05;2.39±0.42 vs 2.21±0.41mmol/L, p＜0.05;0.69±0.17 vs 0.61±0.19g/L, p＜0.05）。结论突变型54T等位基因频率在老年男性人群中明显升高，并且与老年男性较高水平的血清三酯酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白B有关。

Abstract：Objective To investigate the association of frequency at codon 54Ala/Thr (A/T) single nucleotide polymorphism (SNP) in the intestinal faty acid binding protein (IFABP) with serum lipids in aged men. Methods Subjects were 114 elderly men aged 71.3±7.2 years. Controls were 102 younger men aged 38.2±3.1years. The Ala 54Thr allelic variant was detected by polymerase chain reaction, HhaI digestion, and sequencing. TC, TG, HDL-c, LDL-c, ApoAⅠ and ApoB in fasting serum were detected by biochemical technique. Results The genotype frequencyies of A/A, A/T, T/T were 0.29, 0.53, 0.18 in elderly men, 0.52, 0.35, 0.13 in controls. The allelic frequency of point mutant 54Thr in IFABP gene were 0.45 in elderly men，0.30 in controls, respectively. Compared with controls, the allelic frequency of 54T in elderly men was markedly difference（x2=9.41, p＜0.01）. The TG, LDL-c and ApoB concentraton in fasting serum in elderly men with 54T allele were significantly higher than these with 54A allele(1.83±0.67 vs 1.48±0.67mmol/L, p＜0.05; 2.39±0.42 vs 2.21±0.41mmol/L, p＜0.05; 0.69±0.17 vs 0.61±0.19g/L, p＜0.05). Conclusions In elderly men, the frequency of mutant allele 54T was significantly elevented, which was associated with high TG, LDL-c and ApoB concentraton in fasting serum.

IFABP基因位于人类染色体4q28-q31。研究证实，IFABP与外源性长链脂肪酸（long chain fatty acid, LCFA）的吸收、转运及脂类合成、分解代谢有关[1,2]。继其空间结构和部分生理功能得到证实后，最近，有研究报道突变型54T IFABP与肥胖、高血脂、高血糖等“代谢综合征”的发生发展有关[3]。老年人是这种综合征的高危人群。本文通过对不同年龄组男性人群54A/T IFABP基因多态性调查，分析老年男性突变型54T等位基因频率分布及其与血清血脂水平的关系。

1 材料与方法
1.1 研究对象
114例老年人，男性，年龄60-87岁，平均71.3±7.2岁，来自某部队干休所体检；对照组102例，男性，年龄18-45岁，平均年龄38.2±3.1岁，来自某部队体检。研究对象无肾功能损害，无重度吸烟史（＞10支/日），相互间无血缘关系。
1.2 试剂与仪器
限制性内切酶HhaⅠ，Taq DNA聚合酶购自TaKara公司；蛋白酶K购自Sigma公司；UNIQ-5柱离心式DNA胶回收试剂盒，PCR反应回收试剂盒购自上海生物工程有限公司。UNOⅡ型PCR仪（Biometra，德国），UV-1601型紫外分光光度计，75S/00771型凝胶成像分析系统（Bio Rad，美国）。
1.3 方法
1.3.1 PCR引物的设计根据genebank提供的人IFABP基因序列，按引物设计原则，将上游引物设计在距离突变位点200bp，下游引物设计在距离突变位点100bp，扩增产物长度为300bp，即，上游引物序列：5-ACAGGTGTTAATATAGTGAAAAGG-3,下游引物序列：5-ATTGGCTTCTTCAGTTAGTGAAGG-3。GAPDH内参对照：扩增片段长450bp，上游引物序列：5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3；下游引物序列：5-TCACCACCCTGTTGCTGTA-3。
1.3.2 外周血分离白细胞及DNA提取空腹静脉血1ml，3.8%枸橼酸钠抗凝。采用低渗溶血法分离白细胞；酚/氯仿抽提法提取DNA。
1.3.3 目的基因IFABP扩增条件95℃预变性3分钟；94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30个循环；72℃补平8分钟，反应体系为50μl。GAPDH内参扩增条件：95℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30个循环；72℃补平8分钟，反应体系为25μl。
1.3.4 IFABP基因PCR扩增产物经PCR产物回收试剂盒回收后，用限制性内切酶HhaⅠ，37℃酶切过夜。结果行3%琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像分析系统摄像，并记录分析结果。根据酶切结果，针对性地选择部分完全切割、不完全切割和未切割的PCR产物，经1%琼脂糖凝胶电泳纯化回收，待DNA序列分析比较，测序分析由上海博亚生物技术有限公司完成。
1.3.5 血清血脂测定空腹静脉血5ml，采用Olympus AU 6400全自动生化仪测定血清总胆固醇(TC)、三酯酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)、载脂蛋白AⅠ(ApoAⅠ)、载脂蛋白B(ApoB)
1.4 统计学处理
等位基因频率采用基因计数法。计量资料用x±s表示，采用SPSS1.0软件作x2检验和t检验。

2 结果
2.1 言目的基因片段及内参基因片段的PCR扩增产物
以外周血白细胞DNA为模板，进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳观察，在约300bp处扩增出一条与预期值相符合的特异性IFABP基因片段，GAPDH内参扩增结果为450bp。

图1IFABP基因目的片段PCR扩增结果
1、2、3、4、5、6、7为300bp目的基因扩增片段；
8为GAPDH内参，片段长450bp；9为2000bp Maker

2.2 限制性内切酶HhaⅠ酶切结果
PCR产物经回收试剂盒回收后，用限制性内切酶HhaⅠ，37℃过夜酶切。HhaⅠ内切酶碱基识别序列为GCGC。当IFABP基因54位点GCT（Ala）→ACT（Thr）时，其所在碱基序列片段将由GCGCT→GCACT，HhaⅠ内切酶不能酶切。酶切结果电泳分析显示三种情况：①突变纯合子型54T/T，显示一条带，分子量约为300bp；②野生型54A/A，显示二条带，分子量约为200bp和100bp；③突变杂合子型54A/T，显示三条带，分子量分别约为300bp，200bp和100bp。

图2HhaⅠ酶切结果
7、9为IFABP54A/T杂合子基因型酶切结果（三条带
分别为300bp,200bp,100bp）；1、4为IFABP54A/A
野生基因型酶切结果（二条带分别为200bp,100bp）；
2、3、5、6、8为IFABP54T/T突变纯合子基因型酶切
结果（一条带为300bp）；10为GAPDH内参，片段长
450bp；11为2000bp Maker
2.3 目的基因片段序列分析
为了进一步验证内切酶HhaⅠ酶切结果，针对性地选择部分完全切割、不完全切割和未切割的PCR产物，经1%琼脂糖凝胶电泳纯化回收，进行DNA双向序列分析比较，结果与酶切结果吻合。
2.4 各组IFABP基因exonⅡ 54位密码子点突变频率
不同年龄组IFABP基因exonⅡ54位点突变情况见表1。老年男性组(n=114)，野生型A/A为33例，占0.29，突变杂合子型A/T60例，占0.53，突变纯合子型T/T21例，占0.18；54T等位基因频率0.45，54A等位基因频率0.55。对照组(n=102)，野生型A/A为53例，占0.52，突变杂合子型A/T36例，占0.35，突变纯合子型T/T13例，占0.13；54T等位基因频率0.30，54A等位基因频率0.70。两样本率统计分析，与对照组比较，老年男性组突变型54T等位基因频率分布明显增高，且差异显著（x2=9.41,p＜0.01）。

图3野生型54A/A（GCT/GCT）IFABP基因片段测序图谱（正向），“→”所示为54位点（GCT）

2.5 老年男性组54A/T等位基因型与血清血脂水平
的关系54T等位基因携带者空腹血清TG、LDL-c和ApoB水平明显高于54A等位基因携带者，分别为1.83±0.67vs 1.48±0.67mmol/L，2.39±0.42 vs 2.21±0.41mmol/L；0.69±0.17 vs 0.61±0.19g/L，差异显著（p＜0.05）；而血清TC，HDL-c，ApoAⅠ水平，两组间虽有差异，但无统计学意义。见表2。

3 讨论
IFABP是一种20世纪70年代发现的胞内可溶性脂肪酸载体蛋白，属于FABPs蛋白超家族，分子量约为15kDa，由131个氨基酸组成，分布于营养物质吸收的主要场所——小肠，具有组织特异性。食物来源的脂类经肠道胆汁酸盐和胰酶乳化分解后，中、短链脂肪酸以扩散方式被肠道吸收细胞摄取，而长连脂肪酸（C16－C20）需经膜受体脂肪酸转位酶FAT/CD36转运入胞内，与IFABP结合后，被靶向运输至胞内线粒体、内质网等场所，参与体内脂类合成、分解代谢。膜受体脂肪酸转位酶FAT/CD36的密度、分布与IFABP基因表达密切相关。
IFABP基因表达受食物中长链脂肪酸的正向调节。在肠道，从十二指肠到结肠，从绒毛顶端到肠隐窝，随着肠上皮细胞摄取LCFA能力的降低，IFABP基因表达呈明显递减的阶梯状分布。在研究IFABP基因表达调控机制中，Mochizuki等[4]发现，小肠细胞核荷尔蒙受体PPARα通过与视黄醇酸受体α（RXRα）形成PPARα-RXRα异源二聚体，作用于IFABP基因启动子PP反应元件（PPRE），LCFA能促进PPARα-RXRα与PPRE结合，继而激活IFABP基因表达，当食物中脂肪酸含量增加时，肠道上皮细胞IFABP基因表达明显上升。
IFABP基因第Ⅱ外显子54位点具有单核苷酸多态性（SNP），可编码丙氨酸（A）或苏氨酸（T）。体外实验证实，突变型54T IFABP与配基长链脂肪酸的亲和力是野生型54A IFABP的2倍。从结构上，尽管54T与配基结合无明显的直接关系，但是苏氨酸（T）替代丙氨酸（A），使侧链分子量增大，影响了配基进出“入口”区域，从而降低了IFABP运输配基的转移率[5]。细胞学实验证实，转染了54T/T IFABP基因的Caco-2细胞，转运长连脂肪酸的能力和分泌甘油三酯(TG)的浓度均较转染54A/A IFABP基因的Caco-2细胞增高5至6倍，推测突变型IFABP分子结构的微小改变，可能影响了脂类的摄取及正常代谢[6]。
本实验结果显示，对照组年轻男性的54T等位基因频率为0.30，此与韩国[7]、日本[8]年轻男性54T频率分布相近。提示IFABP基因T54A多态性分布可能无民族、地域分布差异。而老年男性组，54T等位基因频率高达0.45，两者存在非常显著差异（p＜0.01）。因此，推测突变型54T IFABP基因频率分布与年龄相关，在高年龄组频率分布增高。
最近，国外临床研究发现，同野生型54A相比较，突变型54T携带者餐后、空腹血清总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)，载脂蛋白E(ApoE)，极低密度脂蛋白(VLDL)浓度及胰岛素水平均明显升高，并且持续时间延长[8，9]。早在1992年，Patsch等[10]发现，高脂血与冠心病发生发展有明显的正相关性。本实验结果显示，老年男性组，54T基因携带者空腹血清TG、LDL-c和ApoB均高于54A基因携带者（p＜0.05），提示在老年男性中，突变型54T基因可能与血清TG、LDL-c和ApoB升高相关。此结果与Jennifer等[11]报道一致。
流行病学调查已证实，年龄是冠心病、动脉粥样硬化发病的易患因素；高脂蛋白血症特别是血清总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇增高，高密度脂蛋白胆固醇减低是其发生的主要危险因素。因此，结合IFABP基因的表达调控机制和突变型54T IFABP的生物学特征，我们推测突变型IFABP基因可能与老年男性冠心病、动脉粥样硬化的诱发机制有关。关于这一点，尚待我们进一步探讨。

参考文献：
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11.Jennifer R, Galluzzi, Adrienne C, et al. Association of the A/T54 polymorphism in the intestinal fatty acid binding protein with variations in plasma lipids in The Framingham Offspring Study. Atherosclerosis, 2001,159(2):417-424.