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Abstract: Mass spectrometry is a powerful and integrated analytical technique. This paper presented characteristics of mass spectrometry, and reviewed the application of TI-MS, ICP-MS, IRMS and HPLC-MS/MS in clinical nutrition researches.

Keywords: Mass spectrometry；Clinical nutrition

临床营养学是研究营养与疾病关系的一门学科，涉及疾病的营养代谢、营养治疗以及营养预防。现代概念的临床营养，包括胃肠内营养和胃肠外营养，这两种营养支持的内容包括氨基酸、长链及中链脂肪、糖类、维生素、微量元素等多种成分。

既往的科学史表明，几乎所有与生命科学有关的重大研究成果都伴随着大量新技术、新方法的创新性发展。人类基因组计划的迅速完成得易于分子生物学、生物质谱等新技术的成熟和发展。随着科学技术的发展,临床营养学的理论知识和应用技术也在不断完善和提高。在最近召开的第18th国际营养学大会上，营养学研究领域的新技术和新方法主要体现在以下两方面：分子营养学，如mRNA差异显示技术，即将分子生物学中人类基因组学中的一部分内容与营养学进行联接；质谱技术，以其进行机体内某些营养物的定量分析，如采用液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS）对氨基酸，L-肉毒碱等营养物质进行定量测定[1]。近年来，随着液相色谱－串联质谱（LC-MS/MS）等生物质谱技术的日益成熟和普及，质谱在营养学研究领域的应用上了一个新的台阶，能够解决许多科研问题，呈现出巨大的应用前景。

1 质谱技术简介

质谱是根据样品离子的质量电荷比来进行定性、定量研究的一种分析技术。质谱仪是一种大型、复杂而精确的仪器，它涉及到精密机械加工、真空技术，是电子、物理、化学和数理等许多学科的综合结果。质谱仪的核心装置包括进样系统、离子源、质量分析器和检测器。作为一门综合技术，质谱具有下列特点：灵敏度高、进样量少；分析速度快；能测定同位素；分析范围广等。目前，质谱技术在蛋白质组、基因组、代谢组，以及医药、营养、环境检测等诸多领域得以广泛应用。

质谱的种类很多，根据其用途大致可分为无机质谱（如ICP-MS、TI-MS）、有机质谱（如串联四极杆质谱，离子阱质谱）和同位素质谱（如13C-同位素比值质谱）。在传统的营养学研究中，无机质谱和同位素质谱的应用较多。例如，在人体钙吸收研究中，TI-MS可用于测定元素钙；在人体微量元素评价研究中，ICP-MS可以实现多种元素的准确测定；在脂肪和碳水化合物吸收的研究中，13C-呼气试验结合同位素质谱分析是一种非常理想的研究方法。近年来，随着串联四极杆、离子阱、飞行时间质谱等有机质谱技术的成熟和发展，有机质谱在营养学研究领域的应用也呈现出蓬勃发展的景象。

2 TI-MS在钙吸收营养学研究中的应用

钙吸收研究是营养学领域中的一个常见课题，常用的研究方法有钙代谢平衡法、口服钙负荷法、肠灌洗法、放射性核素示踪法及双稳定核素示踪技术等。这些方法各有特点，其中，双稳定核素示踪法以钙的稳定同位素作为示踪剂来进行钙吸收及代谢研究，被国际营养专家组（美国国家科学院医学研究所食品与营养委员会）接受为测定人体钙吸收的“金标准”[2]。

在双稳定核素测定人体钙吸收的研究中，元素钙的测定是研究的关键性技术问题。许多质谱技术可用于钙稳定同位素的测定，如场解吸质谱（FD-MS）、快原子轰击质谱（FAB-MS）、电感耦合等离子质谱（ICP-MS）和热表面电离质谱（TI-MS）。但只有热表面电离质谱（TI-MS）和快原子轰击质谱法（FAB-MS）被公认既准确又简单易行。快原子轰击质谱法（FAB-MS）设备简易,样品制备简单（只需将尿钙用草酸铵沉淀离心后，再以盐酸溶解即可进样），是一种很好钙元素的测定方法[3]。但与热表面电离质谱（TI-MS）相比，其测定的精密度和灵敏度相对要低。TI-MS是测定金属元素同位素丰度的标准方法并被用于测定钙稳定同位素天然丰度的标准值。以TI-MS测定钙稳定同位素，准确度可高达100.05%，精密度小于0.01%[4]。1987年，Yergey等最早将TI-MS与双稳定核素示踪技术结合用以研究健康早产儿和青少年饮食中的钙吸收[5]。但TI-MS测定时容易受到样品中钾等杂质的干扰，因此对样品纯化的要求高，并且仪器设备比较昂贵。

3 ICP-MS在铁、锌、钾等微量元素研究中的应用
微量元素则指那些在人体内含量甚微，低于人体总重量0.05%的元素。目前公认的人体必需的微量元素有铁、铜、锰、锌、钴、镍、硒、钼、氟、硅、钒、铬、锡和碘等14种。这些元素参与人体多种化学反应，在人的生长、发育、衰老、疾病及死亡的过程中，起着重要作用，是许多肠内、肠外营养制剂中的必需成分。

由于微量元素种类很多，为客观反应钙对微量元素的影响，一般不是仅考察一种或几种元素，而是要求同时分析多种微量元素。因此，建立进行相关研究的测定方法时，不仅需要考虑方法的灵敏度和选择性，还应注重各元素测定的兼容性，以便能够同时快速分析多种微量元素。但是，目前没有任何一种分析技术能同时准确测定所有的微量元素。美国国家标准局测定微量元素标准值时常用的方法有：原子吸收光谱，荧光分析法，电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES），质子激发X射线荧光光谱，火花源质谱，中子活化分析，阳离子溶出伏安法等。ICP-MS与常用的ICP-AES有一定相似之处，这种方法的最大优点在于元素分析的兼容性好，可以同时测定多种微量元素。如Wang等用ICP-MS法测定了中药中Fe、Cu、Zn、Ni、Cr、Co、Cd、Mn、Sr等13种微量元素[6]。结果表明，ICP-MS法简单迅速，灵敏度高，动态线性范围宽，是进行微量元素分析的一个强有力的工具。ICP-MS的缺点在于仪器比较昂贵，测定稳定性较差，易受污染，记忆效应比较严重，而且不适合碘等元素的测定（碘常用的检测方法是中子活化分析等）。

4 13C呼气试验与同位素质谱在营养学研究的应用
13C呼气试验原理是根据人体摄入的绝大部分含碳化合物都可以被氧化成CO2和H2O。13C的标记化合物在体内一系列酶的作用下氧化为13CO2，并与体内CO2库混合，引起体内CO2中13C丰度升高，以同位素比率质谱（IRMS）测定一定时间内呼气中13CO2/12CO2比值的变化，就可能反应机体内某一脏器或酶催化氧化反应的速度和程度，从而为科学研究和疾病诊断提供信息。13C呼气试验是一种灵敏、快速、无创及无放射性的研究方法，随着仪器的推广，其在营养学的研究中发挥着重要作用。

4.1 脂肪吸收营养学研究

脂肪的吸收的测定在诊断慢性胰腺炎、囊性纤维化及某些不明原因的慢性腹泻病人所致脂肪吸收不良具有重要作用。在13C呼气试验以前临床上无简便、可靠并能够被普遍接受的脂肪吸收的定量方法。以13C呼气试验研究正常人脂肪吸收是近几年新发展的技术。以饱和十六碳酸1－13C棕榈酸（即软脂酸）为底物，被人体吸收代谢后以13CO2排出体外，用同位素比值质谱或气相质谱即可灵敏测定呼出气中的13CO2变化。以1－13C棕榈酸为底物是因其在肠道中吸收慢于不饱和脂肪酸，且是人类饮食中含量最多的脂肪酸，故棕榈酸是研究脂肪吸收的理想底物。实验已证明13C标记的棕榈酸在体内的动力学参数与天然棕榈酸并无不同，脂解过程不影响棕榈酸的吸收，棕榈酸的吸收可反应总的脂肪吸收情况。

4.2 碳水化合物吸收营养学研究

在以13-C呼气试验评价碳水化合物的吸收时，一般采用玉米作为底物。玉米是C4植物,其13C丰度较高，根据文献报道，其δ13C值为－11.9（中国人以C3植物为主要食物，其δ13C为－23.77‰）。玉米中主要成分为淀粉，其含量为69.6%，脂肪及蛋白质总含量小于10%，可用其表示糖类物质的吸收。

5 HPLC-MS/MS临床营养学研究中的应用

有机质谱的种类很多，如离子阱质谱、四极杆质谱、飞行时间质谱等。近年来，有机质谱中数量增长最快、发展最为迅速、应用最为普及的是与高效液相色谱联用的串联质谱，特别是液相色谱－串联四极杆质谱（HPLC-MS/MS）。HPLC-MS/MS是一种将色谱和质谱整合运行的联用技术，以色谱实现分离，以质谱完成检测，同时具备了这两种技术的优点，具有分离、结构解析同步完成的特点，能直接分析复杂生物基质中痕量混合物组分，已经成为药物定量测定和定性分析的核心技术之一。近年来，HPLC-MS/MS开始应用于营养学，特别是临床营养学领域的研究，并呈现出迅速增长的趋势。HPLC-MS/MS在临床营养学中的用途主要体现为：（1）通过对维生素、氨基酸等营养物质体内水平的监测，为临床治疗和营养支持提供参考；（2）为某些与营养素有关的疾病提供一种新的诊断方法

5.1 维生素的监测

维生素是维持人体健康所必需的营养物质，分为脂溶性（如维生素A、D、E等）和水溶性维生素（如维生素C、B1、B2、B6、B12等）。维生素具有极其重要的生理作用，与多种疾病的发生和发展有关。目前维生素已经广泛用于胃肠内、胃肠外营养支持、创伤感染病人的营养支持、心血管疾病、癌症、骨质疏松、糖尿病多种等疾病的治疗和辅助治疗。因此，正确评价病人在治疗过程中的维生素水平，对于医生优化治疗和营养支持方案，提高治疗效果具有非常重要的临床意义。

传统的维生素体内评价方法有HPLC、荧光法和免疫反应等，由于维生素的种类很多，而且性质差异很大，对检测要求高（稳定性差，必须快速测定。例如，维生素C极不稳定，在－700C冰冻下仅能保存48h[7]；维生素A、D、E需要避过处理，见光即分解），所以尽管有关维生素检测方法的研究已经开展了很长时间，但目前仍没有一种方法能一次性快速测定脂溶性和水溶性维生素，而临床治疗或研究往往需要掌握病人体内多种维生素的情况。所以，当临床需要同时监测病人体内多种维生素（如维生素A、D、E和维生素C、B1、B2、B6、B12）水平时，检验人员就被迫采用不同的方法、或不同的检测条件来测定同一份标本中的不同种类的维生素。根据文献检索和临床反馈来看，这些方法的样品处理过程非常繁琐，检测时间很长（以维生素E为例，常用的HPLC方法测定一个样本至少需要10-15min），难以对临床需求做出及时反馈。而且由于缺少统一的质控标准，加上实验人员的操作水平不一，所以检测结果的质量也难以得到保证。与传统的HPLC等分析技术相比，液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）法具有前者无法比拟的检测优势，灵敏度高、特异性强、测定速度极快，可以一次性同时定量测定几十甚至上百种目标分析物，是目前国外公认的进行小分子药物及代谢物定量研究的最先进的分析技术。笔者所在实验室近年来一直致力于将HPLC-MS/MS技术用于包括维生素在内的多种常见营养素的测定工作，并取得了很大进展。目前，采用HPLC-MS/MS，在一次测定中实现对血清\血浆维生素A、D、E、B1、B2、C的同时测定，对这6种常见维生素的分析一次仅需3min。

5.2 氨基酸的监测

氨基酸是人体必需的营养物质，许多临床营养学研究都是围绕氨基酸来进行的。目前氨基酸作为肠外和肠内营养的基本药品在现代临床治疗上已得到了广泛应用。为了给临床用药和营养支持提供可靠的参考资料，准确而快速地测定人体血液中氨基酸的浓度就显得越来越重要，因而对测定方法的要求也越来越高。目前，可用于氨基酸分析的方法有氨基酸分析仪（柱后衍生的离子交换色谱法）、HPLC（柱前衍生化的反相高效液相色谱法）、GC-MS（柱前衍生化的GC-MS法）、HPLC-MS/MS。其中，氨基酸分析仪和HPLC是目前最常用的测定方法。近年，随着HPLC-MS/MS仪器的普及，已经有研究人员开始开展HPLC-MS/MS测定氨基酸的工作。HPLC-MS/MS最大的特点在于能够利用MS/MS的高选择性、高灵敏度的功能，对氨基酸无需衍生化，样品经处理后可以直接测定，分析速度快，因此大大提高了检测效率。我们实验室在2005年建立了可以一次性测定17种游离氨基酸的HPLC-MS/MS方法，血浆/血清样品以乙腈沉淀蛋白后，直接进样分析，一次测定仅需10min。

5.3 遗传代谢性疾病的诊断和营养支持

遗传代谢性疾病（Inborn Error of Metabolism，IEM）是一类由于基因缺陷引而引起的以功能障碍为主要表现的遗传性缺陷疾病。遗传代谢性疾病种类繁多，目前得到确认的病种就已经超过500种。IEM疾病临床表现复杂多样、诊断较困难。许多患者在新生儿、婴儿期表现基本正常或仅有一些非特异性症状，很易漏诊或误诊。另外，迄今多数遗传代谢病仍无特殊治疗方法，大多数遗传代谢病以饮食治疗为主。因此，对于IEM疾病的防治应遵循早期筛查、早期诊断和早期治疗的原则。近年来，随着HPLC-MS/MS技术的成熟和发展，该技术在IEM疾病的筛查和监测中亦发挥了很大作用。

HPLC-MS/MS用于遗传代谢病的筛查诊断，是新生儿筛查史上非常重要的进展。欧美等国家已经广泛开展了这方面的前瞻性研究，美国FDA在2002年专门制订了指导原则对这种技术在新生儿筛查的应用进行规范[8]。

传统的筛查方法（如Guthrie细菌抑制法）对于氨基酸稀有代谢障碍（如枫糖尿症）、脂肪酸氧化缺陷（如肉毒碱缺乏症）、有机酸代谢障碍的检出率很低。并且一种实验仅能检查一种疾病。以HPLC-MS/MS进行筛查和诊断，主要通过对新生儿干血（或尿）滤纸片中的氨基酸、有机酸、酰基肉毒碱的分析，一次实验可以同时筛查出包括氨基酸病、有机酸代谢紊乱、脂肪酸氧化缺陷在内的多种遗传代谢病，真正实现了从“一种实验检测一种疾病”到先进的“一种实验检测多种疾病”的转变。目前可以采用MS/MS进行筛查的IEM疾病有苯丙酮尿症、中链酰基辅酶脱氢酶缺乏症（MCAD）等40种左右。例如，在一项前瞻性研究中，串联质谱技术对9名患MCAD的患儿的诊断正确率达到了100%[9]。以HPLC-MS/MS对IEM疾病进行筛查和诊断的基本流程是：样本采集（纸片法）、样本准备（沉淀蛋白后进行衍生化）、MS/MS分析（涉及MS/MS的母离子扫描、中性丢失扫描或多反应离子监测等功能）、结果解析。HPLC-MS/MS方法大幅度提高了筛查效率和准确率，降低假阳性/假阴性的发生率，可以对患儿提早进行特殊膳食喂养，防止患儿智力损害和猝死。

6 前景

质谱技术在生物、医药、环境监测等许多领域已经得到了广泛应用，近年在临床营养学、分子营养学和营养蛋白质组学等营养学科中应用呈现逐渐增加的趋势。该技术的缺点在于仪器价格昂贵，检测费用较高，并且仍存在许多理论和技术问题有待解决。但随着质谱特别是生物质谱的日益成熟和普及，该技术在营养学中应用一定会有非常广阔的前景。

参考文献：

1.江骥.营养学研究领域内的新技术和新方法达能营养健康新观察（第三十期，42－48. 2006年3月，国际营养大会专题）.

2.Institute of Medicine, Food and Nutrition Board. Dietary Reference Intake: Calcium, Magnesium, Phosphorus, Vitamin D, and Fluoride. Washington DC: National Academy Press, 1997.

3.Jiang X. and Smith DL. Quantitation of stable isotopic tracer of calcium by fast atom bombardment mass spectrometry. Anal Chem, 1987，59:2570-2578.

4.Yergey A.L, et al. Isotope ratio measurements of urinary calcium with a Thermal Ionization probe in a quadrupole mass spectrometer. Anal Chem,1980，52:1811-1818.

5.Yergey A.L, et al. Direct measurement of dietary fractional absorption using calcium isotopic tracers. Biomed Environ Mass Spectrom, 1987; 14:603-607.

6.王洪允. 中国协和医科大学博士学位论文（2003）, 69-76.

7.孙喜东，范业萍，王艳萍等. 血清、血浆中维生素C测定前稳定性的分析. 中国实验诊断学，2006，10（2）：193－195.

8.Class II Special Controls Guidance Document:Newborn Screening Test Systems for Amino Acids,Free Carnitine,and Acylcarnitines Using Tandem Mass Spectrometry. FDA,  November 24, 2004.