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*2002年中国居民营养与健康状况调查。姬一兵，男，主管医师，博士研究生。

The application of tracer technique of stable isotope in the study of amino acid physiological requirement

姬一兵 朴建华 杨晓光
（中国疾病预防控制中心营养与食品安全所，北京 100050）

摘要：本文简要综述了稳定同位素示踪技术研究氨基酸生理需要量的研究模型、直接氧化法和指示剂氨基酸氧化法的实验原理以及它们在实验中的应用，通过这种方法可以对氨基酸的代谢过程做一动态观察，计算相关的参数，评估各种必需氨基酸的需要量，所得出的相关数值均高于世界卫生组织所给出的数值。

关键词：稳定同位素；氨基酸氧化；生理需要量

Abstract: We introduced the study model of amino acid physiological requirement with stable isotope technique and the principle and application of direct amino acid oxidation and indicator amino acid oxidation.With these methods We might study metabolism kinetics of amino acid, calculate relative parameter, and estimate all kinds of amino acid physiological requirements, the value of amino acid requirements which are calculated by stable isotope technique are obviously higher than that of WHO.

Keywords: stable isotope；amino acid oxidation；physiological requirement

人体内的蛋白质由20种氨基酸构成，其中有9种是人体自身所不能合成的，必需直接从外环境中摄取并经过体内的生理生化反应而合成人体需要的蛋白质。氨基酸主要是由碳、氢、氧、氮这四种元素构成的，在自然界中存在的各种元素差不多都有自己的同位素，它们的原子序数相同而原子质量不同，化学性质接近，在体内参与相同的生化反应，在对氨基酸的代谢动力学和生理需要量的研究中，利用氮或碳的稳定同位素来对氨基酸进行标记，从而对氨基酸在体内的代谢过程进行动态观察，这样就可以确定氨基酸的氧化率及吸收利用率，确定氨基酸的流量，通过特定的计算公式求出人体对氨基酸的需要量。稳定同位素早在20世纪30－40年代就已经被学者于医学、生物学的研究，但是由于其价格仰贵及检测过程复杂而没有得到广泛应用，从20世纪70年代起该方法又重新引起人们的关注，并被引入到氨基酸需要量的研究中。

1 稳定同位素示踪技术的研究模型

1.1 双库模型

该模型将人体的氨基酸代谢过程分为两个库，即游离氨基酸代谢库和体蛋白质库，蛋白质在这两个库之间不断地合成和分解，保持着动态的平衡。根据该模型理论，进入游离氨基酸代谢库的途径有两条，一是由食物摄入的氨基酸（I），另一条是由体蛋白质分解而产生的氨基酸（C），离开这个库的途径也有两条，一是转变为代谢产物（E）而排泄，如脱氨、氧化，最后生成尿素、氨等物质，另一个去路是用于蛋白质合成而进入体蛋白质库（S）。当机体处于稳定的蛋白质和氨基酸营养状态时，机体内氨基酸代谢处于平衡状态中，即单位时间内进入这个库的氨基酸的量与离开的氨基酸的量相等：Q＝I＋C＝S＋E，如果单位时间内进出游离氨基酸代谢库的量以（Q）表示，同时再测定E和I的值，便可以计算出蛋白质的合成速率（S）和分解速率（C），这一模型的确立是以一系列假设为基础的。其中主要的假设为：1）在实验期间代谢库大小是恒定的2）实验期间示踪原子的再利用可忽略不计3）游离氨基酸代谢库的消除途径，除C和E外可忽略或校正[1]。

1.2 α氨基酸的代谢动力学研究

在氨基酸动力学研究中，根据研究的具体要求和目标所采用的标记原子通常为15N和13C，15N标记位置为氨基酸的氨基氮，13C标记的位置通常为氨基酸的羧基[2]。氨基酸在体内的代谢途径，主要是通过转氨基和脱羧基作用，形成α酮酸，进而参与重新合成机体氨基酸或者长碳链分解供能，可以测定氨基酸在机体多个代谢动力学参数，进而描述出各种氨基酸在体内的动力学过程。研究中，标记的氨基酸通常通过静脉内的方式引入体内，包括静脉内短期快速推注和恒速输注[3]。氨基酸在体内脱氨以后生成α酮酸，后者除了进一步继续氧化进而燃烧供能以外，仍然有一部分还可以与氨基结合重新形成氨基酸。这一过程对于研究氨基酸的代谢具有很大意义，例如在研究亮氨酸的代谢过程中，通常标记羧基碳，求出给予实验对象不同水平亮氨酸的氧化率，通过确定两相回归曲线的拐点进而求出亮氨酸的需要量。

1.3 稳定同位素示踪技术在营养学研究中的优越性

避免了放射性同位素对人体辐射的损害，无环境污染。

弥补了放射性同位素在种类上的不足。如碳、氢、氧、氮等没有合适的放射性同位素的元素，可以利用它们的稳定同位素进行研究。

利用质谱仪，磁共振谱仪等仪器作为稳定同位素标记化合物的测定手段时，可以同时测定同位素的丰度和示踪物的结构，对示踪原子进行定位，从而进行代谢研究。

可以进行多标记、多重复实验。

应用稳定同位素示踪的方法比常规的氮平衡方法更优越，可以动态的观察蛋白质、氨基酸代谢过程，深入了解它们的代谢机制。应用稳定同位素示踪的方法，可以测定人体内蛋白质的更新，包括机体内的总体蛋白质合成和分解速率，通过蛋白质分解代谢产物来定量计算[4]

2 氨基酸氧化法（直接氧化法）

通过给予受试者不同水平的氨基酸受试剂量来检测氨基酸的氧化率的变化，进而确定机体所需氨基酸的适宜量的一种方法。它是建立在这样一种理论基础之上，当机体摄入的某种氨基酸在未达到生理需要量之前，主要用来合成机体的蛋白质，一旦这种氨基酸达到并且超过了生理需要量，那么超过的那部分则会被机体所氧化，从而导致该氨基酸的氧化率迅速升高，在氨基酸氧化率对应氨基酸摄入量水平的量效曲线的拐点处所对应的氨基酸的摄入水平则被认为是该种氨基酸的生理需要量[5]。在该种方法中氨基酸的氧化率的测定使用同位素示踪的方法，既可以是稳定同位素也可以是放射性同位素，Brookes等首先使用该方法确定大鼠的赖氨酸需要量，此后，这种方法先后用于大鼠的几种不同的氨基酸需要量的研究中，Brookes等通过动物实验证实了量效曲线的拐点处所对应的氨基酸的量即是生理需要量，因为他的数据显示，在低于该水平的氨基酸剂量组中，大鼠停止生长而且体重减少，而在高于该剂量的组中大鼠能够正常生长[6]。

稳定同位素示踪技术需要对氨基酸代谢库及分解的终产物进行准确的测量，经过标记的碳原子最终将出现在各种不同的代谢产物中，这使得解释起来很困难，而且标记的羧基碳不经过呼吸排出而是参与其它的合成反应也是存在的[7]。选择的标记氨基酸需要满足三个条件：1）标记氨基酸必须是必需氨基酸；2）必须是除了氧化分解生成CO2及合成蛋白质外不参与其它的有意义的化学反应；3）标记的羧基碳的氧化反应是不可逆的并且氧化产物能够定量的计算。美国麻省理工学院的Young以及他的同事们做了一系列的研究，利用稳定同位素标记羧基碳并测定氨基酸氧化率的变化，确定了亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸及苏氨酸的生理需要量[8]。在他们的研究中，氨基酸流量及氧化率的测量是通过恒定的静脉输注13C标记的氨基酸，当在某一氨基酸摄入水平氨基酸的氧化率骤然增加时，那么可以认为达到了该氨基酸的生理需要量。他们认为FAO/WHO推荐的蛋白质供给量太低[9]。Millard和他的同事们在理论和方法上对Young的结论产生质疑[10]，他们认为，1）应用稳定同位素方法所得出的结论由于示踪剂的稀释而得出不正确的结果。2）对某一测试水平给予一定的适应期影响了对氨基酸需要量的估计。3）从进食状态氧化研究中得出的结论是否反映了24h的氨基酸平衡。虽然氨基酸氧化法在确定氨基酸的需要量方面很有价值，但是由于方法本身的一些缺点，比如示踪剂稀释问题，还并未被广泛采用。

近年来，Vernon Younge及其同事不断改进他们的研究方法，由短期的静脉输注测定进食状态下机体的氨基酸的代谢状态，发展为24h静脉输注并且测定受试者进食状态与禁食状态这二个生理状态下的氨基酸动力学变化的各项参数，充分考虑了人体生物节律这一影响人体代谢动力学研究的因素，并考虑了不同人群、各族、环境等因素，在印度人中做了大量实验研究，所得出的结论与早期的短期静脉输注研究的结果基本一致[11、12]。

3 指示剂氨基酸氧化法（间接氧化法）

这是一种新近兴起的估计人类氨基酸需要量的方法，该方法建立在这样的假设基础之上，每一种必需氨基酸对膳食中的第一限制氨基酸都是敏感的，当某种必需氨基酸限制蛋白质的合成时，那么其它的过量的氨基酸必须被氧化，这就是说当逐渐增加膳食中限制氨基酸的含量时，将使其它的膳食氨基酸更多地用于合成蛋白质，这样就减少了它们的氧化，当该限制氨基酸达到生理需要量，这时如果再增加限制氨基酸的水平也不会再降低其它氨基酸的氧化，此时在限制氨基酸摄入水平对应指示剂氨基酸氧化率的量效曲线上，表现为随着限制氨基酸的量的增加，指示剂氨基酸氧化率逐渐下降并且在曲线的拐点后下降不再明显，说明限制氨基酸已经达到了生理需要量[13]。指示剂氨基酸氧化法得到了许多实验的支持，David C Wilson的实验表明，以苯丙氨酸为指示剂确定苏氨酸的需要量时，随着苏氨酸的供给量从不足到足量，苯丙氨酸的氧化率逐渐下降，在达到一定程度后苏氨酸的量再增加，则苯丙氨酸的氧化率也不再降低[14]。这证明苯丙氨酸可以作为其它氨基酸代谢率的指示剂。

指示剂氧化法在几个重要的方面不同于直接氧化法，它可以避免直接氧化法所面对的几个问题和质疑。在直接氧化法中，随着膳食氨基酸浓度的增加所要测定的氨基酸的代谢反应库的体积也会增加，相应地会造成待测定氨基酸浓度降低。而在指示剂氨基酸氧化法中，指示剂与标记和未标记氨基酸的浓度都不会发生变化[15]。在Zello等所做的一项人体代谢研究中，随着赖氨酸摄入量从5mg·kg-1·d-1到60mg·kg-1·d-1，血浆苯丙氨酸浓度、同位素丰度以及苯丙氨酸流量没有变化[16]。这些都表明，指示剂氨基酸氧化法能够克服同位素标记物稀释的问题。该方法的另外一个优点在于可以自由选择要测试的氨基酸，有一些氨基酸由于其羧基碳不能通过分解代谢生成CO2因而不能够使用直接氧化法来测定，这样可以使用该方法。只有当一种氨基酸的羧基碳原子能够发生不可逆的氧化反应，它才能通过收集呼吸气的方法定量的测定。

可以根据氨基酸的代谢特点选择合适的指示剂，苯丙氨酸、赖氨酸和亮氨酸都曾经被用作指示剂，但后来发现亮氨酸在确定必需氨基酸的需要量中并不是一个很有效的指示剂[17]。苯丙氨酸和赖氨酸可以很好地满足作为指示剂的条件，使用13C标记的苯丙氨酸和赖氨酸作为指示剂可以测定必需氨基酸的需要量[18、19]。使用稳定同位素13C标记苯丙氨酸研究赖氨酸和色氨酸的需要量，所得出的的结论与直接氧化法相近[20、21]，无论是直接氧化法还是指示剂氨基酸氧化法所得出的估计值都要比FAO/WHO根据氮平衡法给出的推荐值要高。

综上所述，稳定同位素示踪技术能够充分反映出蛋白质和氨基酸在体内的代谢动力学变化，并可以直观的简化的模型来计算各项参数，通过计算流量、氧化率等指标来从氨基酸体内的代谢机制上微观精确地研究其生理需要量。而且随着稳定同位素检测技术的明显改进，该方法的检测准确性也越来越高，并且也能够用于研究蛋白质的合成与分解，当前主要有直接氧化法和示踪剂氨基酸氧化法，它们各有优缺点，在研究氨基酸的需要量中可以互相比较互为参照，随着营养学领域中对氨基酸生理需要量的研究的不断深入，稳定同位素示踪技术一定会有更为广阔的应用前景。

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