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江骥 毛丹 胡蓓
（中国医学科学院北京协和医院临床药理中心，北京 100730）

1引言

肉毒碱化学名为β-羟基-γ-三甲基丁酸，广泛存在于机体组织中。因分子中含有手性碳原子，可以分为L和D两种构型，但只有L构型具有生理活性。本文所指的肉毒碱均为L构型。游离肉毒碱与脂肪酸酯化后便生成脂酰肉毒碱。根据酯化的游离脂肪酸碳链数目的不同，脂酰肉毒碱又可分为短链脂酰肉毒碱（C2-C5）、中链脂酰肉毒碱(C6-C12)和长链脂酰肉毒碱(C14-C18)。

在机体内，长链脂肪酸必须与肉毒碱酯化为脂酰肉毒碱后才能通过线粒体膜进行β氧化，并且肉毒碱还能与脂酰CoA发生酰基交换，释放出游离的CoA。这些过程需要多种酶的协调作用才能顺利完成。但由于先天性缺陷或某些因素的诱发使得酶的活性出现异常时，脂肪酸的代谢便会出现紊乱。β-氧化受阻可由所涉及的17种蛋白质（16种酶和1种转运蛋白）中的任何一种缺陷造成[1]。

如图1所示，肉毒碱经肉毒碱转运载体在细胞中被摄取。如果肉毒碱转运载体缺乏，便会造成细胞内肉毒碱浓度降低，尿中肉毒碱排出增多。游离脂肪酸在胞质中被活化为脂酰CoA，迄今所知，这个过程没有缺陷。脂酰CoA必须通过肉毒碱棕榈酰转移酶I（CPT I）的作用转化为脂酰肉毒碱后，才能通过线粒体内膜。该酶缺乏可导致血浆中游离肉毒碱浓度的相应增高[3]。脂酰肉毒碱跨越线粒体内膜受特殊载体蛋白的影响，这种载体蛋白的缺乏可引发伴有高氨血症的严重新生儿疾病[2]。附着于线粒体内膜内侧的是合在一起具有5种酶活性的三种蛋白质，它们是：肉毒碱棕榈酰转移酶II(CPT II)，超长链脂酰CoA脱氢酶（VLCAD）及具有长链3-羟基脂酰CoA脱氢酶（LCHAD）、长链烯酰CoA水解酶和长链3-酮酰CoA硫解酶活性的三功能蛋白。婴儿期这些功能中的任何一种缺陷，便会表现为心肌病和长链脂酰肉毒碱的增高，此外还有严重的低酮性低血糖。当中链脂酰CoA分子从这组线粒体内膜酶中释放出来时，它们便进入了β氧化的下一个循环中，被进一步分解为中链和短链的脂酰CoA。中链脂酰CoA脱氢酶（MCAD）缺乏是欧洲西北部新生儿缺陷中最为常见的一种，具有较高的猝死率。短链脂酰CoA脱氢酶（SCAD）常见症状为持续性肌张力低下[3,4]。

上述的各种酶缺陷均会引起血中各种脂酰肉毒碱浓度的相应变化。如转运载体缺陷会使游离肉毒碱浓度降低，CPT I缺陷使游离肉毒碱浓度大幅度增加，酰基肉毒碱转位酶、CPT II、LCAD和VLCAD缺陷使长链脂酰浓度增加明显，MCAD和SCAD缺陷分别使中链和短链脂酰肉毒碱明显增加。因此，可根据各种酶缺乏所引起的脂酰肉毒碱在血液中浓度的变化情况，为临床许多与此相关的代谢性疾病的诊断提供了依据。并且，这类分析方法也已经被用于某些新生儿先天性疾病筛选以及临床肉毒碱代谢异常的诊断等。

2 对血浆标本中L-肉毒碱的定量分析方法

目前测定生物基质中肉毒碱的方法主要包括酶法、色谱法和质谱法等。其中以液相色谱－串联质谱联用法（HPLC-MS/MS）最为优越，这种方法的特异、灵敏、快速、准确等优点均得到了广泛的认可。借助这类方法，不仅可以快速、准确定量测定血浆中游离的肉毒碱，也可以区分不同长度碳链的脂酰肉毒碱并同时进行定量测定。从而使得检测不同类型脂酰肉毒碱的代谢情况成为可能。

在本研究中，我们利用这一方法定量测定了血浆中游离肉毒碱、盐酸丁酰肉毒碱、盐酸戊酰肉毒碱、盐酸癸酰肉毒碱、盐酸月桂酰肉毒碱、盐酸棕榈酰肉毒碱以及盐酸庚酰肉毒碱等。图2是典型的血浆中游离的不同长度碳链脂酰肉毒碱的液相色谱－串联质谱的测定结果。其中的C2-C16是指脂酰肉毒碱中碳链的长度，IS为用作定量的内标物质。

Fig 2Profiles of Carnitin in human sera measured by Tendam Mass spectrometer

对血清中的这些不同类型肉毒碱的最低定量浓度分别为5nmol/ml到0.1nmol/ml之间。这个灵敏度意味着通常只需要0.1ml的血液标本就可以满足定量分析的需要。

3对我国部分正常人和肝硬化、冠心病情况下血清中游离以及不同长度碳链脂酰肉毒碱情况的检测
在本研究中，我们分别对健康人以及患有慢性肝、肾功能异常以及冠心病病人血清中血清中游离以及不同长度碳链脂酰肉毒碱的情况进行了初步的检测（见表1）。

表1研究对象的基本情况

健康人的标准为：不吸烟，不嗜酒。血常规、尿常规、血生化等化验结果正常，肝、肾功能、心电图正常，乙肝五项、丙肝、HIV抗体均阴性。病人的诊断均按照北京协和医院临床常规检查后确诊。所有血液标本的获取均是在清晨空腹状态下抽取。

3.1 健康人的数据

Fig1The comparison of free carnitine and
acetylcarnitine between male and female

Fig2The comparison of acylcarnitines between male and female

图1显示了健康男性与健康女性血清中FC及C2-CNT的比较，图2显示了其它五种脂酰肉毒碱的比较，图中柱形图的高度为各物质血清中浓度的平均值±标准误。统计结果显示：肉毒碱及各种脂酰肉毒碱在男性与女性之间无显著性差异。

此外，根据对血清中游离肉毒碱及脂酰肉毒碱的浓度与体重指数及年龄的相关性分析来看，当P＜0.05时认为有统计意义。统计结果显示血清中游离肉毒碱及脂酰肉毒碱的浓度与体重指数及年龄无相关性。

3.2 病人与健康人数据的比较

图3和图4比较了健康人和病人的测定数据。图中柱形图的高度为各物质血清中浓度的平均值±标准误。统计结果显示：慢性肾衰病人血清中FC和C2-CNT的浓度较健康人显著减少，其它脂酰肉毒碱未见显著差异。冠心病病人血清中FC和各脂酰肉毒碱的浓度与健康人比较无显著性差异。肝硬化病人血清中的C2-CNT、C12-CNT、C16-CNT的浓度较健康人显著增加（P＜0.05），C4-CNT和C10-CNT的浓度亦有所增加，但未见显著差异。

Fig3The comparison of acylcarnitines
between normal and disease

Fig4The comparison of acylcarnitines
between normal and disease

4 讨论

人体所需的肉毒碱主要从日常饮食中获得，也可在肝脏和肾脏等部位以赖氨酸和蛋氨酸为原料合成[5]。在某些疾病状态下肉毒碱自身合成不足，而此时又往往无法进行正常饮食，这又造成外源性的肉毒碱补充不足，可导致肉毒碱的缺乏。

有文献报道肝硬化患者体内肉毒碱浓度异常[6, 7]。由于肝脏是合成肉毒碱的主要部位,而肝硬化病人的肝部已经受损,合成能力减弱,又由于食欲减退,使肉毒碱的摄入不足，诱发肝功能衰竭。有些研究发现[8]进行性肝硬化的肉毒碱严重缺乏,只有健康人的25%，尸检发现肝硬化患者肝脏、肾脏、肌肉及脑中的肉毒碱水平也只有其他住院患者的1/4到1/3，并且还发现肝硬化导致的肉碱缺乏病人，20%～60%伴有脂肪肝。但另有研究结果表明[9,10]，肝硬化病人血浆中的游离肉毒碱浓度与健康人无差别，短链和长链酰基肉毒碱浓度明显高于健康人（p＜0.01）。为研究肝硬化病人是否存在肉毒碱缺乏现象以及各脂酰肉毒碱浓度是否与健康人存在差别，本研究测定了17名肝硬化病人的血清标本，结果显示肝硬化病人血清中的游离肉毒碱浓度未见减少，各脂酰肉毒碱浓度高于健康人。

脂肪酸是心肌能量的重要来源，尤其是饥饿状态下，心肌主要依靠脂肪酸的氧化供能[7]。在组织缺氧时，(氧化成为脂肪氧化的限速步骤[8]，会引起长链脂酰CoA在心肌内大量堆积。长链酰基CoA是肌纤维膜的Ca-ATP酶抑制剂[ 10，11]，造成钙离子在细胞内堆积。腺嘌呤核苷酸转移酶（ANT）的活性亦受长链脂酰CoA的影响[12]，这种酶的功能是将ATP移出线粒体并将ADP移入线粒体，当ANT受到抑制时，细胞的氧化和磷酸化过程便会中断，使ATP产生减少。高浓度的长链酰基CoA还会抑制酰基CoA合成酶，这种酶能够激活长链脂肪酸[13]，其受到抑制便会使脂类的代谢发生紊乱。动物试验表明，缺血心肌内的游离肉毒碱和总肉毒碱的水平均降低，游离脂肪酸及长链酰基CoA的浓度升高，产生毒性[14]。为研究心脏病人体内肉毒碱浓度的变化，本研究采集了13名冠心病人的血清标本，研究结果表明冠心病人血清中的游离肉毒碱未见减少，而各脂酰肉毒碱均有不同程度增加，但不具有统计学意义。

有的文献报道，美国健康男性（2-83岁，n=40）血浆中FC浓度为46.8±10nmol/ml(28-69nmol/ml)，健康女性（2-85岁，n=45）为40.1±9.5(19-60)[15]；欧洲健康人血浆中FC和C2-CNT的正常水平：男性分别为48nmol/ml和5nmol/ml，女性分别为33nmol/ml和3nmol/ml[16]。国内亦有文献报道，健康男性（28-58岁，n＝10）血浆中FC及C2-CNT 浓度分别为42.5±13.9nmol/ml和7.4±3.1nmol/ml，女性（38-50，n＝10）分别为33.3±10.1nmol/ml和6.2±1.6nmol/ml[15]。由于人种、各国的饮食习惯均不相同，入选人群的年龄构成、样本量的大小以及测定方法亦有所不同，这些都造成了测定结果的差异。但本研究的数据与前述的中国健康人的数据比较接近。对于各种脂酰肉毒碱，尤其是中链和长链的脂酰肉毒碱的数据国内还未见报道。

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