学术报告厅

Intestinal Microflora and Liver Cirrhosis

葛声¹ 马可²

（1 上海交通大学附属第六人民医院营养科，上海200233；2 复旦大学附属华山医院急诊科，上海200040）

    近年来研究发现，在肝硬化的发生发展过程中，肠源性内毒素血症具有重要的作用，两者互为因果，相互促进。肠源性内毒素主要来源于肠道菌群的失衡。因此，通过调整肠道菌群以改善肝硬化患者的症状、预防肝硬化并发症的发生等成为研究的热点［1］。

    正常情况下，肝脏可清除来自肠道的包括内毒素、氨、吲哚、酚类、短链脂肪酸、假性神经递质前体等各种毒素，还能清除肠源性细菌、真菌等。一旦肝脏功能受到严重损伤，肠道的微生态可发生显著变化，进而肠道屏障功能受损，肠道细菌及其各种代谢产物大量移位进入肠外器官，过度激活机体免疫系统，引起异常免疫反应，导致肝细胞凋亡、坏死。

    1 肝硬化与肠道菌群失调

    人类正常肠道菌群包括需氧菌、兼性厌氧菌和厌氧菌，共由30属500种组成，它们一起形成一个极其复杂的微生态系统。肠道菌群与人体相互依存，构成肠道的微生态系统，该微生态系统对促进食物的消化，产生维生素B1、B2、B6、B12、维生素K、泛酸、生物素、烟酸、叶酸等营养物质，抵御外来致病菌的侵入以及刺激免疫系统等方面有着重要作用。在肠道的各段中结肠中的细菌浓度最高，其中厌氧菌占绝对优势。回肠末端菌群组成与结肠的接近，厌氧菌数目明显增多，包括双歧杆菌、梭状芽孢杆菌、拟杆菌以及革兰阳性球菌等，活菌数达103~107个/mL。大肠中厌氧菌的数量比需氧菌和兼性厌氧菌高1000~10000倍。其中，优势菌为拟杆菌、双歧杆菌、真杆菌和消化链球菌，亚优势菌为葡萄球菌、乳杆菌、D族链球菌和大肠杆菌等。

    正常人肠道菌群的组成在一定时期内、一定的条件下，保持相对的稳定。在疾病状态和应用抗生素的情况下，容易出现菌群失调。曾有研究发现肝硬化患者的厌氧菌明显减少，双歧杆菌、乳酸杆菌所占比例下降，而产氨菌比例上升成为最优势菌。

    国内学者华静等［2］对37例肝硬化患者的肠道及18例健康者粪便中8种常见的厌氧菌及需氧菌进行定量分析发现，肝硬化患者双歧杆菌、真杆菌、拟杆菌数量明显低于对照组，失去肠道内优势菌地位，而大肠杆菌、产气荚膜杆菌等高于正常组成为优势菌。此时，肠道内处于高度腐败状态，产生的氨、硫化氢、胺类、酚类等有害物质大量蓄积并被人体吸收入血，导致机体各器官、组织受损，肝硬化患者肠道菌群失调，肠粘膜内pH下降，肠腔内pH上升，使有益菌的定植、生长、繁殖受到影响。

    2 肝硬化与肠屏障功能障碍

    肠道屏障［3］包括机械屏障、化学屏障、微生物屏障和免疫屏障，这些屏障维护着肠道的正常功能。机械屏障由肠道粘液层、肠粘膜上皮细胞、细胞间紧密连接等构成；化学屏障由胃肠道分泌的胃酸、胆汁、各种消化酶、溶菌酶、粘多糖等化学物质构成；微生物屏障由肠道常驻菌群的微生态平衡构成；免疫屏障主要由肠道免疫系统的细胞群构成。

    正常情况下肠道屏障能阻止肠道内细菌及其分解产物经肠壁扩散至机体内。肝硬化时由于小肠血液灌注减少，肠系膜缺血、肠道蠕动差，使得致病菌易于繁殖，再加上此时肠系膜上皮细胞缺血、坏死等，肠屏障受损，通透性增高，失去了对细菌的屏障作用，大量细菌及毒素进入组织内。而此时机体免疫功能又减退，肝脏Kupffer细胞功能受抑制，以及侧支循环的形成使其对内毒素的清除作用下降，致使肠道内毒素得以大量进入体循环［4］。

    肝硬化造成的肠黏膜屏障的损害导致细菌移位发生［5］，从而造成内毒素血症及自发性腹膜炎［6］。“细菌移位”的概念是由Berg等［7］于1979年提出的，即肠道内活的细菌在解剖学上穿过肠道黏膜层进入肠道固有层，达到肠黏膜淋巴结以及更远处的器官，如肝、脾和肾等。1990年，Alexander［8］将“细菌移位”的概念扩展为“微生物移位”，即肠道内可存活的或不能存活的细菌及其产物，包括内毒素，通过解剖学完整的肠粘膜屏障侵入肠道以外部位的过程。肝硬化时，肠道黏膜发生的超细微变化，肠道黏膜细胞萎缩，肠细胞间紧密连接部位发生分离和增宽，使细菌及其产物通过细胞旁通路，进入肠系膜淋巴结和门静脉循环，造成细菌移位。进入血循环的内毒素直接损伤肠黏膜上皮细胞，线粒体和溶酶体，并引起肠微血管收缩，使肠黏膜血流量减少，肠组织缺血、缺氧，肠黏膜的屏障功能下降，加剧内毒素的吸收，成为内毒素血症。细菌移位导致细菌进入腹腔以及肝脏库Kupffer细胞吞噬能力下降等导致宿主机体防御功能低下，增加了患者的感染率，是肝硬化患者常合并自发性腹膜炎的重要原因。

    3 肝硬化与内毒素血症

    内毒素是由革兰氏阴性细胞壁外层的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）和蛋白质复合而成，通常在细菌死亡后，由细菌壁崩解后释出。正常情况下，肠源性革兰氏阴性细菌产生和释放的内毒素可以小量、间歇地进入门脉系统，进入肝脏后迅速被肝脏Kupffer细胞清除，不会形成体循环内毒素血症。非常低水平的内毒素，对提高机体的免疫功能是有益的。肝硬化时，由于枯否细胞功能受抑制，肝功能受损，使内毒素清除时所需的载体al脂蛋白和a1球蛋白减少，肝脏对内毒素的清除和解毒作用降低；肝硬化时肠道菌群往往失调，致病菌大量繁殖，使内毒素的产生增加；肝硬化门脉高压，胃肠道淤血水肿及肠粘膜慢性炎症的发生率增高，破坏了肠粘膜屏障，内毒素的吸收增多；肝硬化门脉高压，门-体侧支循环建立，通过门-体循环短路而形成内毒素血症。故肝硬化时内毒素血症的发生率较高，发生内毒素血症后反促肝脏损害。

    LPS入侵机体后首先与血清LPS蛋白结合，然后与细胞表面的CD14分子结合，LPS以LPSLBPCD14复合物的形式活化TLR4信号转导，通过TLR4将LPS的信号转导至细胞内发挥作用。Toll样受体4是革兰氏阴性杆菌脂多糖受体，可激活单核巨噬细胞产生如白介素（IL）1S、重组核因子α、IL6、IL8等促炎因子［9］。LPS可直接诱导肝细胞凋亡，其数量与LPS的量成正比，且在24h内与时间成正比，早期表现以肝细胞凋亡为特征，晚期则表现为凋亡和细胞坏死同时发生。几乎所有肝硬化患者血清中均有LPS浓度增高。肝硬化患者因肠粘膜机械屏障和免疫屏障功能下降、肠道菌群失调、肝脏对内毒素清除能力下降、内毒素吸收增加和排泄减少等，可造成肠道菌群生长过度和菌群易位，发生内毒素血症。反之，内毒素血症本身又可能直接加重肝脏组织的损伤。动物实验也发现肝硬化腹水的形成与内毒素血症逐渐加重有关。

    4 微生态调节剂在肝硬化及其并发症治疗中应用

    微生态调节剂是指根据微生态学原理，利用对宿主有益无害的活的正常微生物或促进其生长的物质制成的制剂。分为益生菌、益生元及由益生菌和益生元联用组成的合生元。

    微生态调节剂在肝硬化治疗中应用不多，研究包括动物实验及少量人体试验。人体试验证实补充益生菌可以调节肠道菌群，降低血氨以及内毒素水平。Chiva等［10］为观察乳酸菌加抗氧化剂对肝硬化大鼠肠道菌群和细菌易位的影响。将29只采用四氯化碳诱导的肝硬化腹水SD大鼠，分为乳酸菌组、109CFU添加抗氧化剂、维生素C（n=10），vehicle alone(n=11)，水(n=8)灌胃。另外8只非肝硬化的大鼠作为对照组。干预10天后，处死大鼠观察回肠、盲肠微生物结构、细菌易位、丙二醛（MDA）水平。结果与采用灌水对照组相比，单独采用抗氧化剂干预组，以及抗氧化剂加乳酸菌干预组，干预后肝硬化肠球菌、肠杆菌细菌异位(0/11 and 0/10 vs5/8, P＜001)，而且回肠MDA水平明显降低。提示抗氧化剂或者抗氧化剂联用乳酸杆菌可以预防肝硬化时细菌易位。

    Zhao等［11］将50名肝硬化患者随机分为两组，分别口服含有双歧杆菌、乳酸杆菌及肠球菌的胶囊和含有枯草芽孢杆菌和肠杆菌的胶囊14天，同时设20名健康对照组。检测指标包括干预前后肠道6种常见菌菌群改变、粪便pH值、粪氨以及血液中血氨、内毒素的含量。结果发现与健康对照组相比，肝硬化患者肠道中肠球菌、肠杆菌数量明显增多，而双歧杆菌和梭状芽孢杆菌显著减少。经过14天肠道益生菌干预，与干预前相比，两组肝硬化患者血氨、粪氨、粪便pH值都显著下降，血液中内毒素水平也明显下降，服用枯草芽孢杆菌和肠杆菌胶囊的患者干预前后血液内毒素水平差异有统计学意义（p＜005）。

    由于益生菌能够降低血氨水平，用于预防轻度肝性脑病方面的研究较多。Liu等［12］给轻症肝性脑病的患者采用合生元2000进行治疗，合生元制剂含4种冻干的不产氨细菌（3种乳酸杆菌和一种小球菌各1010 CFU，加可发酵纤维10g：包括β葡聚糖、菊粉、果胶和抗性淀粉各25g）。55例轻症肝性脑病的患者随机分为3组，其中20例使用合生元制剂，20例单用可发酵纤维，15例用安慰剂。连续干预30天。干预前通过粪便定量分析发现肝硬化患者粪便中大肠杆菌和葡萄球菌生长增多。使用合生元制剂治疗后，这两种细菌数量减少，不产氨的乳酸杆菌增多，而双歧杆菌和肠球菌计数不变。证实合生元2000对降低肠道G细菌有效。停用合生元制剂14天后，乳酸杆菌增多，大肠杆菌和葡萄球菌减少的情况仍存在。用合生元治疗后75%患者的粪便pH减低至55以下，单用益生元的患者中也有70%粪便pH低于55，而安慰剂组患者100%粪便pH均大于55。使用合生元制剂治疗后50%患者的肝性脑病逆转。治疗前血氨浓度平均为605pmol/L，血浆内毒素浓度平均110pg/ml；治疗30天后分别降到386pmol/L和833pg/ml。两个治疗组患者的血清胆红素、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和白蛋白浓度均有好转，50%患者ChildPugh分级好转，而安慰剂组无改变。研究结果提示，改变肠道菌群不仅可以改善肝性脑病，也能改善肝脏疾病，即ALT等指标和ChildPugh分级好转，说明合生元能影响和阻断肝性脑病发病机制中某些环节。

    人体试验提示益生菌治疗可以改善肝硬化患者肝功能指标［13，14］。尽管liu等［12］的研究最初是为研究合生元2000在治疗轻症肝性脑病中的作用，研究同时也揭示了经过1个月的治疗，经过随机分组而采用合生元2000治疗的患者中47%患者肝脏ChildPugh分级好转，而在采用可发酵纤维治疗组只有29%患者有改善，安慰剂组只有8%患者有改善，主要表现在血清白蛋白、胆红素和凝血酶原方面。作者推测，血清内毒素水平的下降与肝脏合成功能改善有关。

    另一项研究比较了补充益生菌和益生元对肝硬化患者的治疗作用。Riordan等［15］用补充G+肠道菌群调节合生元：11个患者进入实验，包括酒精性7人，丙肝3人，原发胆源性肝硬化1人；其中Childpugh分级A级7人，B级2人，C级2人，口服冻干G+肠道菌群调节剂，应用不同的益生菌，胚芽乳酸杆菌2362，乳酸菌亚支19等。每个胶囊的细菌浓度为4×1010CFU（colony forming units），以及10g生物活性纤维含β葡聚糖25g、菊糖25g、果胶25g及抗性淀粉25g）（合生元2000）。病人每天给予2次，每次1粒胶囊，共7天。在干预前和干预过程中病人不给予乳果糖。检测外周血单核细胞（PBMCs）TLR2的表达、血清TNFa水平，以体外外周血单核细胞对SEB（葡萄球菌肠毒素）的刺激产生的TNFa的水平为判断基线。补充7天、28天后，作为对照组5例没有症状的志愿者不给予肠道菌群调节剂，在3个不同的时间点进行TLR2的分析为标准。结果口服益生菌和益生元治疗7天后，TLR2表达显著增加，而停药28天后又逐渐降低接近治疗前水平。治疗7天时TNF浓度增加，可能说明内毒素和其他细菌刺激对TNF生成的重要意义。上述结果提示，补充合生元7天后肠道中G+细菌增加，导致周围血中单核白细胞的TLR2和血清TNF增加，为进一步研究TLR2在用合生元治疗肝脏炎症和纤维化中的作用提供了线索。

    5 展望

    肠道微生态研究显示，肝硬化的并发症如细菌感染、肝性脑病等病症的发生发展中肠道菌群起了非常重要的作用，调整肠道菌群微生态可作为辅助治疗的手段［16］。应用益生菌和益生元或许可以改善临床病情较轻的慢性肝病和肝硬化患者的临床前景。微生态调节剂的优点是无毒副作用，但是疗效还不够显著，这可能与微生态制剂种类的选择、进入体内的有效活菌数等因素有关。迄今为止，有关肝硬化患者肠道菌群的结构变化与其功能关系研究相对较少，临床试验规模较小，相关研究大多以动物实验为主，今后需要加强微生态制剂所用菌种的筛选研究，进行较大规模的临床肝硬化肠道微生态干预研究，以确定微生态调节剂防治肝硬化的作用。关于益生菌治疗的安全性问题、对全身的影响以及与抗生素联用等问题都将有待于进一步的研究证实。

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