学术报告厅

中国绝经后妇女亚甲基四氢叶酸还原酶C677T多态性与骨折风险的关系

中国绝经后妇女亚甲基四氢叶酸还原酶C677T多态性与骨折风险的关系
Association of the methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism and fracture risk in Chinese postmenopausal women

Xiumei Honga,b,dYi-Hsiang HsucHenry TerwedowcGenfu TangdXue LiudShanqun Jiangd Xin XucXiping Xua,b,d（a 中国科技大学生命科学院；b 美国芝加哥伊利诺斯大学公共卫生学院流行病学与生物统计学部群体遗传学中心；c 美国波士顿哈佛公共卫生学院群体遗传学项目；d 安徽医科大学医学研究所）

王劲译自Bone, 2007, 40(3)∶737-742.

摘要：骨质疏松性骨折是老年人群残疾和间接死亡的最主要原因。以前的研究显示，同型半胱氨酸水平和编码亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）的基因C677T多态性可能涉及欧洲人群骨质疏松的形成及其相关骨折。本研究的目的是确证1899名中国绝经后女性的多态性与骨矿物质密度（BMD）和骨折间的关联。该人群C677T基因的T等位基因是392%。MTHFR的基因型分布遵循HardyWeinberg平衡定律。T等位基因携带者倾向于患骨质疏松症或骨质减少症的风险较高，但统计学差异不明显。然而，Poisson回归分析揭示，T等位基因携带者绝经前后的骨折风险增加（RR=17，95%CI=11～27，p=001）。就绝经后骨折发生率而言，CT或TT基因型是CC基因型风险的2倍以上（RR=25，95%CI=12～49，p=0009）。该关联独立于年龄、体力活动、职业、被动吸烟、身高、体重、绝经后年限和整个髋部的BMD。
我们的资料显示，MTHFR C677T基因多态性是骨折风险的独立预测因子，尽管其对BMD仅有微弱的作用。进一步对该基因多态性在骨折形成中所起作用的机制研究可以使我们更好地了解骨质疏松性骨折的病因学。

引言

    骨质疏松是一种普通的代谢性骨病，其特征以骨量下降、骨骼脆性下降和骨组织微观结构破坏，最终引起骨折增加。骨质疏松性骨折是老年人群残疾和间接死亡的最主要原因。30%女性和12%男性在生命某一刻受其影响，因此，对社会造成了严重的经济负担。
    同型半胱氨酸是含硫醇的氨基酸，形成于蛋氨酸代谢中。最近，几方面证据指出高同型半胱氨酸水平涉及骨质疏松和骨折的病理学。首先，高半胱氨酸尿症是罕见的常染色体隐性遗传疾病，是以同型半胱氨酸循环血水平升高和骨质疏松及骨折早发为特征。其次，在动物研究中，与对照组小鸡相比，喂饲添加同型半胱氨酸饲料的小鸡，骨骼生长、骨基质和骨成分发生了改变。第三，最近，来自2个队列研究的资料显示，总同型半胱氨酸血浆水平与骨质疏松性骨折呈正相关。此外，在NHANES Ⅲ研究中，同型半胱氨酸水平≥20μmol/L的男女性髋部BMD明显低于同型半胱氨酸水平＜10μmol/L的个体。
    一般认为，包括510亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）等几个酶在同型半胱氨酸代谢中起重要作用。MTHFR基因（C677T）点突变，引起缬氨酸置换丙氨酸，是一个与酶活性下降和同型半胱氨酸水平升高有关的共同变量。一些研究报道，该基因多态性与骨质疏松性骨折或低BMD风险增加有关。然而，其他研究未能确证这种关联。例如，Jorgensen等报道MTHFR C677T基因多态性的杂合子或纯合子绝经后女性骨质疏松性骨折风险均下降。相反，Golbahar等发现该基因多态性与伊朗女性股骨颈或腰椎BMD没有关联。这些研究结果的差异可能部分由于研究人群的不同，如种族、年龄、环境和遗传修饰。
    本研究，我们调查了2003～2005年中国安徽省社区骨质疏松研究中的一个绝经后女性抽样人群。评价该抽样人群的MTHFR C677T基因多态性对整个髋部、全身和股骨颈的BMD以及骨折风险的作用。

材料与方法

研究人群
该研究是始于2003年社区骨质疏松研究中的一部分，以前描述过。简而言之，在中国安徽省男女性中纳入年龄在25～64岁和至少3名参与的同胞。排除以下病史的参与者，包括Ⅰ型糖尿病、肾衰、结核病或其他慢性传染病、恶液质、佝偻病或其他代谢性骨病。自述停经1年以上并无外科手术史（子宫或卵巢切除）及妊娠或哺乳的女性被认为是绝经后女性。本研究仅对无吸烟史的女性进行基因分型和分析。7名服用钙和/或多种维生素补充剂累积达或超过6个月的绝经后女性，以及5名绝经后有雌激素治疗史的女性也被剔除。最终，本研究获得2245名绝经后女性。本研究方案得到了哈佛公共卫生学院人类对象委员会（制度审查委员会，IRB）和安徽医科大学伦理委员会的批准。向每位参与者解释知情同意书，并让他们阅读和签名。

    BMD测量和骨折识别
    采用双能X线吸收测量术（DXA，GELunar Prodigy, Madison, WI）通过扫描全身和整个髋部测量骨矿物质含量（BMC）和BMD（g/cm2）。整个髋部BMD低于同一研究地区青年健康中国人平均BMD峰值25个标准差以上（Tscore＜-25）者诊断为骨质疏松。整个髋部BMD低于峰值BMD1～25个标准差则定为骨质减少。
    采用问卷调查收集骨折信息。记录骨折频率、骨折部位及参与者第一次和最后一次骨折的年龄。本次调查仅分析第一次骨折史。为了增加统计效力，文件证明任何部位的第一次骨折均作为测量结局。然而，鉴于手、足、头骨和面部骨折不被认为是骨质疏松事件而被排除。

    可能的混杂因子
    脱鞋，在精度01cm的测距仪上测量身高及在室内开灯着内衣测量体重（精度为01kg）。体重/身高2（kg/m2）计算体质指数（BMI）。通过标准化问卷收集参与者的性别、生日、病史、职业、体力活动水平及月经和生育史（包括初潮年龄、上次月经的日期和HRT史等）。采用膳食调查问卷收集每位参与者的地方食品条目/种类，如主食（主要是大米）、牛奶、海产品、罐头食品、肉类（主要是猪肉）、水果和蔬菜。

    SNP基因分型
    收集参与者的空腹静脉血样，并且通过标准化盐析过程提取淋巴细胞中的基因组DNA。采用聚合酶链反应进行MTHFR C677T基因分型，引物是5CAA AGG CCA CCC CGA AGC3（有意义链）和5AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG3（反意义链）。样品扩增35个循环，包括94℃30分钟变性、59℃45秒退火和68℃45秒延长、最后68℃7分钟延长。由于第677核苷c转换成t产生了HinfI的消化位点，核酸内切酶能够将突变限制位点的扩增产物分解成175bp和70bp片段，而野生型基因不被分解。消化产物在3%琼脂糖凝胶上电泳分离。基因分型后，获得1899名研究对象DNA样本，最后分析有全部基因分型者的资料。有全部基因分型者和没有基因分型者的主要特征没有显著性差异。

    统计方法
    本研究主要结局是骨质疏松/骨质减少和骨折发生。调整年龄、身高、体重、体力活动、被动吸烟和绝经年限等的多元线性GEE回归模型用于检验全身、整个髋部、股骨颈等部位BMD与MTHFR C677T基因分型间的关系。调整年龄、身高、体重、体力活动、被动吸烟和绝经年限等的多元logistic回归模型用于估计该基因多态性对骨质疏松和骨质减少的独立风险。
    采用2个结局变量计算第一次骨折的发生率。第一个变量是绝经前后所有骨折的发生率，采用从生日至第一次骨折日或资料收集日间的风险累积人年数表达。第二个变量是绝经后第一次骨折发生率，采用绝经年龄至第一次骨折日或资料收集日间的风险累积人年数表达。分析第二个变量时，排除了57名第一次骨折发生在绝经前的研究对象。
    调整年龄、身高、体重、体力活动、职业、被动吸烟、绝经年限和整个髋部BMD的Poisson回归用于计算按MTHFR C677T基因型分类的骨折风险比例及其95%可信区间。
    进一步使用膳食变量（如每周海产品、水果和肉类等消费量）作为B族维生素/叶酸等摄入量的代理标志物，并通过增加乘积项进入模型，检验了每种膳食变量与MTHFR基因型间的对BMD和骨折的交互作用。

结果

    在1899名绝经后研究对象中，C677T等位基因频率符合HardyWeinberg平衡定律（X 2=37，p=006）。基因型分布是：CC，CT和TT分别是359%、498%和143%。每种基因型的人群特征列于表1。连续性变量采用ANOVA检验，而分类变量采用X 2检验比较基因型间这些特征的差异。除了TT基因型重体力活动百分比相对低以外，这些人群特征在基因型分类间没有显著性差异。有关膳食资料，我们发现以周为基础，981%的对象蔬菜消费超过1500g，991%的对象牛奶饮用低于250g，774%的对象鱼类消费低于250g，591%的对象罐头食品消费超过250g，823%的对象水果消费低于250g，且683%的对象肉类消费低于250g。按基因型分组，食物频率分布比较用X 2检验（p＞005）。

    MTHFR基因分型、骨矿物质密度和骨质疏松
    正如图1所示，不同MTHFR C677T基因型间平均的全身、整个髋部和股骨颈的BMD没有差异。调整多元回归模型中年龄、体力活动、职业、被动吸烟、身高、体重和绝经后年限等变量后，MTHFR C677T基因多态性仍然与每一骨骼部位的BMD没有显著相关性（资料未显示）。
    正如表2所示，T等位基因携带者患骨质疏松症和骨质减少/骨质疏松趋于较高风险，但是相关性没有统计学显著性(p＞005)。

    MTHFR基因分型和骨折
    109名研究对象自述髋部、脊椎、腕、臂、腿、踝或骨盆等部位有骨折，并纳入分析中。平均第一次骨折年龄是417±132岁。绝经后发生了52例骨折事件。按基因型分层的骨折类型分布见表3。通常，各基因型中主要骨折类型是腕部骨折。CC或CT基因型倾向于与骨折或绝经后骨折较高发生率有关。

与CC基因型对象比较，调整年龄、体力活动、职业、被动吸烟、身高、体重、绝经年限和整个髋部BMD等，则CT和TT基因型对象的骨折相对危险度（RR）分别是17（95%CI=11～27，p=002）和19（95%CI=11～33，p=002），携带T等位基因对象的骨折RR是17（95%CI=11～27，p=002）。就绝经后第一次骨折发生率而言，MTHFR C677T基因型也表现出明显的T等位基因显性效应。T等位基因携带者相对于CC基因型携带者，其绝经后骨折发生率增加至25倍（95%CI=12～49，p=0009），见表4。

此外，我们利用代表B族维生素/叶酸摄入量的膳食变量作为代表标志物，并检验膳食变量和MTHFR基因型对BMD和骨折的交互作用，但没有检验出显著的交互作用(资料未显示)。

讨论

    我们的资料表明，MTHFR C677T基因型对绝经后中国女性骨折风险有显著和独立的效应。CT或TT基因型增加绝经前后骨折发生的风险。T等位基因携带者相对于CC基因型携带者，其绝经后骨折发生率增加至25倍。
    MTHFR C677T等位基因频率在世界不同的地区和民族间有很大的变异。该等位基因频率在西非人是009，在加拿大因纽特人是006，而白种人、日本人和中国人群的频率要高很多。在欧洲观察到C677T等位基因频率自北向南升高。相反，在中国报道，TT基因型自北向南减少。更为有趣的是，MTHFR基因型分布可能改变其对血浆同型半胱氨酸的效应。所有这些结果强调了研究不同人群中该基因多态性影响作用的重要性。本研究中，研究对象来自中国中南部。TT基因型和T等位基因频率分别是143%和392%，这与中国该地区以前研究相当。中国人群T等位基因和TT基因型的高频率表明，MTHFR C677T多态性的归因危险度可能要高于许多以前报道的研究中所见的危险度。
    绝经后的日本女性显示MTHFR TT基因型与低腰椎和全身BMD间有显著性关联。以前中国的研究或本次研究不能确证该关联，尽管我们发现TT基因型趋于骨质疏松或骨质减少的高风险，但统计学不显著。对该差异的解释可能在于营养因素摄入量的不同，如核黄素、B6、B12和叶酸，这些都是同型半胱氨酸代谢所必需的。最近一项苏格兰女性队列研究表明，仅在核黄素摄入量低时，TT基因型对象的BMD下降。因此，营养因素可能是MTHFR多态性与BMD之间关联的混杂因素。在我们的研究中，采集了自述药物治疗史（口服避孕药、激素替代疗法 \[HRT\]）、钙、维生素D和多种维生素补充剂等）。仅7名对象钙和/或多种维生素补充剂使用累积达到或超过6个月，并且均被剔除。绿叶蔬菜（像菠菜和芜菁绿叶）、水果（如柑桔类水果和果汁）、干豆和豌豆等均是叶酸的天然来源。尽管B族维生素存在于许多食品中，但它们脆弱易被破坏，尤其易被酒精和烹调破坏。食品加工也会丢失B族维生素，如生产的精白面粉、面包和大米比其全谷类原料的营养价值要低。尽管通过简单的问卷采集了参与者局部食品的消费量，如牛奶、海产品、罐头食品、肉类、蔬菜和水果等，但由于问卷的属性，无法定量每日膳食的B族维生素或叶酸的摄入量。然而，我们研究队列中的主要食物来源有限，且参与者膳食摄入量相对一致。按基因分型，本研究膳食变量分布是均衡的。这些膳食变量也被用于B族维生素/叶酸摄入的代表性标志物，并且估计它们与MTHFR基因型对BMD和骨折的交互作用效应，但未发现显著的交互作用。
    237名病例和200名年龄匹配的对照的丹麦病例-对照研究描述了TT基因型相对于联合CC/CT基因型的骨质疏松性椎骨骨折的比值比（OR）是193。另一项丹麦前瞻性研究随访了1748名绝经后妇女。后者，经受骨折的42名对照组妇女和10名HRT处理组妇女纳入分析，绝经后前5年骨折发生率在TT基因型的对照组中增加至2倍以上（RR=26）。与这2项研究一致，我们发现TT基因型研究对象绝经后骨折发生率的风险高出23倍。这种关联不依赖于年龄、绝经年限、体力活动、职业、被动吸烟、目前酒精消费量和整个髋部BMD。然而，我们也发现CT基因型对骨折风险的作用类似于TT基因型作用的强度，因此，表明MTHFR C677T多态性表现的是对骨折风险的T等位基因显性模型。鉴于这些结果，MTHFR C677T基因型在骨质疏松性骨折形成中可能起独立的作用。
    MTHFR C677T多态性与骨折风险间关联的机制不清楚。然而，我们推断T等位基因携带者骨折风险增加不是主要由BMD介导的。众所周知，MTHFR C677T多态性与同型半胱氨酸水平增加相关。高同型半胱氨酸水平可能在骨折风险中起作用。正如丹麦研究中所示，同型半胱氨酸水平处于最高四分位数的对象与处于其他3个四分位数的对象相比，非椎骨骨折风险随同型半胱氨酸水平升高而增加。Framingham研究报道了妇女同型半胱氨酸水平升高与髋骨骨折发生率间的类似关联强度。尽管高同型半胱氨酸水平导致骨折的机制还未确定，但一些资料表明，它可能干扰了胶原横向连接并导致骨基质改变而形成更多的脆性骨骼。我们假设MTHFR C677T多态性可能通过升高同型半胱氨酸水平干扰骨微观结构形成，这不依赖于骨中矿物质数量。
    MTHFR C677T多态性可能存在通过改变DNA甲基化而对骨骼起间接作用。DNA甲基化是关键的表观遗传学机制，它包括染色质修饰的开始和基因表达的调节。DNA异常甲基化被认为在许多疾病的促进中起重要作用。最近，几个报告显示，MTHFR C677T基因型携带者DNA甲基化明显减少。这个过程可能涉及同型半胱氨酸相关的血管疾病和肿瘤的病理学。需要进一步研究确定是否由MTHFR C677T多态性引起的DNA甲基化能够影响骨折发生率。

对该观察到的关联的另一个解释是：并不是MTHFR基因本身中的MTHFR C677T多态性增加骨折风险，而是邻近与该多态性基因不均衡连接的基因造成的。据报道，赖氨酸羟化酶1（LH1）基因的突变与LH1活性下降及导致减弱胶原交联有关，该基因位于染色体1上距MTHFR基因150kb处。
本研究存在几个局限性。首先，它是一个回顾性研究，并且存在不能排除的回忆错误偏倚。第二，此处所研究的骨折事件是自述的且由当地医生诊断。没有进一步的确证诊断而不能完全区分骨质疏松性骨折和高能量外伤引起的骨折。第三，鉴于膳食资料的局限性，仍然不能完全排除MTHFR C677T多态性可能与B族维生素和/或叶酸交互作用的可能性。因为叶酸和维生素B6和B12是同型半胱氨酸浓度的主要决定因子，这些维生素中一种或多种不足可更改同型半胱氨酸对骨表型的影响作用。需要进一步研究解决这个问题。
总之，我们发现MTHFR C677T多态性在预测骨折风险上起独立作用。需要进一步研究阐明MTHFR C677T多态性对骨折形成影响的机制。识别这种机制可能有助于更好地了解骨质疏松症和未来骨质疏松性骨折的病因学，并且可导致早期预防、识别和处理策略的改善。