学术报告厅

摘要：评估4766名老年男女同型半胱氨酸及其相关因子作为髋骨骨折的风险因子。高同型半胱氨酸水平和低叶酸水平可预测骨折，而维生素B12及其基因型与骨折风险没有关系。高同型半胱氨酸水平可能是髋骨骨折的一个可变风险因子。血浆总同型半胱氨酸（tHcy）升高和叶酸及维生素B12缺乏与骨质疏松及骨折风险有关。我们研究血浆tHcy水平、叶酸、维生素B12和亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）677C→T和1298C→T多态性是否可预测骨折。材料和方法这是一项2639名女性和2127名男性的人群前瞻性研究，选择了1992年-1993年年龄在65岁-67岁的男女性。骨折信息来自从进入研究期至2005年11月30日期间该地区所有住院治疗公开诊断的计算机记录。按血浆tHcy水平、叶酸、和维生素B12及其不同基因型等变量，应用Cox比例风险回归估计骨折风险。结果在126年的随访期中，记录了184名女性（70%）和90名男性（42%）髋骨骨折患者。tHcy高水平（≥15μmol）相对于低水平（＜90μmol＝，研究对象骨折调整风险比例（95%CI）女性是242（143～409）、男性是137（063～298）。剂量-反应分析表明，男女性血浆tHcy与骨折风险间存在正相关，而仅女性血浆叶酸与骨折风险存在负相关。调整混杂因素后，血浆维生素B12水平或MTHFR基因型与骨折风险没有显著性关联。经调整血浆维生素B12和叶酸水平，tHcy与髋骨骨折间的关联仅轻微减弱。结论老年男女性tHcy可能是髋骨骨折的预测因子。叶酸仅是女性的预测因子，而维生素B12和MTHFR基因型不能预测髋骨骨折。我们的资料确证了同型半胱氨酸在骨质疏松性骨折发病机制中可能起作用的假设。

关键词：同型半胱氮酸；叶酸盐；维生素B12；多态性；髋骨骨折

引言

    骨健康和骨折风险与一碳单位代谢的成分有关，包括血浆总同型半胱氨酸（tHcy）、叶酸、维生素B12水平和亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因中677C→T的多态性等。这些研究被几个临床表现、过早骨质疏松和骨折患者伴有高半胱氨酸尿患者的观察报告所推动，高半胱氨酸尿症是以极高的血浆同型半胱氨酸水平为特征的先天性代谢障碍。一些（并非所有的）研究显示，tHcy水平与髋部BMD间存在反向关系。最近，2个大型研究显示，血浆tHcy水平中等度升高是老年男女性骨质疏松性骨折的风险因子。
    叶酸和维生素B12是tHcy水平的主要营养决定因子，但这些B族维生素可能不依赖于tHcy而对骨组织起作用。在一些研究中，维生素B12缺乏似乎与骨质疏松和髋骨骨折风险增加有关，并可能是因为成骨细胞活性的抑制。然而，其他研究中，轻微维生素B12缺乏与BMD没有关系。在老年意大利人研究中，低血清叶酸是骨折的预测因子，且一旦考虑血清叶酸则tHcy没有独立作用。特别是日本的研究，联合应用叶酸和有效降低脑血管意外后的髋骨骨折风险。
    编码MTHFR的基因存在普遍的多态性。在677碱基对处C→T转换的纯合子个体在叶酸营养状况无损情况下，易于升高tHcy，这个基因型是总人群中血浆tHcy的强决定因子。一些研究中TT基因型与低BMD相关，且发现这种相关性仅见于低叶酸和低核黄素情况下，但其他研究中未见这种相关性。该基因多态性和骨折风险的研究结果是不一致的。我们不能确定任何出版物中MTHFR 1298 A→C多态性与骨折风险的关联。最近的资料显示，MTHFR 1298 A→C多态性影响一碳单位代谢，而677C→T的不均衡不能解释这种影响作用。因此，我们进行与之相关的研究，探索1298 A→C与髋骨骨折间的关联。
    本研究的目的是在大型人群队列研究中，检验基线血浆tHcy、叶酸、维生素B12水平，及MTHFR677C→T和1298A→C多态性是否与以后的髋骨骨折相关。

材料与方法

    研究人群
    1992-1993年进行Hordaland同型半胱氨酸研究的基线体检，由卑尔根大学、当地健康服务和国立健康筛检服务间协作进行。按照2个主要年龄段（41岁-42岁和65岁-67岁），邀请41岁-67岁的男女性。因为低年龄段人群的髋骨骨折太少而不能单独检验，所以分析限制在4766名基线期年龄在65-67岁的参与者（出席率732%）。随访队列13年，每一位参与者的随访期的计算是自进入研究时间开始至下列任何一件事件首先发生时，这些事件包括第一次髋骨骨折、死亡或研究结束。地方医学研究伦理委员会、资料巡察员及健康与社会事务董事会批准了本研究方案。

    实验室检测
    收集非空腹EDTA血样，冷冻并离心1～3h。分离血浆和压积血细胞，分析前储存于-20℃。用全自动高压液相色谱（HPLC）检测血浆tHcy。分析结果包括20名tHcy浓度≥40μmol的参与者。告知这些人高浓度检测结果，并给予临床建议及叶酸和维生素B12治疗。排除这些人本质上不会改变研究结果。用微生物法测定血浆。基线叶酸和维生素B12测定前，血浆样品已储存于-20℃达10年。血浆维生素B12是稳定的，而血浆叶酸在冷冻期下降。然而，我们以前报道尽管1995年～2000年叶酸水平下降20%，但tHcy和其他因子的关联强度保持不变。从压积血细胞中提取DNA，并用实时PCR测定MTHFR677C→T和1298A→C多态性。

    骨折评估
    骨折信息获自服务于Hordaland郡6家医院的所有住院治疗的公开诊断的计算机记录，这些住院治疗发生于基线体检时至2005年11月30日期间。髋骨骨折规定为发生在观察期的近端股骨第一次骨折。包括仅由适当外科程序确定的髋骨骨折。用于分类髋骨骨折的公开诊断是按照国际疾病分类第9版（ICD-9）∶820-8209和第10版∶S720-S722。按照挪威外科程序分类（1989年第2版和1995年第3版）和以后的NOMESCO外科程序分类（1999年第一版-2004年第三版），编码每一位外科住院治疗病例。搜索所有医院公开识别的骨折诊断以进行适当地外科治疗。遗漏外科编码导致16名髋骨骨折患者排除在外。死亡时间信息获自挪威国家人口登记部门。

    其他资料的收集
    着轻质衣服测定身高和体重，并计算体质指数（BMI，kg/m2）。自行填写的问卷提供受教育、体力活动、咖啡消费量、吸烟习惯、及维生素和雌激素补充剂的使用等信息。同时，自述糖尿病、癫痫症、关节炎、肾病和脑血管疾病等疾病。基于这些信息，按吸烟情况分成5类：非吸烟者、以前吸烟者、轻度吸烟者（1～9支/天）、中度吸烟者（10～19支/天）、或重度吸烟者（≥20支/天）。参与者被标以最适合他们去年闲暇时平常体力活动程度的类别：久坐不动、步行、至少4小时/周骑脚踏车或其他类型的中等体力活动、至少4小时/周身体锻炼。以杯记录每天咖啡消费量。维生素D补充以使用含维生素D的片剂或鳕鱼肝油约每年每周大于5天来确定。
    受教育以是否完成高中水平分成2类。以目前是否使用将雌激素使用分成2类。其他收集的资料细节以前已发表。

1997～1999年资料的收集

    1997～1999年间邀请了4766名基线年龄在65～67岁的对象进行第二次体检，3340名（701%）参与者进行了第二次体检。这次体检基本包括相同的变量。此外，用标准碱性苦味酸法测定血清肌酐。用Kendrick目标学习测验评价认知功能，钙和维生素D的膳食和补充剂摄入量用定量食物频率问卷测量。用固定DXA（EXPERT-XT; Lunar, Madison, WI, USA）获得髋部BMD。

    统计分析
    用KaplanMeier估计和Cox比例风险模型估测血浆tHcy、叶酸及维生素B12水平与以后的髋骨骨折间的关联。基于以前使用的临床临界值，血浆tHcy被分成4类（tHcy：＜90，90-119，120-149，≥15μmol）。为了探索是否高水平tHcy骨折风险会增加，将血浆tHcy最高水平类别再细分为150-199μmol和≥200μmol等2类。选择血浆维生素B12和叶酸临界值以获得以tHcy临界值所分4类对象相似的比例（各变量在最极端类别中全组的10%以内）。用线性表示法检验指标变量的趋势。在不对剂量-反应曲线形状作任何假设的情况下，还检验了暴露组间的差异性（p用于齐性）。在扩展Cox模型中，以时间作为协变量，检验比例风险假设，结果没有检测到统计显著性差异。调整BMI、吸烟状况、咖啡消费量、体力活动水平、经常使用维生素D补充剂、受教育水平以及女性使用雌激素等变量进行分析。为了评价每种因素的独立性以及比较tHcy、叶酸和维生素B12对骨折风险的强度，将所有3个变量均纳入同一模型。通过使用乘积项分析某一因素在血浆中水平高于和低于另外一个其他因素的性别中位数的效应，还用Cox回归分析以探索tHcy、叶酸和维生素B12的协同作用的可能性。第二次资料收集（1997-1999）包括了协变量的测量值，这些混杂因素在基线资料收集时（1992-1993）没有获得。我们还排除了糖尿病、脑血管意外、癫痫症、肾病和关节炎等疾病进行分析，因为这些疾病已知会增加tHcy水平和骨折风险。用p样条函数（pspline function of SPLUS）拟合Cox模型以获得剂量-反应的图形表现，该函数适合变形（非线性）效应估计。Y轴上，模型产生相对参考刻度，1代表处于平均tHcy或叶酸浓度的骨折风险。这些剂量-反应曲线按前述相同协变量调整。Cox回归也用于估计MTHFR 677 C→T多态性和调整了年龄与性别的骨折间的关联。为了检验血浆叶酸水平对这种关联可能的效应变化，血浆叶酸水平在4nmol处一分为二。该值接近TT组叶酸的中位数水平，选择该临界值以确保该组中有足够数量的个体处于叶酸高水平和低水平。我们比较了同一叶酸水平不同基因型组间的髋骨骨折风险以及同一基因型不同叶酸水平组间的骨折风险。计算MTHFR/叶酸组的平均tHcy水平。除了SPLUS，还运用SSPS for Windows 130版进行统计分析。

结果

    人口统计学和血液指标

    126年的中间随访期间（范围从002～130年），记录了184名女性（70%）和90名男性（42%）的髋骨骨折。按骨折状况基线特征列于表1。后来发生骨折的对象比后来未发生骨折对象中目前吸烟者比例明显较高。与未发生骨折组相比，骨折组的血浆tHcy较高而BMI较低，女性血浆叶酸较低而男性血浆维生素B12和维生素D摄入量较低（表1）。骨折组和非骨折组间平均KOLT评分、血清肌酐、或钙摄入量等没有显著性差异（资料未显示）。

    血浆tHcy水平和髋骨骨折风险
    女性整个随访期间，血浆tHcy水平和髋骨骨折累积发病率间有强关联（图1；表2）。而男性，剂量-反应关系曲线呈J型。当tHcy浓度处于90-119、120-149和≥150μmol的研究对象与tHcy浓度＜90μmol的研究对象相比，女性的调整HRs分别是086、159和242，而男性分别是042、073和137。然而，趋势检验表明，两性别的血浆tHcy和骨折风险间存在正相关。叶酸和维生素B12水平的调整本质上不会改变这种关联（表2）。当将血浆tHcy水平最高类别再细分成150-199和200μmol等2个水平时，可见骨折风险有进一步升高。tHcy浓度≥200μmol的研究对象与tHcy浓度＜90μmol的研究对象相比，调整HRs（95%CI）男女性分别是308（147～646）和170（062～466）。排除糖尿病、脑血管意外、癫痫症、关节炎和肾病等研究对象后，本质上不会改变这种结果。在参加第二次体检的亚组中，tHcy和骨折间的关联基本上是相同的。进一步调整在1997～1999年间测定的钙和维生素D摄入量、KOLT评分、或血浆肌酐等变量后，该亚组中tHcy和骨折间所观察到的关联没有改变。调整1997～1999年测量的股骨颈或全髋部BMD后，tHcy和髋骨骨折风险间的关联明显减弱，但仍保持显著性（资料未显示）。

    在logit尺度上，tHcy浓度在7～20μmol范围的男女性骨折风险增加接近于线性；然而，男性比女性的CI更宽（图2）。

血浆叶酸和维生素B12与髋骨骨折风险

    最低叶酸水平类别的女性髋骨骨折风险增加（图1和表2）。女性低叶酸水平（＜29nmol）比高叶酸水平（≥66nmol）的骨折调整HR（95%CI）是240，而男性差异没有显著性。尽管调整tHcy和维生素B12后，女性的这种关联有点减弱，但仍然存在统计显著性。女性血浆叶酸水平和骨折风险间的负相关关系在2～10nmol的叶酸浓度范围间接近线性（图2）。维生素B12水平和骨折风险间没有相关性（表2），并且在剂量-反应关系曲线上没有观察到阈值效应（资料未显示）。

MTHFR基因型和髋骨骨折风险

    MTHFR677C→T基因型（CC：497%、CT：421%和TT：83%）和1298A→C基因型（AA：441%、AC：451%和CC：108%）的比率处于HardyWeinberg平衡（p＞02）。在全人群或叶酸水平＜4nmol的亚组中，677C→T基因多态性与骨折风险间均无关联（表3）。尽管各基因型间没有显著性差异或趋势，但在低叶酸水平人群中，提示TT组比CC组的风险高。每一基因型中，低叶酸水平个体比叶酸水平＞4nmol个体的骨折风险轻度增高（图3）。TT基因型相对于其他基因型的研究对象，其与低血浆叶酸水平相关的风险增加程度更大。TT基因型个体中，低叶酸个体骨折风险增加大（几乎是3倍）且具有统计学显著性意义。然而，基因型与叶酸水平间的交互作用不显著。不同叶酸水平组间，TT基因型个体的平均tHcy水平的差异高于其他2类基因型的个体。MTHFR1298A→C基因多态性与髋骨骨折间无相关性（资料未显示）。

讨论

    本4766名男女性前瞻性人群研究提示，高tHcy或低叶酸的女性髋骨骨折风险增加。剂量-反应关系分析表明，男性血浆高tHcy与骨折风险间也存在正相关关系。男女性的维生素B12水平与骨折风险均无相关性。尽管MTHFR基因型与骨折没有相关性，低叶酸水平的TT基因型个体是高叶酸水平TT基因型个体骨折风险的2倍。
    本研究的优势包括：研究对象是相关年龄段的大人群队列、前瞻性设计和髋骨骨折数量相对较大等。研究中涉及对已确立的骨质疏松和高同型半胱氨酸血症风险因子的测量，如吸烟、低体力活动、咖啡消费量和低雌激素暴露等。
    因为本研究是观察性的，所以不能解决是否同型半胱氨酸是髋骨骨折因果关系作用的问题。测定叶酸和维生素B12的血浆样品在分析前已储存长达10年，这可能会削弱相关关系。因为对医院公开诊断的有效性质疑，所以我们仅选择了由恰当外科程序的同一编码所确证的第一次髋骨骨折诊断。这可减少再次入院治疗、转诊或错误编码带来对骨折风险的高估。我们可能会遗漏一些发生在Hordaland郡外的髋骨骨折，但这应该不会使我们的结果失效。
    我们的结果与Framingham队列研究和LASA/Rotterdam研究的结果是一致的，后2个研究显示tHcy是老年人髋骨骨折的强预测因子。这2个研究均未测定叶酸或维生素B12。尽管在我们的研究中，女性tHcy和骨折间的剂量-反应关系最强，但在男性我们也观察到了类似的模式。女性和男性间的差异可能是因为男性终点数量较少，但生物学差异不能排除。我们研究中的女性低叶酸水平与骨折风险增加相关，这一点与较小规模的老年意大利人队列研究结果一致。老年荷兰女性而不是男性的低维生素B12水平增加了骨折风险。我们发现调整后的分析结果中，维生素B12水平和骨折间没有关联。这些矛盾结果的原因可能与纳入研究对象的年龄、维生素B12缺乏的规定和招募研究对象的地区叶酸强化等差异有关。挪威没有对食品进行B族维生素强化。

    MTHFR677基因型与tHcy浓度升高有关。MTHFR677C→T多态性在一些研究（但不是所有）中显示与骨折风险增加和BMD下降有关。本研究中677C→T多态性对髋骨骨折风险缺乏影响可能是因为统计效能不足。TT基因型个体的血浆平均tHcy浓度比CC基因型个体高出27μnol。假如TT基因型产生的风险是因为其单独对tHcy起作用，则预期相对危险度对应的每增加3μmol tHcy的HR（95%CI）为男性107（102～113）和女性117（110～125）。相对危险度检验的范围在110～115、检验效能80%及显著性水平为5%将需要7800～16300名病例和相等数量的对照。TT基因型个体中低血浆叶酸水平的骨折风险比在其他基因型研究对象中增加更大的结果提示，677C→T转换与叶酸效应增加相关，这支持tHcy或叶酸对骨折风险的作用效应。
    目前，不清楚同型半胱氨酸如何影响骨折风险。高同型半胱氨酸尿症患者研究提示存在胶原交联紊乱。也有实验室和流行病学证据支持同型半胱氨酸增加骨吸收的假设。本研究小组和其他研究小组已经报道了tHcy水平和BMD之间存在反向关系。然而，在Rotterdam/LASA研究中，tHcy和骨折风险间关联似乎不依赖于BMD。我们研究显示，tHcy和髋骨骨折间关联在调整BMD（1998年测量）后仍有显著性。此外，一项日本随机对照试验发现联合给予叶酸和维生素B12可降低脑血管意外后髋骨骨折风险，而BMD没有相关变化。这些资料提示，同型半胱氨酸对骨的效应某种程度上独立于BMD。
    高tHcy水平通常反映了膳食叶酸、维生素B12、核黄素或维生素B6摄入量低。这样的膳食也暗示对骨健康重要的营养素，如维生素D和钙的膳食摄入量低。我们发现在参与第二次体检（1997-1999）的研究对象中，tHcy和骨折间所观察到的关联不依赖于维生素D和钙的摄入量。然而，不能排除来自膳食因素的剩余混杂。
    维生素B12独立于tHcy影响骨组织，可能是因为抑制了成骨细胞的活性。我们研究观察到的tHcy和骨折风险间的关联不能被低叶酸和维生素B12水平所解释，提示同型半胱氨酸对骨骼有独立效应。tHcy升高可能是老年人认知功能受损和Alzheimer疾病的风险因子，这2种身体状况增加了跌倒的风险。尽管90%以上的髋骨骨折与跌倒相关，但tHcy似乎与再次跌倒没有关系，并且以前的研究中用简易精神状况检查测量的认知功能不能解释tHcy与骨折间的关联。同样地，我们发现在参加第二次体检的对象中，tHcy与骨折间的关联不受认知功能的影响（1997-1999年用KOLT测量）。
    肾小球滤过率下降升高了tHcy水平，并且肾衰与骨折风险增加有关。然而，没有证据表明年龄相关的肾小球滤过率下降与BMD或骨折有独立的相关性；事实上，仅晚期肾病患者骨折风险增加。排除自述肾病的参与者没有改变我们的结果，并且将肌酐水平（1997-1999年测定）加入模型增强了血浆tHcy水平与骨折的关联。
    低雌激素水平可能是女性骨质疏松和高同型半胱氨酸血症共同的决定因子。即使我们调整了雌激素补充剂的使用，我们仍不能排除本研究中内源性雌激素可能的混杂效应。
    假如tHcy水平中度升高与骨质疏松性骨折有因果关系，则其公共卫生意义巨大，因为血浆tHcy水平很容易通过补充B族维生素降低。随机试验将有希望阐明同型半胱氨酸对骨质疏松的作用及补充B族维生素预防的现实意义。
    本前瞻性观察性研究结果表明，血浆tHcy水平与髋骨骨折风险有强关联，尤其在女性人群中。低血浆叶酸也与女性骨折风险增加有关。这些观察结合越来越多的同型半胱氨酸对骨代谢作用的实验室证据进一步确证了同型半胱氨酸在骨质疏松性骨折发病机制中起作用的假设。