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稳定同位素技术及其在钙营养相关研究中的应用

稳定同位素技术及其在钙营养相关研究中的应用
Application of Stable Isotope Techniques in Calcium Nutrition

何国鹏综述苏宜香审校

（中山大学公共卫生学院营养系，广州510080）

摘要：近年来，随着稳定同位素技术的发展，其在钙营养相关研究中得到了较广泛的应用，尤其多用于儿童青少年、孕妇和乳母的钙营养研究中。本文对稳定同位素技术及其在钙营养研究中应用的相关文献进行了综述。
    足够的钙摄入对于维持机体健康及预防疾病如骨质疏松症是非常重要的，这不仅因为钙是骨骼和牙齿的主要构成成分，参与骨代谢\[1\]，而且其在维持机体多种组织细胞和生物大分子的正常功能方面也发挥着重要作用\[2\]。长期以来，钙营养相关研究多是通过传统的平衡试验来进行，然而这种试验由于研究时间太长通常不易为人们所接受，这种情况在儿童中尤为明显\[3,4\]；此外，平衡试验不能区分未吸收钙和内源性分泌钙，故只能计算钙的表观吸收率，不能进行钙动力学研究，也很难评价营养素间的相互作用。近年来的研究发现，在钙需要量增加的特殊生理时期如生长期、孕期和哺乳期，机体对钙的吸收和代谢会发生一系列生理变化\[4~6\]，而这一系列变化间的相互关系用传统的平衡技术已经难以解释。上个世纪40年代，放射性同位素钙（45Ca和47Ca）开始被广泛地应用于成人钙的吸收和代谢研究中\[7\]，但是由于其存在潜在的安全性和伦理问题，故这种方法极少用于儿童和孕妇的研究。稳定同位素技术诞生后，由于其方法安全、准确并且相对简单，近年来在钙的吸收和代谢研究中逐渐得到了应用，尤其在特殊生理人群（儿童、孕妇和乳母）的钙吸收和代谢研究中更是成为首选的方法\[3\]。本文介绍了近年来稳定同位素技术及其在钙营养相关研究中的应用情况，同时对其在以后研究中的应用方向作了展望。

1.稳定同位素技术

1.1 稳定同位素种类的选择

    稳定同位素是自然界存在的、无放射性的同位素。纯化的钙稳定同位素在人类研究中使用是安全的\[8\]。已知钙在自然界中有40Ca、42Ca、43Ca、44Ca、46Ca、48Ca 6种稳定同位素,它们在自然界中存在的天然丰度(相对含量)是恒定的,分别为961941%、01647%、01135%、21086%、01004%、01187%\[7\]。由于稳定同位素具有不同的天然丰度（噪声水平），因此为了获得相同水平的信噪比（△%，△%＝（Ca样品－Ca自然）/Ca自然），试验所使用稳定同位素的剂量（信号）应与其天然丰度相平行。由于40Ca的天然丰度很大，所以在稳定同位素技术中极少使用。其余五种都可以用于稳定同位素技术。在具体选择使用何种稳定同位素进行试验时，应从三个方面来考虑\[9\]：首先，静脉给予的稳定同位素剂量不应该影响机体的钙平衡。44Ca的天然丰度比较大，使用时的剂量也相对较高（通常10mg以上），因此不用于静脉注射。其余四种则口服或静脉注射均可。其次还要考虑质谱仪能否检测稳定同位素及其检测的准确度，因为一些质谱仪是不能准确地检测46Ca或48Ca的。最后还要考虑同位素的价格。

1.2 稳定同位素剂量的选择

    使用稳定同位素技术时，有一些因素会影响所使用同位素的剂量，其中最重要的是总的可交换钙池的大小（TEP）。TEP包括血浆、细胞外液和代谢活性骨中的钙，其大小与骨代谢率呈正相关。由于稀释效应，所使用的稳定同位素剂量应随着TEP的大小而呈线性增减。例如，对一个TEP为6g总钙的个体来说，要获得5%的信噪比，需静脉注射195mg42Ca、04mg 43Ca、624mg 44Ca、00096mg 46Ca或054mg 48Ca，TEP增大一倍，剂量相应增加一倍\[9\]。给予同位素后样品的收集时间由于稀释效应同样会影响同位素的剂量。另外一个影响因素是质谱仪的精确度。可检测稳定同位素的最小量与质谱仪的精确度成反比。最小的可检测信噪比可以按照检测时变异系数（CV）的3倍来估算。例如，测定42Ca\\43Ca值时的CV是05%，那么样品中其最小可检测信噪比最小应该是15%\[9\]。此外，小肠吸收率也是一个影响因素，吸收率越高，所需的稳定同位素剂量越小，这在做不同年龄或生理状态人群的钙研究时应予以考虑。

1.3 稳定同位素技术的分类

    稳定同位素技术根据使用稳定同位素钙的数量又可分为单稳定同位素技术、双稳定同位素技术和三稳定同位素技术3种。单稳定同位素技术是给受试者口服一种同位素钙，然后收集其粪便直到所有未吸收的口服同位素钙完全回收为止。然后根据口服的剂量和粪便中回收的量来计算钙的吸收率。这种方法的优点是计算出的吸收率不包括内源性分泌钙，比平衡法更能真实地反应膳食钙的吸收，此外这种方法不要求静脉注射同位素；其缺点是收集粪便时间较长，准确率会因此而收到影响\[3\]。双稳定同位素技术是将待测钙源用一种稳定同位素钙标记后,让受试者以口服方式摄入,然后静脉注射另一种稳定同位素钙。口服后吸收入血的同位素钙与静脉注射的同位素及机体本身的钙共同进入中央混合钙池。假定静脉注射同位素钙100%吸收且标记的同位素钙能与食物中普通钙发生完全交换,并以相同的比例被吸收和代谢\[10\]，那么一定时间后,它们在体内将达到完全的代谢平衡。由此,可以根据代谢样品如尿中的排出量、血中浓度甚至乳汁中浓度来推算钙吸收率或进行钙动力学研究\[7\]。   这种方法的优点是准确度高，收集样品的时间较短。三稳定同位素技术是让受试者同时口服两种不同的稳定同位素钙，然后静脉给予另一种稳定同位素钙。比如，口服46Ca和48Ca，静脉给予42Ca。这种方法适用于比较两种类型钙源的吸收率，但其数据解释比较复杂，因此较为少用，研究者一般更倾向于使用双稳定同位素技术对两种钙源吸收率分别进行评价，两次评价试验之间安排一定时间的洗脱期\[8\]。

1.4 稳定同位素技术的优缺点

    与放射性同位素技术相比，稳定同位素技术不具有放射性，适于孕妇、乳母和儿童的研究，对于成人则可进行多次测定；与经典的钙平衡试验相比，稳定同位素技术不受肠道排泄不全或者排空时间变异及尿量等因素的影响，准确度高，收集代谢样品的时间较短,既节约了成本也简化了操作。其缺点是稳定性同位素的检测要求有特殊的仪器设备,同位素价格也较高,只能用于研究工作\[7\]。

2.稳定同位素技术在钙营养相关研究中的应用

2.1 测定钙吸收率

    测定钙吸收率的方法主要有药代动力学法、尿增量法、钙平衡法及同位素法。目前，研究中应用最广的是双稳定同位素法\[7\]。Beck的研究表明双稳定同位素法是测定食物钙吸收率的可靠方法\[10\]。这种方法可以测定机体内源性分泌粪钙，故其测定出的吸收率是真钙吸收率（TFCA）,因而被认为是测定钙吸收率的最佳选择，已被国际营养专家组确定为测定活体钙生物利用率的金标准\[11\]。
    健康机体对钙的吸收会受到年龄、生理状态及遗传等因素的影响，因此目前对于健康个体钙吸收研究的重点也主要围绕这些方面展开的。近年来，许多研究应用双稳定同位素法对青春期前儿童、青春期青少年的钙吸收率进行了测定\[4,12~14\]，结果显示，在生长期钙的吸收率明显增高，并在11~12岁时达到最高值\[4\]。对孕妇和乳母钙吸收的研究显示\[6,15,16\]，孕期钙吸收率大约是孕前的两倍，而哺乳期妇女的钙吸收率并不增加\[6\]。MoserVeillon等用44Ca口服，42Ca静脉注射的双稳定同位素法研究发现产后哺乳与不哺乳妇女其钙吸收率无显著差异，而且通过乳汁中稳定同位素的量确定的钙吸收率与通过血清和尿液中稳定同位素量确定的钙吸收率一致\[15\]。由于钙吸收受雌激素的影响\[17\]，因此对老年个体钙吸收的研究多集中在围绝经期妇女和绝经后妇女中。这一时期的妇女由于卵巢功能下降，内分泌紊乱及雌激素水平降低，其对钙的吸收通常都是降低的\[18,19\]。随着分子生物学的进展，近来将稳定同位素技术与分子生物学技术相结合来评价基因对钙吸收影响的研究增多，特别是维生素D受体（VDR）基因多态性对钙吸收的影响，已有研究发现VDR转录起始位置Fok1基因多态性与钙吸收显著相关\[20,21\]。关于遗传因素对钙吸收影响的研究逐渐成为目前稳定同位素技术应用的一个新领域。

2.2 确定钙的需要量

    钙的需要量由于受种族、膳食习惯和评价标准等因素的影响，故目前世界上不同国家确定的钙需要量差别很大\[22\]。1997年，美国医学学会将钙需要量定义为：能够获得理想的骨钙储留量、骨质质量或以后生活中最小的骨折发病率所需要的钙摄入量\[11\]。确定钙需要量的方法一般有3种：因素加算法、骨质测定法和平衡法。因素加算法是基于生长期的骨钙增加、骨量维持、生殖需要和必要的钙损失（尿钙排出、皮肤钙丢失和粪钙丢失），进而确定钙的需要量\[22\]。这种方法存在的问题是其所用的钙吸收率数据均来自对白种人的研究\[23\]，不适于其它种族。近期随着骨质精确测定技术，如双能X线骨密度测定仪的应用，使钙需要量可以直接使用骨质含量或密度以及其改变值为评价指标。然而由于这种方法研究时间太长（通常两年以上），同时钙摄入量和骨质指标之间的相关性较差，用钙摄入量与骨质变化的回归方程所计算出来的钙需要量的95%可信区间很大，所以骨质测定法难以精确确定钙需要量的范围\[11\]。另一种是平衡法。经典的平衡法是将摄入钙与排出钙达到零平衡时的钙摄入量确定为钙需要量。这种方法没有考虑机体对钙的适应性，精确度也不高。此后又提出了改良的平衡法。改良的平衡法是先给予一定时间、一定剂量钙的适应期，然后进行平衡试验，最后建立钙摄入和钙储留的关系模型，从而得到钙需要量\[22\]。现在所说的钙平衡法一般指后者。
近年来，随着稳定同位素技术在钙吸收和代谢研究中的应用，使测定钙平衡的精度得到较大幅度的提高；同时由于该法简便省时，所以可以将稳定同位素技术和钙平衡试验相结合来确定钙需要量\[9\]。这种研究是在平衡试验的基础上，使用双稳定同位素技术来评价钙吸收和钙储留情况，然后使用线性及非线性回归模型\[11,24\]来描述钙摄入量和储留量之间的关系，从而估计钙的需要量。这种将稳定同位素技术与平衡试验结合的方法不仅准确度高，而且省时省力，也能够比较真实反映机体的钙平衡。目前，虽然该方法受到同位素价格太高，检测方法复杂的限制，但其仍是今后确定钙需要量的最佳方法。此外有关专家认为钙平衡技术与骨质测量技术同为确定钙需要量的主要手段\[11\]，因此，将稳定同位素技术，钙平衡试验及骨质测量技术相结合可能会成为未来评价钙需要量方法的发展方向。

2.3 钙代谢动力学研究

    钙代谢动力学是从速率论的观点出发，用数学模型分析和研究钙在体内吸收、分布、代谢和排泄的过程及其动力学的规律。稳定同位素技术不仅可以简便准确地测定钙的吸收率，同时还可建立钙代谢动力学模型来进一步阐明钙被机体吸收后的分布和利用情况\[9\]。应用稳定同位素技术进行钙代谢动力学研究时，要求在受试者口服和静脉给予稳定同位素后，收集其在6，12，20，30，45，60，120，180，240，480min的血清样（05ml）和5~6d现场尿样（不少于2次/天）。然后测定样品中稳定同位素的丰度。最后用房室模型对钙动力学过程作出解释\[3\]。Wastney等进行的试验\[13\]就是一个典型的应用稳定同位素钙（42Ca和44Ca）进行钙代谢动力学的研究。近年来，应用稳定同位素法进行的钙动力学研究已经发现骨钙的沉积率和清除率与可交换的骨钙池大小密切相关\[4\],当机体摄入钙在一定范围内增加时，机体对钙的储留量也增加\[14\]。一项研究还比较了不同种族女童的钙代谢动力学差异\[12\]。另有研究表明患有囊性纤维变性的青春期女孩的骨钙沉积率低于同龄健康女孩\[25\]。目前，钙缺乏问题在世界各国均十分普遍，迫切需要制定科学的钙需要量，而确定科学的钙需要量要求有大量准确的钙代谢动力学数据。因此可以预计，稳定同位素技术在这一领域的应用将会越来越多。

2.4 评价影响钙吸收和代谢的因素

    机体对钙的吸收和代谢受到多种因素的影响，科学地评价这些因素的作用对于合理膳食，科学补钙及预防疾病有着重要意义。由于稳定同位素技术在测定钙吸收和代谢方面的广泛应用，所以目前研究影响钙吸收和代谢因素的试验中，稳定同位素技术的使用也较为普遍\[17,18\]。近年来，使用稳定同位素技术研究影响钙吸收和代谢最多的是膳食因素，如蛋白质对钙吸收的影响\[26\]，低聚糖对绝经后妇女钙吸收的影响\[19\]。此外还有一些试验研究体力活动和疾病对钙吸收和代谢的影响\[18,25\]。另外有报道称使用多种元素的稳定同位素可以用来直接评价补充多种元素后这些元素的生物利用情况及相互作用\[3\]。
    综上所述，随着稳定同位素技术的日益成熟，在人类钙吸收和代谢研究中，已经由使用放射性同位素逐步转向使用稳定同位素，不过，目前其在钙营养相关研究中的应用仍是一个相对较新的领域。此外，由于目前在钙生物利用的相关基因确定方面取得了较大进展，这可能会为稳定同位素技术开辟一个新的重要的应用领域。我国在使用稳定同位素技术进行钙营养研究方面才刚刚起步，这类研究也较少，目前仅在香港和北京等少数地区开展。但是，随着我国社会逐渐向老龄化发展，准确确定国人钙吸收和代谢的相关数据，进而制定出适合各个人群的钙膳食推荐摄入量（DRIs）是提高国民健康水平的迫切任务，因此可以预计稳定同位素技术在我国的应用前景是非常广阔的。不过可以肯定的是这种方法相对昂贵的价格和复杂的检测技术将会成为近几年其在钙营养相关研究领域发展的主要制约因素，其广泛的应用到研究中还有待时日。

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