摘要：目的 探讨孕期膳食对子代肥胖和肥胖相关基因脂肪酸合成酶（FAS）和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）表达的影响。方法 将Wistar孕鼠随机分为2组，分别食用标准饲料和高蛋白质饲料。所产雄性子代分别为对照组（CON）和高蛋白组（HP）。交叉哺乳，断乳后用标准饲料喂养至成年时，从对照组中随机抽取一部分大鼠为高脂对照组（HFCON），HFCON与HP组的大鼠均喂饲高脂饲料，高脂诱导肥胖至实验结束。分期处死大鼠取材，应用荧光定量PCR法检测褐色脂肪中FAS及PEPCK mRNA的表达丰度。结果 孕期高蛋白质饲料可降低子代断乳及高脂诱导肥胖后的体重及肥胖率（P<0.05）；HP组褐色脂肪组织中PEPCK mRNA的表达持续低于CON和HFCON组，而FAS mRNA 在诱导肥胖前、后分别低于CON和HFCON组；结论 孕期适当增加蛋白质摄入，可通过程序性降低子代FAS和PEPCK基因的表达，预防子代成年高脂诱导肥胖的发生。

关键词：肥胖  脂肪酸合成酶  磷酸烯醇丙酮酸羧激酶

中图分类号：                   文献标识码：A

 

Abstract: Objective  To investigate the effects of maternal nutritional manipulation on fetal mRNA abundance of fatty acid synthetase (FAS)and phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK)，and find out an optimal maternal diet and targets for pharmacological prevention and treatment of obesity. Methods  Wistar pregnant rats were fed a standard diet (SD) and a high protein diet (HPD) during pregnancy, respectively. Their male offspring were assigned to two groups of control (CON) and high protein group (HP) in accordance with the diets of their dams. Offspring were cross-fostered and fed with SD after weaning. At adult, some offspring randomly selected from CON group, namely as high fat control (HFCON), HFCON and HP group rats were fed with high–fat diet (HFD) to induce obesity. At different stages, tissue was collected for analyzing abundance of FAS and PEPCK mRNA by fluorescent quantitation PCR. Results  In HP, body weight and obesity rates were decreased after weaning and HFD (P<0.05). The abundance of PEPCK mRNA was persistently decreased in HP, and the abundance of FAS mRNA in HP was down-regulated before and after HFD vs. CON or HFCON. Conclusion  Reasonably increasing the protein intake during pregnancy can, by decreasing the expression of FAS and PEPCK mRNA, prevent offspring from HFD-induced obesity in adult.

Key words: obesity, fatty acid synthetase, phosphoenolpyruvate carboxykinase

 

肥胖是环境与遗传因素相互作用的结果。而孕期营养是宫内的主要环境因素，营养的改变可以导致组织结构、功能、代谢的改变，并产生“记忆”，持续影响胎儿成年肥胖的形成。因此，孕期饮食较成年饮食与基因的相互作用对肥胖的发生、发展具有更重要的意义。随着“代谢程序化”及“营养程序化”等理论的提出，生命早期营养对成年慢性病影响的研究成为近年研究的热点。

目前，国际上这方面的研究大多集中在生命早期能量摄入水平或某种营养素缺乏上，关于生命早期不同营养素过量的研究很少。而且许多研究证明高蛋白膳食可以降低体脂含量。针对这种现状，我们从孕鼠入手，动态观察孕期高蛋白饲料对后代体重、脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，FAS）和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）mRNA表达的影响，探讨生命早期不同膳食构成程序性影响肥胖和肥胖相关基因的机制，为寻找防治肥胖的靶标及合理的孕期膳食提供依据。

 

1.1.1 实验动物分组  180只SPF级Wistar近交系雌鼠和90只雄鼠（购于上海斯莱克实验动物有限公司）交配，阴道分泌物涂片镜检，共检出120只孕鼠。于检出当日，按体重将孕鼠随机分为2组，分别饲以标准饲料和高蛋白饲料，21天自然分娩。标准饲料和高蛋白饲料孕鼠的雄性后代分别为对照组（CON）和高蛋白质组（HP）。为将饮食干预控制在出生前，子鼠均由标准饲料大鼠哺乳3周，断乳后2组雄鼠均食用标准饲料至出生后第8周，从对照组中随机抽取一部分大鼠为高脂对照组（HFCON），HFCON与HP组的大鼠均喂饲高脂饲料诱导肥胖至实验结束(14周)。大鼠肥胖的判定：实验结束时体重≥实验结束时CON组体重均值+2倍标准差（x+2s）。

1.1.2 指标检测  分别在大鼠出生、断乳、高脂诱导肥胖前后各处死1批大鼠，前3个阶段每组各10只大鼠，第4个阶段CON组10只，HP和HFCON组分别30只大鼠。取肩胛间褐色脂肪检测FAS和PEPCK mRNA的丰度。

1.1.3 指标计算  肥胖率（%）＝每组大鼠肥胖数/该组大鼠总数×100%。基因相对含量=未知基因mRNA浓度/β-actin mRNA浓度。

采用实验室合成饲料，各种饲料配方的主要成分见表1。标准饲料配方参考美国农业部人类营养研究中心推荐的实验动物饲料配方AIN-93G配制。添加猪油，减少大豆油和碳水化合物含量配制出高脂饲料，用于成年后饮食诱导肥胖。综合Lacroix 等^[1]和 Natalie等^[2]的文献报道，添加干酪素，减少碳水化合物含量，配制出高蛋白饲料。

饲料构成	干酪素	脂肪	碳水化合物	矿物质	维生素
标准饲料	20.54	7.00	66.76	3.50	1.00
高蛋白质饲料	35.94	7.00	51.35	3.50	1.00
高脂饲料	19.02	18.00	56.78	3.50	1.00

采用荧光定量聚合酶链反应（fluorescent quantitation polymerase chain reaction，FQ-PCR）两步法。在ABI Prism 7500 Fast Real-Time PCR System上进行PCR扩增。扩增体系20μl。扩增条件：95℃、10s，1个循环；95℃、5s，FAS 60℃、30s（PEPCK 58℃，β-actin 54℃），40个循环。引物和探针序列见表2。

名称	基因序列	Gene bank
FAS-F FAS-R FAS-P	5’-TCTCTGGTGGTGTCTACATTTCG -3’ 5’- GCAGGATAGCACTCTCAGACAG -3’ 5’-(FAM) ACAACAGCAACCTCACGGCGGCAG (TAMRA)-3’	NM_017332
PEPCK-F PEPCK-R PEPCK-P	5’-GAACTCACTGCTTGGGAAGAAATG -3’ 5' -GGTTAGTTATGCCCAGGATCAGC-3’ 5’-(FAM) TCCGCCAGCCACCCTTCCTCCTT (TAMRA)-3’	NM_198780
β- actin-F β- actin-R β- actin-P	5’-AGGGAAATCGTGCGTGAC -3’ 5’-CGCTCATTGCCGATAGTG -3’ 5’-(FAM)CTGTGCTATGTTGCCCTAGACTTC (TAMRA)-3’	NM_031144

输入标准品浓度，绘制标准曲线，计算并输出PEPCK和FAS mRNA浓度。

采用SPSS 13.0统计软件处理数据，组间均值比较运用方差分析处理，率的比较用X²检验处理。

 

如表3所示，各组大鼠出生体重无差异（P>0.05）。在断乳和高脂诱导肥胖后，HP组大鼠的体重分别低于CON和HFCON组的体重（P<0.05）；在高脂诱导肥胖后，HP组大鼠的肥胖率较HFCON组明显降低（P<0.05）。说明孕期高蛋白饲料可以降低子代高脂诱导肥胖的发生。

分组	体重(g)				肥胖率
	1天	3周	8周	14周	（%）
对照组	6.3±0.3	39.0±2.5	180.9±10.0	304.5±6.7	0.00
高脂对照组				325.2±14.0	70.00
高蛋白组	6.0±0.2	36.8±4.1（1）	173.6±13.6	305.9±22.2（2）	33.33(2)

注：（1）与对照组比较P<0.05，（2）与高脂对照组比较P<0.05

由图1可见大鼠褐色脂肪组织中的FAS基因在出生和断乳时表达水平较低，断乳后摄入标准饲料后FAS mRNA的表达迅速增加。在高脂诱导肥胖前、后，HP组FAS基因的表达分别低于CON和HFCON组，说明孕期高蛋白饲料可抑制子代FAS基因的表达，减少脂肪沉积。

 

 

 

由图2可见从出生到成年高脂诱导肥胖前，HP组大鼠的褐色脂肪组织中PEPCK基因的表达持续低于CON组，高脂诱导肥胖后HP组大鼠的PEPCK基因的表达较HFCON组明显降低，说明孕期高蛋白饲料可持续抑制子代PEPCK基因的表达，从而减少甘油异生和糖异生而降低脂肪积聚。

 

 

 

营养素是孕期的主要宫内环境因素，宫内营养会影响胎儿成年后患肥胖等慢性病的风险。有文献报道孕期不同膳食成分会影响胎儿的生长发育^[3]。动物实验证明孕期低蛋白饲料不但可以降低出生体重，而且会增加日后体脂的沉积^[4]。但孕期高蛋白饲料对子代的作用尚有争议。ZHANG等报道孕期和哺乳期食用高蛋白饲料可以降低成年雌性后代肝脏TG的含量^[5]。本课题中HP组的大鼠在断乳时和高脂诱导肥胖后的体重及肥胖率均低于对照组的大鼠。说明孕期高蛋白饲料可以影响胎儿的代谢，并持续影响成年后肥胖的发生。这进一步说明生命早期营养干预具有重要的意义。

许多研究证实膳食因素可直接或间接调节基因表达^[6,7]。FAS是脂肪从头合成的关键酶，是体内调节能量消耗和储存的重要位点之一。GIRARD等研究发现，哺乳期间小鼠脂肪组织内的FAS表达水平极低，断乳后喂饲高碳水化合物、低脂肪饲料时，FAS的合成加速，活性增强，机体脂肪合成能力迅速增加^[8]。本课题中FAS的表达趋势与文献报道一致，说明脂肪摄入较多时（母乳）脂肪从头合成较少，而当摄入标准饲料时，FAS基因被激活，脂肪从头合成增加。DIRAISON报道FAS基因的表达降低，会减少细胞内TG的含量^[9]。同时有一研究发现，FAS的表达增加可以增加脂肪的积聚而发展为肥胖^[10]。本课题研究发现HP组褐色脂肪中FAS在高脂诱导肥胖前、后的表达水平均低于对照组，说明孕期高蛋白饲料可通过降低子代脂肪合成而减少子代高脂诱导肥胖的发生。PEPCK不仅是糖异生的关键酶，也是甘油异生的关键酶，它与FAS一样可导致体内储存的脂肪增加。转基因小鼠实验显示PEPCK活性的慢性增加能增强糖异生和FFA的再酯化作用^[11]。本研究中HP组的PEPCK基因表达持续低于对照组，说明HP组的大鼠可以通过降低糖异生和甘油异生而降低高脂诱导肥胖的发生。

综上所述，孕期适当增加蛋白质摄入可使子代FAS和PEPCK基因的表达降低，进而预防子代成年肥胖等慢性病的发生。因而FAS和PEPCK可作为防治肥胖的候选基因。关于生命早期不同膳食成分影响肥胖基因谱的机制还有待于更深入的研究。

 

1           LACROIX M, GAUDICHON C, MARTIN A, et al. A long-term high-protein diet markedly reduces adipose tissue without major side effects in Wistar male rats [J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2004, 287: 934 - 942.

2           LUSCOMBE-MARSH N D, NOAKES M, WITTERT G A, et al. Carbohydrate-restricted diets high in either monounsaturated fat or protein are equally effective at promoting fat loss and improving blood lipids [J]. Am J Clin Nutr, 2005, 81: 762-772.

3           MOORE V M, DAVIES M J, WILLSON K J, et al. Dietary composition of pregnant women is related to size of the baby at birth[J]. J Nutr, 2004, 134: 1820-1826.

4           MALONEY C A, GOSBY A K, PHUYAL J L, et al. Site-specific changes in the expression of fat-partitioning genes in weanling rats exposed to a low-protein diet in uteri[J]. Obes Res, 2003, 11: 461-468.

5           ZHANG Junlong, WANG Chunli, PAUL L, et al. A high-unsaturated-fat, high-protein, and low-carbohydrate diet during pregnancy and lactation modulates hepatic lipid metabolism in female adult offspring [J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2005, 288: R112–R118.

6           IKENASIO-THORPE B A, BREIER B H, VICKERS M H, et al. Prenatal influences on susceptibility to diet-induced obesity are mediated by altered neuroendocrine gene expression [J]. J Endocrinol, 2007, 193:31-37.

7           MILLWARD C A, HEANEY J D, SINASAC D S, et al. Mice with a deletion in the gene for CCAAT/enhancer-binding protein ß are protected against diet-induced obesity [J]. Diabetes, 2007, 56:161-167.

8           GIRARD J,PERDEREAU D,FOUFELLE F,et al. Regulation of lipogenic enzyme gene expression by nutrients and hormones [J].FASEB, 1994, 8:36-42.

9         DIRAISON F, PARTON L, FERRE P, et al. Over-expression of sterol-regulatory-element-binding protein-1c (SREBP1c) in rat pancreatic islets induces lipogenesis and decreases glucose stimulated insulin release:modulation by 5-aminoimidazole- 4-carboxamide ribonucleoside (AICAR) [J]. Biochem J, 2004, 378:769-778.

10       BERNDT J, KOVACS P, RUSCHKE K, et al. Fatty acid synthase gene expression in human adipose tissue: association with obesity and type 2 diabetes[J]. Diabetologia, 2007, 50(7):1472-1480.

11       FRANCKHAUSER S, MUNOZ S, PUJOL A, et al. Increased fatty acid re-esterification by PEPCK over expression in adipose tissue leads to obesity without insulin resistance [J].Diabetes,2002,51: 624-630.

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