青年科学工作者论坛2009年第3期

钟凯 何庆华 吴永宁[1]

中国疾病预防控制中心营养与食品安全所，北京  100021

 

摘要：目的  通过分析ATCC33222在不同培养环境下的生长曲线和pH值曲线的差异，探讨该菌的生长规律，并为产生物胺乳酸菌的代谢组学研究提供合理的采样策略。方法  配制不同成分、不同pH值的培养基，分别进行菌株培养，每1~4小时取样一次并测定OD₆₀₀和pH值，获得生长曲线和pH值变化曲线。结果  乳酸菌ATCC33222菌株在不同培养条件下呈现不同的生长特性，其中pH3.5和添加壳寡糖的培养基的迟滞期较长，添加葡萄糖的培养基指数生长期时间最长。MRS培养基、添加葡萄糖的培养基和添加壳寡糖的培养基pH值曲线类似，其余3种培养基的pH值曲线各不相同。结论  ATCC33222菌株可能根据生长环境和能量来源的不同，动态调节不同代谢途径，以获得最佳生长状态。在代谢组学研究中，培养基pH值推荐使用pH3.5和pH6.5两种，MRS培养基中可添加氨基酸成分，而葡萄糖成分则不是必须的。pH5.4~5.9可能对乳酸菌有重要意义，代谢组学研究时应予以关注。

关键词：乳酸菌  代谢组学  采样

中图分类号：                        文献标识码：A

 

ZHONG Kai, HE Qinghua, WU Yongning

Institute of Nutrition and Food Safety, Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100050,China

 

Abstract Objectives: sampling strategy for metabolomic studies of ATCC33222 was discussed according to its grown patterns under six different media. Methods: six media with different ingredients or pH value were prepared and ATCC33222 strain cultures were harvested from each medium. Culture samples were collected every 1-4 hours and OD₆₀₀ and pH values were determined thereafter. Growth curves and pH curves were constructed according to these data. Results: Growth curves were different between ATCC33222 strain cultures. MRS+aa pH3.5 and MRS+aa+COS media showed longer lag phase, medium with additional glucose had the longest log phase, MRS+aa under pH6.5 and 5.0 media showed shorter stationary phase. MRS, MRS+aa+glucose and MRS+aa+COS had similar pH curves while the other three pH curves were different from each other. Conclusions: ATCC33222 strain may have the ability of dynamic metabolic regulation to accommodate different culture environment or energy source. In metabolomic studies, pH3.5 and pH6.5 were recommend for culture condition. Amino acids could be used as ingredient in MRS while glucose was only optional. pH5.4-5.9 could be important for lactic acid bacteria metabolomic studies.

Key words: lactobacillus  metabolomics  sampling

 

乳酸菌广泛存在与自然界，是一种常用的工业用菌，在乳制品、发酵食品、酒类、青贮饲料中的应用非常广泛。乳酸菌发酵可赋予食品特殊风味和质地，但某些乳酸菌产生的生物胺不仅影响产品品质，还可能对人或畜禽的健康产生负面影响^[1~4]，因此其产生物胺的机理以及采取何种工艺措施控制乳酸菌生长与代谢成为很多研究者关注的问题。由于ATCC33222菌株具有3种脱羧酶活性，因此常被用于乳酸菌产生物胺的机理研究，在基因组和蛋白组学层面已有相关探索，但尚未进行代谢组学研究。本文研究了该菌株不同培养条件下生长特性的差异，探讨了乳酸菌代谢组学研究的采样策略，为后续的组学研究提供了一定的参考依据。

 

乳酸杆菌属30a菌株（Lactobacillus sp. 30a，ATCC33222，分离自马胃）为产生物胺的模式菌株，已知其能产生组胺、尸胺和腐胺^[5,6]。

培养基1（MRS pH6.5）为MRS培养基，以52g/L浓度将MRS干粉溶解于蒸馏水中，调节pH值为6.5。培养基2（MRS+aa pH6.5）为MRS培养基中添加10g/L的组氨酸、赖氨酸和鸟氨酸以及1g/L的酪氨酸，调节pH值为6.5。培养基3（MRS+aa+glu pH6.5）为培养基2中添加20g/L的葡萄糖，调节pH值为6.5。培养基4（MRS+aa pH3.5）和5（MRS+aa pH5.0）分别为培养基2调节pH值为3.5和5.0。培养基6（MRS+aa+COS pH6.5）为培养基2中添加0.5g/L的壳寡糖（COS），调节pH值为6.5。调节pH值的试剂为1mol/L氢氧化钠和1mol/L盐酸，以上所有培养基均在121℃，高压灭菌15min备用。

MRS肉汤培养基（英国OXOID），组氨酸（美国Sigma），赖氨酸、鸟氨酸、酪氨酸、壳寡糖和葡萄糖等（上海生工）。

全自动预真空高压灭菌锅（西班牙SELECTA CJ.P.SELECTA）；低温培养箱（德国MMM）；酸度计（意大利HANNA）；分光光度计（德国Eppendorf）；生物安全柜（美国LABCONCO）；分析天平（德国Sartorius）；BX51显微镜（日本OLYMPUS）；漩涡振荡器（江苏其林贝尔）；全自动回旋接种仪（英国DON whitley）。

ATCC33222菌株在MRS平板培养基上复苏，挑取单菌落接种至MRS肉汤培养基，之后每12h接种一次，连续接种2次后扩大培养作为种子液。种子液测定600nm吸光度值，并经螺旋涂布计数确定种子液浓度，再按照10⁶CFU/ml的接种量分别接种于100ml上述6种培养基，混匀并分装在10ml试管，每管5ml，每种培养基共计20管，置于37℃静置培养，每1~4h取1管置于4℃冰箱作为生长曲线的采样点（具体时间点见图表），培养结束后一起测定吸光度值（OD₆₀₀）和pH值。测定吸光度值时均以PBS为空白对照，样品浓度较大的可用PBS稀释后测定，结果乘以稀释倍数作为吸光度值。

在Microsoft Excel 2003中以时间为X轴，吸光度值和pH值为Y轴作图（双Y轴）。以生长曲线中相邻两点连线的斜率表征较晚时间点细菌增殖速度，其中负值表示细菌衰亡。

 

不同培养条件下的生长曲线和pH值曲线的相互关系如图1所示，ATCC33222呈现出不同的生长模式，pH值曲线表现出明显差异。

 

 

 

6种培养基下ATCC33222生长曲线特征如表1所示，其中各生长阶段的时间点根据生长曲线判断。

培养基	迟滞期 时间(h)	指数期 时间(h)	静止期 起点(h)	衰亡期 起点(h)	最大斜率时间点 (h)	OD 峰值	OD峰值 时间点(h)
1	3	12	15	-	10.5	3.48	27.5
2	3	13.5	16.5	18	12	3.82	18
3	3	28	31	-	12	4.25	34.5
4	13.5	10.5	24	-	19.5	5.76	30.5
5	3	12	15	18	10.5	5.14	18
6	6	14	20	-	18	5.31	32.5

注：“-”表示未出现或无法确定

从生长曲线看，MRS+aa+COS pH6.5的迟滞期明显延长，MRS+aa pH3.5的迟滞期则达到13.5h，而此时MRS pH6.5、MRS+aa pH6.5和MRS+aa pH5.0已接近静止期，其余4中培养基迟滞期无明显差异。除加糖培养基指数期维持时间达28小时，其余培养基均在12小时左右。MRS+aa pH6.5和MRS+aa pH5.0的静止期维持时间较短，其中MRS+aa pH6.5的静止期仅维持了2小时左右即进入衰亡期，MRS+aa pH5.0维持约7小时后进入衰亡期，其余培养基的时间终点均出现衰亡期迹象，但由于实验时间未能继续延长因此不能判定衰亡期出现的时间。从表征生长速率看，各培养基从指数期起点到最大生长时间点耗时大致在6-12小时，其中MRS+aa pH3.5为6小时，MRS+aa+COS pH6.5为12小时。MRS+aa pH6.5和MRS+aa pH5.0出现最大浓度的时间最早，其余4种培养基无明显差异。pH值曲线总体呈现出三种类型，MRS pH6.5、MRS+aa+glu pH6.5和MRS+aa+COS pH6.5均为缓慢下降的近似倒“S”形，这三种培养基pH值均为6.5；MRS+aa pH6.5为先降后升；两种低pH值培养基为先升后降。

 

本研究选取的培养基主要考虑到乳酸菌能量代谢、酸性环境、氨基酸底物对产生物胺乳酸菌的影响，同时引入添加壳寡糖的培养基，考察益生素在生物胺代谢中的作用。从生长曲线看，MRS+aa pH3.5和MRS+aa+COS pH6.5的迟滞期较长说明菌株对于低pH值和添加壳寡糖的培养基不适应。国外有研究也表明，低pH值下乳酸菌可能会采取聚团的方式抵御不良环境并降低代谢水平^[7]。壳寡糖作为益生素的一种，能被肠道乳酸菌利用并促进乳酸菌生长或产生有益的生物学效应^[8,9]。国内一项研究表明壳寡糖能与细胞体内带有负电荷的细胞质结合，扰乱细胞的正常生理活动，改变了细胞膜的选择透过性，从而抑制嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌生长繁殖^[10]，另一研究则认为壳寡糖能促进乳酸菌生长^[11]。生物效应的这种不一致性提示寡糖等益生素可能是通过打破固有菌群平衡发挥效应，而并非单纯的促进乳酸菌生长或抑制杂菌生长。MRS+aa pH6.5和MRS+aa pH5.0培养基在静止期维持的时间最短，原因很可能是因为菌株消耗氨基酸产生大量生物胺，而高浓度的生物胺使细胞加速死亡。

从pH值曲线看MRS pH6.5培养基缺乏氨基酸底物无法产生物胺，因此pH值呈单边下降。MRS+aa pH6.5培养基的pH值先降到5.41然后回升，可能是菌株优先利用葡萄糖作为能量来源，产生大量乳酸使得pH值下降，随着葡萄糖消耗殆尽菌株开始利用氨基酸脱羧供能并产生尸胺、腐胺和组胺。MRS+aa pH5.0培养基的pH值先升至5.88后逐步下降，可能是菌株首先利用氨基酸脱羧产生胺类物质中和培养基的酸性环境以达到最佳生长pH值，这些结果反映出该菌株可能会根据生长需要，动态调整糖酵解途径和脱羧途径的比例，但pH值更低的MRS+aa pH3.5培养基为何没有很快出现衰亡期还有待探讨。不过pH3.5的培养基的pH值与pH5.0培养基类似，先升至5.38然后逐步下降。这有可能提示，pH5.4~5.9对于ATCC33222菌株的生物胺代谢通路有着特殊意义。

对于代谢组学研究，理想的状态是对所有代谢物的实时监控，然而受技术手段的限制，目前只能对一些特征时间点进行采样分析。由于本实验中的pH值曲线实际上是培养基中乳酸等酸性代谢物和生物胺等碱性代谢物相互关系的表征，因此更应该注意培养过程中pH值曲线的变化。由图可见，生长曲线的拐点往往也出现pH值的拐点，因此对生长曲线拐点采样是必要的。当然我们应该注意到有些培养条件下两个曲线的不同步性，可通过增加采样点来追踪pH值的拐点。

两种低pH值培养基的生长曲线和pH值曲线的线形相似，只是在时相上有不同，可只选取其中之一进行研究。在不利条件下细菌如何调整到指数生长状态是值得关注的，因此在代谢组学研究中可以采集迟滞期终点的样本，考虑到pH3.5培养基有明显的迟滞期，可能更适合代谢组学分析。添加葡萄糖和氨基酸的培养基从生长曲线和pH值曲线看，与MRS培养基线形无明显不同而实验时间相应延长，因此可以考虑不采用这种培养基。MRS+aa pH6.5培养仅增加了0.5g/L壳寡糖就产生了明显的生长差异，代谢组学研究中值得关注。由于生物胺常常是在长期储存的食物中产生，因此可以适当延长培养时间使细菌进入衰亡期，模拟营养物质不足的环境。除收集培养上清进行代谢足迹研究，还可以收集相应时间点的细胞样本对胞内代谢物进行分析，从而全面了解生物胺的代谢与分布。

研究结果表明，乳酸菌ATCC33222对于不同培养环境具有一定的适应性调控机制，但这一结果不一定普遍适用。本实验的结果为乳酸菌产生物胺的代谢组学研究提供了采样策略的参考依据，文中的部分推论也需要通过代谢组学技术进一步证实。代谢组数据结合生长特性则可以对乳酸菌中生物胺产生、分布的机理给出科学的解释，从而为合理的工艺控制提供依据，减少食品中的生物胺污染。

 

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