青年科学工作者论坛2009年第4期
2型糖尿病患者血液3-硝基酪氨酸检测及其相关因素分析
王勃诗 刘英华 徐庆 王觐 于晓明 郭长江1 薛长勇2
解放军总医院营养科，北京100853 1
摘要：目的 观察2型糖尿病患者血清3-硝基酪氨酸水平及其相关因素分析。方法 按随机病例对照研究方法，招募确诊的2型糖尿病患者109例，非糖尿病对照病例57例。对研究对象进行人体测量、血生化指标检测和血清3-硝基酪氨酸（3-NT）水平测定，并分析3-NT的相关因素。结果 两组入选受试者的年龄、体重等指标均无显著性差异；糖尿病组血糖、糖化血清蛋白、总胆固醇、载脂蛋白C2（Apo C2）明显高于非糖尿病对照组(P<0.05)。糖尿病组3-NT水平明显高于非糖尿病对照组，且糖尿病组男性高于非糖尿病对照组男性、糖尿病组女性高于非糖尿病对照组女性(P<0.05)；BMI>28kg/m2糖尿病患者3-NT明显高于BMI<24 kg/m2糖尿病患者；空腹血糖＞6.1mmol/L糖尿病患者3-NT水平也高于空腹血糖≤6.1mmol/L糖尿病患者(P<0.05)；糖尿病组回归分析显示与3-NT线性相关性最大的因素依次为糖化血红蛋白、糖化血清蛋白、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。结论 糖尿病患者3-NT水平明显高于非糖尿病对照人群；3-NT水平与糖化血红蛋白、糖化血清蛋白、LDL-C等因素密切相关。
关键词：2型糖尿病；3-硝基酪氨酸；糖化血红蛋白；糖化血清蛋白；LDL-C
The investigation to the levels of 3-nitrotyrosine and its correlation factors in type 2 diabetic patients
wang Bo-shi1,2，LIU Ying-hua 1，XU Qing1，WANG Jin1，YU Xiao-ming1，GUO Chang-jiang2，XUE Chang-yong1﹡
（1Department of Nutrition, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853,China
2Institute of Hygiene and Environmental Medicine, Tianjin 300050,China）
【Abstract】 Objective To investigate levels of 3-nitrotyrosine, the end-product of nitrated proteins and its correlation factors in type 2 diabetic patients. Methods A randomized
case-control trial was carried out, in which 109 type 2 diabetic patients and 57 non-diabetics were enrolled. Anthropometric measurements, blood biochemical variables and 3-nitrotyrosine (3-NT) were measured. Results There are no significant differences between two groups in age, body weight. However, blood glucose, glucosylated serum protein (GSP), total cholesterol, apolipoproteinC2 in diabetic patient group were much higher than those in control group (p<0.05). 3-NT in blood was much higher in diabetic group than in non-diabetic group, and 3-NT was higher in both male and female diabetic subjects than in non-diabetic male and female subjects, respectively(p<0.05). In diabetic group, subjects with BMI>28kg/m2 had higher 3-NT level than those with BMI<24kg/m2. 3-NT in subjects with blood glucose greater than 6.1mmol/L was higher in those with glucose≤6.1mmol/L(p<0.05). The results of regression analysis in the
diabetic group showed that glucosylated hemoglobin (HbA1c), GSP, low density lipoprotein cholesterol（LDL-c）were the most correlated to 3-NT in blood. Conclusion Levels of 3-NT was increased more in diabetic group than in non-diabetic group. 3-NT was closely correlated to HbA1c, GSP, and LDL-c in diabetic patients.
Key words: type 2 diabetes; 3-nitrotyrosine; glycosylated hemoglobin; glucosylated serum protein; LDL-c
酪氨酸硝基化是指蛋白质分子中的酪氨酸残基被硝基化成3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine，3-NT）。酪氨酸硝基化作为一种蛋白质翻译后修饰，在病理状态下伴随活性氧和活性氮的增加而产生。近年来在许多疾病如动脉粥样硬化、缺血－再灌注损伤、神经退行性疾病、器官移植排斥等病变的相应组织蛋白中都可以检测到3-NT的存在[1, 2]。但是2型糖尿病患者蛋白质硝基化程度如何及其在糖尿病并发症中的作用没有确切的定论。本研究以2型糖尿病患者和非糖尿病患者为研究对象，观察两组人群血清3-NT水平的差异及其相关因素，为探讨抗硝基化干预和治疗糖尿病进而防止其并发症提供基础研究依据。
1材料与方法
1.1 研究对象
1.1.1 2型糖尿病组 筛选2007年3月～2007年9月在中国人民解放军总医院门诊确诊的2型糖尿病患者，以及社区招募到的2型糖尿病患者109例（男44例，女65例），年龄45～77岁，平均（60.14±7.12）岁。糖尿病诊断标准为空腹血浆葡萄糖≥7.0mmol/L或75g葡萄糖OGTT测定2小时血浆葡萄糖≥11.1mmol/L。其他条件包括：①年龄≥45周岁，汉族；②体质指数（BMI）≥18.5 kg/m2；③无严重肝、肾、胃病以及心血管等疾病，无急性和慢性感染性疾病，无糖尿病酮症酸中毒；④自愿参加本研究，并签署知情同意书。
1.1.2 对照组 为社区招募到的健康体检者57例（男42例，女15例），年龄35～73岁，平均（58.36±7.96）岁。明确排除2型糖尿病，一级亲属中无2型糖尿病患者。
1.2 研究方法
1.2.1 分组和观察指标 随机病例对照研究。将入选人群进行人体测量、血生化检测和血清3-NT水平的测定。人体测量指标包括身高、体重、BMI等；血生化指标包括空腹血糖、糖化血清蛋白、糖化血红蛋白、血浆胰岛素、血胆固醇、血甘油三酯和载脂蛋白。
1.2.2人体测量 人体测量采用TZ-1型身高体重秤和中体同方体育科技有限公司生产的BCA-2A人体成份分析仪测定。空腹血生化指标采用日立7600全自动生化分析仪。
1.3 3-NT检测：3-NT浓度检测采用ELISA试剂盒（ Hycult biotechnology bv， Lot#:5822k19），该试剂盒的检测范围是2~1500nmol/L。样本均为新鲜血清，稀释25倍。每个样品均设平行样，用酶标仪测量450nm吸收光值（A值）。
1.4统计方法：结果用均数±标准差表示，数据统计采用SPSS 13.0进行。两组之间比较采用t检验，单因素多水平资料采用方差分析，相关分析采用多元线性逐步回归方法。
2结果
2.1两组受试者一般情况
由于非糖尿病人群中符合入选标准的女性受试者较难募集，导致两组间身高和BMI有显著性差异，但是年龄、体重、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、Apo B、Apo C3等指标在糖尿病组和非糖尿病对照组间均无差异。糖尿病组的血糖、糖化血清蛋白、总胆固醇指标均高于非糖尿病组，糖尿病组血胰岛素水平低于非糖尿病组；糖尿病组女性apo A1较对照组女性高（表1）。
表1 受试者一般情况与血液生化
Table 1 Basic characteristics in diabetic and non-diabetic group
|
组别
|
年龄
（岁）
|
身高
(cm)
|
体重
（kg）
|
BMI
(kg/m2)
|
葡萄糖(mmol/L)
|
糖化血清蛋白(µmol/L)
|
|
糖尿病组
|
60.14±7.12
|
161.70±6.20(1)
|
65.17±8.00
|
24.88±2.44(1)
|
7.94±2.33(1)
|
244.37±63.08(1)
|
|
男
|
60.02±8.61
|
168.40±4.52
|
70.17±7.35
|
24.74±2.41
|
7.98±2.34
|
249.30±68.39
|
|
女
|
60.22±6.10
|
157.16±3.47
|
61.78±7.04
|
24.96±2.47
|
7.91±2.33
|
241.02±59.20
|
|
对照组
|
58.36±7.96
|
169.07±5.69
|
67.42±7.11
|
23.54±1.84
|
4.79±0.62
|
198.36±42.05
|
|
男
|
58.75±8.35
|
171.64±4.51
|
69.24±6.81
|
23.45±1.84
|
4.72±0.63
|
200.17±44.45
|
|
女
|
57.33±6.98
|
161.87±4.79
|
62.33±6.22
|
23.78±1.84
|
4.88±0.54
|
192.07±37.02
|
|
组别
|
糖化血红蛋白(%)
|
胰岛素
(mU/ml)
|
总胆固醇 (mmol/L)
|
甘油三酯
(mmol/L)
|
HDL-C
(mmol/L)
|
LDL-C
(mmol/L)
|
|
糖尿病组
|
7.37±1.18
|
10.18±5.86(1)
|
5.36±0.77(1)
|
1.66±0.74
|
1.43±0.30
|
2.74±0.53
|
|
男
|
7.30±1.17
|
8.04±3.59
|
5.15±0.66
|
1.38±0.45
|
1.33±0.28
|
2.73±0.50
|
|
女
|
7.42±1.18
|
11.11±7.18
|
5.47±0.78
|
1.82±0.90
|
1.48±0.31
|
2.75±0.55
|
|
对照组
|
——
|
31.82±14.12
|
4.67±0.54
|
1.20±0.28
|
1.33±0.24
|
2.62±0.47
|
|
男
|
——
|
34.58±16.65
|
4.71±0.52
|
1.17±0.27
|
1.29±0.24
|
2.55±0.50
|
|
女
|
——
|
23.55±10.01
|
4.58±0.68
|
1.24±0.28
|
1.45±0.23
|
2.79±0.39
|
|
组别
|
Apo A1
(mmol/L)
|
Apo B
(mmol/L)
|
Apo C2
(mg/dl)
|
Apo C3
(mg/dl)
|
Apo E
(mg/dl)
|
Apo AⅡ
(mg/dl)
|
|
糖尿病组
|
1.47±0.20
|
1.13±0.20
|
3.29±1.5
|
10.02±2.78
|
5.56±1.4
|
29.67±3.38
|
|
男
|
1.40±0.18
|
1.11±0.16
|
2.85±0.86
|
9.37±2.08
|
5.06±1.15
|
30.04±3.25
|
|
女
|
1.51±0.19(1)
|
1.14±0.22
|
3.53±1.89
|
10.37±3.12
|
5.83±1.48
|
29.47±3.48
|
|
对照组
|
1.27±0.21
|
1.06±0.19
|
3.44±1.02
|
10.01±2.15
|
——
|
——
|
|
男
|
1.28±0.22
|
1.05±0.18
|
3.47±1.01
|
9.99±2.02
|
——
|
——
|
|
女
|
1.25±0.22
|
1.09±0.21
|
3.29±1.06
|
10.54±2.50
|
——
|
——
|
注：(1) 与对照组进行t检验 P<0.05。
2.2 3-硝基酪氨酸：由测得的标准液A值与已知的标准液浓度得到以下标准曲线（图1）。
|
进而由样本OD值得到样本的3-NT浓度：糖尿病组血液中3-NT明显高于非糖尿病对照组[115.41±8.30 v.s.( 95.83±6.89) nmol/L,P<0.05]。按性别分层后，糖尿病组男性和女性血液中3-NT水平均显著高于其相应的对照组。不论糖尿病组还是对照组，男性和女性组之间血液中3-NT水平均没有显著性差异（表2）。
表2糖尿病患者和非糖尿病患者血液中3-NT水平
Table 2 The levels of 3-NT in diabetic and non-diabetic group
|
指标
|
糖尿病组
|
非糖尿病对照组
|
||
|
男（n=44）
|
女（n=65）
|
男（n=42）
|
女（n=15）
|
|
|
3-NT（nmol/L）
|
115.03±7.16(1)
|
115.67±9.11(1)
|
96.01±6.34
|
95.31±8.46
|
注：(1) 与对照组进行t检验 P<0.05。
2.3糖尿病患者分层处理后血液中3-NT水平：结果见表3。
表3糖尿病患者不同BMI、空腹血糖、年龄、病程中的3-NT水平
Table 3 The levels of 3-NT in diabetics with different BMI, blood glucose, ages and diabetic courses
|
BMI（kg/m2）
|
n
|
3-NT（nmol/L）
|
年龄(岁)
|
n
|
3-NT（nmol/L）
|
|
＜24
|
46
|
112.74±8.22
|
≤60
|
57
|
115.30±8.64
|
|
24-28
|
48
|
115.99±8.14
|
＞60
|
52
|
15.50±7.95
|
|
>28
|
15
|
119.65±5.15(1)
|
--
|
--
|
--
|
|
空腹血糖( mmol/L）
|
n
|
3-NT（nmol/L）
|
病程（年）
|
n
|
3-NT（nmol/L）
|
|
≤6.1
|
34
|
111.00±7.80
|
≤5
|
40
|
114.53±9.36
|
|
＞6.1
|
75
|
117.40±8.10(1)
|
＞5
|
69
|
115.92±7.63
|
注：(1) 与对照组进行t检验 P<0.05
按BMI分层：BMI>28kg/m2组3-NT水平明显高于BMI<24kg/m2组（表3），同时可见随着BMI的增加，血液3-NT水平有逐渐增高的趋势。并且空腹血糖＞6.1mmol/L糖尿病患者3-NT水平高于血糖≤6.1mmol/L糖尿病患者。
将糖尿病组按年龄≤60岁和年龄＞60岁分层，3-NT水平在这两组间无显著差异（P>0.05，表3）。将糖尿病组按病程≤5年、病程＞5年分层，3-NT水平在两组间无显著差异（P>0.05，表3）。
2.4 逐步回归分析：以年龄、身高、体重、BMI、空腹血糖、糖化血清蛋白、糖化血红蛋白、胰岛素、总胆固醇、甘油三酯、HDL-C、LDL-C、Apo A1、Apo B、Apo C2、Apo AⅡ、Apo C3等因素为自变量，以3-NT值为因变量，对全部糖尿病患者进行逐步回归分析，变量引入和剔除的标准分别为0.05、0.10[3]。经逐步拟合，有三个自变量入选方程，3-NT与LDL-C、糖化血清蛋白、糖化血红蛋白有线性回归关系，“最优”回归方程为Y=104.12+5.03X1-3.34X2-0.06X3。由标准化回归系数看出，糖化血红蛋白Beta值最高，即对3-NT影响最大（表4）。决定系数R2=0.247说明3-NT能被LDL-C、糖化血清蛋白、糖化血红蛋白解释的比例为24.7%。对回归方程进行方差分析，F=7.22，P=0.00。其他因素的偏回归系数经t检验，P＞0.10，均被剔除，即与3-NT没有线性相关(表4)。
表4 糖尿病患者血液3-NT逐步回归分析
Table 4 The results of regression analysis in the diabetic group
|
变量
|
偏回归系数（B）
|
标准化回归系数（Beta）
|
P值
|
变量
|
偏回归系数（B）
|
标准化回归系数（Beta）
|
P值
|
|
糖化血红蛋白
|
5.03
|
0.73
|
0.00
|
葡萄糖
|
-0.07
|
-0.11
|
0.59
|
|
糖化血清蛋白
|
-0.06
|
-0.54
|
0.01
|
胰岛素
|
0.07
|
0.06
|
0.59
|
|
LDL-C
|
-3.33
|
-0.24
|
0.04
|
总胆固醇
|
0.03
|
0.04
|
0.83
|
|
糖尿病史
|
-0.01
|
-0.01
|
0.95
|
甘油三酯
|
0.06
|
0.06
|
0.64
|
|
年龄
|
0.06
|
0.05
|
0.63
|
HDL-C
|
-0.02
|
-0.02
|
0.89
|
|
身高
|
0.15
|
0.13
|
0.23
|
Apo A1
|
-0.00
|
-0.00
|
0.98
|
|
体重
|
0.15
|
0.13
|
0.24
|
Apo B
|
0.01
|
0.02
|
0.95
|
|
BMI
|
0.09
|
0.08
|
0.48
|
Apo C2
|
-0.19
|
-0.17
|
0.13
|
3 讨论
蛋白质硝基化普遍存在于糖尿病及其心血管并发症的发生和发展阶段[1, 2]。在过氧化损伤中总是伴随着活性氧物质如NO的增多，NO与O– 反应生成过氧亚硝酸盐（ONOO–），ONOO–是一种强氧化剂，可使蛋白质酪氨酸残基发生硝基化，最终形成3-NT[4]。作为过氧化损伤的终产物之一，3-NT在糖尿病患者和非糖尿病正常人体内的血浆含量是否有差别，其含量与血糖、糖化血红蛋白、血脂指标之间的关系等一系列问题均没有确切的定论。
有研究表明用高浓度血糖灌注离体心脏，将明显地升高冠状动脉灌注压并伴随着3-NT的生成[5]；在2型糖尿病患者的血液中，硝基化载脂蛋白A -I（apolipoprotein A -I，Apo A -I）含量明显增高，比正常同龄对照高50%[6]，而Apo A-I 的硝基化与动脉粥样硬化关系密切。这些结果无疑对探索糖尿病并发症的发病机制有着积极的意义。
本研究采用ELISA方法对人体血清3-NT进行定量测定，发现糖尿病患者血清3-NT水平明显高于正常人[115.41±8.30 v.s. (95.83±6.89 )nmol/L,P<0.05]。Frost在碱性条件下水解血浆蛋白测得正常人血浆中3-NT为(14±0.7)ng/ml，检测限为100pg[7]。有研究用HPLC法测得墨西哥糖尿病人（n=40）血浆游离3-NT值为11.0±1.7nmol/L，非糖尿病人（n=40）为(10.4±1.5)nmol/L，两组间3-NT没有显著差异[8]。也有研究发现1型糖尿病患者血红蛋白中的3-NT水平是降低的[9]。国内有研究用ELISA方法测得70例正常中国人的血浆3-NT为(7.5±5.3)nmol/L[10]；糖尿病人血浆3-NT为(0.251±0.141)mmol/L[2]。由于检测方法和样本量受限，导致结果不一致。本研究采用的ELISA方法最低检测限为2nM，检测的样本量较大，证实了糖尿病患者体内存在着蛋白质硝基化的损伤过程。
本研究还发现肥胖和空腹血糖高的糖尿病患者3-NT较高，这可能是因为高血糖总是伴随和导致过氧化损伤[11]，而血糖高的糖尿病患者总热量一般控制不好，这同时也是导致肥胖的一个重要因素。Antonio等发现在2型糖尿病人群中，血浆中的硝基酪氨酸水平与血糖浓度呈正相关，餐后高血糖现象也与酪氨酸硝基化现象相伴随出现[2]。而用普兰林肽治疗1型糖尿病患者，在降低餐后血糖的同时也明显地降低了3-NT的含量[12]。本研究结果结合这些先期研究提示：在糖尿病治疗中，通过合理饮食和药物治疗控制血糖、保持正常体重，可以减少蛋白质硝基化修饰。
按年龄和病程分层分析糖尿病患者3-NT数据，没有发现显著差异，可能是因为样本量小。以往研究发现3-NT在女性糖尿病患者血浆中明显高于男性糖尿病患者[8]，但是本研究糖尿病组内男女之间3-NT没有显著差异，这有待增加样本量进行进一步测定。回归分析发现3-NT水平与糖化血红蛋白、糖化血清蛋白呈线性相关，且与糖尿病心血管并发症危险因素LDL-c呈线性负相关。
3-NT的血清水平在糖尿病患者体内明显高于正常人，3-NT水平与血糖、BMI、糖化血红蛋白、糖化血清蛋白、LDL等因素密切相关。至此，可以认为蛋白质硝基化是糖尿病患者发生心血管并发症的重要危险因素之一。如果通过进一步研究，对糖尿病患者进行科学合理的膳食干预，找到能够降低3-NT水平的食物种类和消费频次，那么对于减少糖尿病心血管并发症的发生、改善糖尿病的生活质量具有重要的临床和实践意义。
参考文献
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