青年科学工作者论坛2010年第1期

覃倚莹  吴晖  肖性龙[1]^,2  余以刚  张经纬²

华南理工大学轻工与食品学院，广州 510640

 

摘要：目的 针对霍乱弧菌血清群各自编码O抗原的特异性基因建立能够快速、准确地同时检测O1和O139群霍乱弧菌的荧光PCR检测方法，并克服常用PCR检测方法中经常出现的假阳性现象。方法 分别以rfbM和wbfR基因作为O1和O139群霍乱弧菌的模板设计引物和探针，通过优化反应条件建立了能够同时检测O1群和O139群霍乱弧菌的二联实时荧光定量PCR方法。对该方法的特异性、灵敏度进行评估，并对10份模拟食品样品和133份临床样品进行了检测。结果 特异性试验表明，该方法能选择性检测O1和O139群霍乱弧菌，能有效地避免O141群霍乱弧菌和拟态弧菌的假阳性，特异性为100%；灵敏度试验表明，O1群霍乱弧菌和O139群霍乱弧菌检出限分别为92CFU/ml和116CFU/ml；另外，试验建立的检测方法对模拟样品和临床样品检测结果与国标法的检测结果完全一致，符合率为100%。结论本研究所建立的实时荧光PCR检测方法能够同时检测O1和O139群霍乱弧菌，而且特异性好、灵敏度高，能有效克服假阳性，适用于基层疾病控制、口岸检疫单位日常疫情监测和临床诊断。

关键字：霍乱弧菌   实时荧光定量PCR   rfbM基因   wbfR基因   TaqMan探针

中图分类号： Q593.1                  文献标识码：A

QIN Yiying, WU Hui, XIAO Xinglong, YU Yigang, ZHANG Jingwei

College of Light Industry & Food, South China University of Technology, Guangzhou  510640，China

 

Abstract: Objective Targeting the specific O-antigen Gene cluster, a Taq-Man real-time fluorescence PCR assay was developed to detect O1 and O139 Vibrio cholera concurrently and avoid frequently occurred false positives. Method We designed two pairs of specific primers and two TaqMan fluorescent probes respectively targeting rfbM gene of Vibrio cholerae O1 and wbfR of O139. After optimization of conditions, we evaluated the specialty and sensitivity of the detection method and tested ten simulated food samples and 128 clinical samples. Result The detection limits of Vibrio cholerae O1 and O139 are 92 CFU/mL and 116 CFU/mL, which are almost the same with the usual PCR method. The developed real-time fluorescence PCR protocol detect only Vibrio cholerae O1 and O139 and it is not affected by many normal food pathogens such as Staphylococcus aureus and Salmonella, especially Vibrio cholerae O141which contained TCP genes and Vibrio mimicus which contained ZOT gene. The clinical detect results of the developed assay and routine culture method are exactly the same. [Conclusion] The developed detection assay can quantitatively detect Vibrio cholerae O1 and O139 concurrently in only 3 hours, and can avoid false positive, and thus is an efficacious method for detecting Vibrio cholerae O1 and O139 and can be used in a wide area such as entry-exit inspection and quarantine, food safety detection and clinical diagnose.

Key words: Vibrio cholerae O1 and O139，Real-time fluorescence PCR，rfbM gene，wbfR gene，TaqMan-based probe

 

霍乱弧菌（Vibrio cholerae，Vc）能够引起一种烈性传染病--霍乱。霍乱发病急、传播快、波及面积广，危害十分严重，是我国法定报告的甲类传染病和国际检疫传染病中最为严重的一种，如抢救不及时或不得当，可于发病后数小时至十多个小时内死亡，严重威胁公众的人生安全，因此快速、准确和灵敏地检测霍乱弧菌至关重要^[1]。

虽然霍乱弧菌有200多个血清型，但是只有O1和O139群霍乱弧菌可引起霍乱大流行^[2-3]。而作为国际检疫传染病——霍乱的病原诊断，以检出O1群霍乱弧菌或O139群霍乱弧菌为准^[4]。因此建立同时检测食品中O1和O139群霍乱弧菌的方法，可以让O1和O139群霍乱弧菌的检测一步完成，省时省力，对保障食品安全、防治霍乱流行具有重大意义。

Taq-man实时荧光PCR检测方法特异性强、灵敏度高、所需时间短、而且可以定量检测，受到高度重视。对霍乱弧菌的PCR检测一般是以各种毒力基因为靶基因建立的单重或多重PCR，但是许多研究表明，毒力基因特异性不够高，以其为靶基因建立的检测方法容易造成假阳性。

本实验针对霍乱弧菌血清群各自编码O抗原的特异性基因，O139群霍乱弧菌以wbfR为模板，O1群霍乱弧菌以rfbM为模板设计引物和探针建立快速、同时检测O1和O139群霍乱弧菌的二联实时荧光PCR方法，克服由于毒力基因特异性不够高造成的假阳性。

 

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株及样本  O1和O139群霍乱弧菌、沙门菌(Salmonella)、志贺菌(Shigella dysenteriae)、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) 拟态弧菌（Vibrio mimicus）、创伤弧菌（Vibrio vulnificu）、溶藻弧菌（vibrio alginolyticus）等由深圳出入境检验检疫局的实验室（SZCIQ）和美国典型培养物保藏中心(（ATCC）提供，非O1和O139群霍乱弧菌由深圳太太基因工程有限公司（SZTT）提供；收集来自广东省水产基地以及市售的多种咸水及淡水鱼类、虾类及贝壳类等水产品样本120份，2008年9月以来由沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌等肠道细菌引起的临床腹泻样本13份。

1.1.2 试剂  Taq酶（MBI）、TrisCl、EDTA、SDS、苯酚、氯仿、异丙醇、无水乙醇、Free RNase水等常规试剂（分析纯）以及DNA提取液。

1.1.3 仪器  ABI7500HT荧光定量PCR仪，移液枪（1000μl、200μl、20μl、2.5μl），低温微量超速离心机，水浴锅，涡旋振荡器等。

根据霍乱弧菌O1和O139血清群各自的特异基因，确定rfbM、wbfR基因序列片段分别作为它们实时荧光PCR引物和探针设计的模板。从GenBank上获得O1群霍乱弧菌rfbM基因序列和O139群霍乱弧菌wbfR基因序列，分别采用DNAStar软件中的Seqman进行同源性分析，确定在群内保守而群间特异的片段，再运用ABI的Primer Express及DNAStar中的PrimerSelect软件设计引物和探针。引物和探针由上海生物工程有限公司合成。

取待测样本增菌液1ml加到1.5ml无菌离心管中，8 000r/min离心4min，尽量吸干上清；加入50μl DNA提取液，振荡混匀后沸水浴5min，13 000r/min离心5min；转移上清液并保存在-20℃备用。

参照MBI公司产品Taq酶（#EP0402）说明书，将荧光定量PCR上游引物、下游引物和探针同时加入反应体系中，于ABI 7500荧光定量PCR仪进行PCR扩增。对荧光定量PCR反应体系中各组分浓度和反应程序进行优化，特别是对引物和探针浓度进行筛选。

以沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、拟态弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌等多种感染人的食源性致病菌作为阴性对照菌株，并用高纯水作为无模板空白对照（No template control，NTC），验证所建立的O1和O139群霍乱弧菌二联实时荧光定量PCR检测方法的特异性。

将待测菌株用碱性蛋白胨水37℃培养6~8h后，依次将原菌液稀释至10^-5~10^-8各个浓度梯度，从各浓度取50μl菌液涂平板，3个平行，取各浓度菌液10μl作为模板，进行实时荧光PCR检测。然后统计平板上长出的菌落个数，结合相对应的实时荧光PCR的检测结果，计算出该检测方法的敏感性。

选取传统检测方法预检为O1和O139群霍乱弧菌阴性的鱼肉、虾肉10g与90ml碱性蛋白胨水制成匀浆，取10ml鱼虾肉匀浆10份，分别接入1ml不同浓度的O1和O139群霍乱弧菌菌液，混匀作为模拟食品样品，取1ml的增菌液提取DNA模板后用实验建立的方法进行检测。同时采用传统培养法进行霍乱弧菌检测。

用灭菌棉拭子沾取碱性蛋白胨水涂抹收集到的120份水产品样本的表面，将棉拭子置于8~10ml碱性蛋白胨水中37℃培养6~8h后用实验建立的方法进行检测。同时采用传统培养法进行霍乱弧菌检测。

将收集到的13份临床腹泻样本加入8~10ml碱性蛋白胨水中37℃培养6~8h后用实验建立的方法进行检测。同时采用传统培养法进行霍乱弧菌检测。

 

设计的多对引物探针组合经实验筛选优化，获得最佳引物探针组合，作为本方法中的引物和探针，其序列和特征见表1。

菌株	名称	序列（5’-3’）	长度（bp）	熔解温度（℃）
Vibrio cholerae O1	Primer F605	CAC GCC ATT GAA GGT TAT GTC TC	23	59.5
	Primer R703	AAA TTG ATG TCG ATA GCG GTA GAT TA	26	58.3
	Probe Pb645	FAM-CCG CCT GCT CAG CAA AAG TAT TCA TCA-TAMRA	27	68.5
Vibrio cholerae O139	Primer F997	CAG TTA CCT GTT ATG TAC GAT GAA CCT	27	57.8
	Primer R1106	CCA TCA CCA GAC AAG CAT ACA GT	23	57.7
	Probe Pb1025	FAM- TGC TGA CGC CTC TCA AGT GCC TAC G-TAMRA	25	69.2

The primers and probes are synthesized by Shanghai Sangon Biological Engineering Technology & Services Co., Ltd.

 

设计的引物和探针序列输入GenBank数据库运行Blast程序，比对结果显示，分别针对O1群和O139群霍乱弧菌设计的引物和探针序列在各自的血清群内是高度保守的，而对于其它血清群及物种又同时高度特异，因此理论上都具有特异的扩增效果。

引物和探针浓度筛选试验结果表明，采用O1群霍乱弧菌的引物浓度和探针浓度分别为0.7μmol/L和0.3μmol/L，O139群霍乱弧菌的引物浓度和探针浓度分别为0.5μmol/和0.2μmol/L进行检测，获得的Ct值最小且荧光增量（△Rn）较大。对荧光定量PCR反应体系中其余各组分浓度进行优化，最终确定各组分用量/浓度为(25μl)：Taq 酶2.5U，1×缓冲液（含有镁离子），dNTP混合液0.4mmol/L，模板DNA 2μl。优化后的反应程序为：95℃变性2min，以95℃、15s，60℃、1min（收集FAM荧光信号）扩增40个循环，反应时间为1.5h。

利用本研究建立的O1和O139群霍乱弧菌二联实时荧光定量PCR检测方法对O1和O139群霍乱弧菌，和沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、拟态弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌以及以毒力基因为靶基因建立的荧光PCR检测方法容易出现假阳性的O110和O141群霍乱弧菌等14株阴性对照菌株进行检测。结果显示只有O1群和O139群霍乱弧菌出现典型的扩增曲线，而其他14株菌株和空白对照均为一平直线，Ct值无法读取（Undet.），判为阴性。该检测结果与传统的生化检测方法结果完全一致（表2，图1），说明所建立的二联荧光PCR检测方法对O1和O139群霍乱弧菌的检测特异性为100%。

菌株	来源	Ct	传统检测方法(1)
Vibrio cholerae O139	SZCIQ 5144	20	＋
Vibrio cholerae O1	SZCIQ 7326	22	＋
Vibrio cholerae O110	SZTT 0125	Undet.	－
Vibrio cholerae O141	SZTT 0146	Undet.	－
vibrio mimicus	ATCC33653	Undet.	－
Vibrio vulnificu	ATCC27562	Undet.	－
vibrio alginolyticus	ATCC17749	Undet.	－
Campylobacter jejuni	SZCIQ 11213	Undet.	－
Staphylococcus aureus	SZCIQ 6538	Undet.	－
E.coli O157:H7	SZCIQ 13813	Undet.	－
Salmonella.spp	ATCC 9089	Undet.	－
Listeria monocytogenes	SZCIQ 7644	Undet.	－
Shigella dysenteriae	SZCIQ 4376	Undet.	－
Vibrio parahaemolyticus	SZCIQ 4242	Undet.	－
Enterobacter sakazakii	SZCIQ 0013	Undet.	－
Klebsiella oxytoca	SZCIQ 45103	Undet.	－

 

 

 

 

实验结果如表3所示。由于用O1群霍乱弧菌涂板的菌液是50μl，10^-6稀释度平均长出46个菌落，而用于检测的菌液是10μl，该10μl的菌液中理论含菌量0.92个细菌，即实验建立的检测方法对O1群霍乱弧菌的灵敏度的理论极限是92CFU/ml。同理，O139群霍乱弧菌的灵敏度的理论极限是116CFU/ml。实验建立的二联实时荧光PCR检测方法的灵敏度与常用的检测方法相似，一次反应检出阳性细菌细胞的灵敏度达到个位细胞数。

菌株	梯度浓度	平均数	涂板用量 （μl）	检测用量 （μl）	Ct	灵敏度 （CFU/ml）
Vibrio cholerae O1	10-5	494	50	10	30.44	92
	10-6	46	50	10	33.05
	10-7	5	50	10	37.13
	10-8	0	50	10	Undet.
Vibrio cholerae O139	10-5	605	50	10	29.64	116
	10-6	58	50	10	32.48
	10-7	6	50	10	36.29
	10-8	0	50	10	Undet.

 

利用本研究建立的FQ-PCR方法以及传统检测方法对10份模拟样品、120份淡水、咸水样品和13份呕吐物进行检测，实验结果表明，实验建立二联实时荧光定量PCR检测方法能够同时检测O1和O139群霍乱弧菌，其结果与传统的检测方法符合率为100%，具有广泛而良好的适用性。

样品名称	检验数	阳性样品				与传统检测方法的符合率
		FQ-PCR	传统检测法
			Vc O1	Vc O139	Vc O1 and O139
模拟样品	10	10	3	3	4	100%
淡水、咸水样品	120	3	2	0	1
呕吐物	13	5	3	2	0

 

现有的关于同时检测O1和O139群霍乱弧菌的研究主要包括普通PCR和其他PCR包括荧光PCR、巢式PCR、原位PCR等。普通PCR需要进行电泳，费时费力，而且电泳过程容易污染而造成假阳性，电泳所用的试剂毒性极大，对人员的安全造成很大的威胁。而荧光PCR由于不需要后续的处理，而且灵敏度高，特异性强在微生物检测上得到越来越多的应用。对霍乱弧菌的PCR检测一般是针对霍乱毒素元件（CTX）、霍乱毒素共调菌毛（TCP）、毒素表达调控蛋白（toxR）、RTX等毒力基因设计引物进行单重或多重PCR^[6-8]。但是有研究指出产毒素的非霍乱弧菌以及非O1，非O139群霍乱弧菌也有可能含有这些毒力基因^[9]。KATSUAKI等以rfb和ctxA作为靶基因设计引物建立了O1和O139群霍乱弧菌的普通PCR检测方法，其中O37、O105、O141和O191群霍乱弧菌表现为ctxA阳性^[10]。GEORGE针对ctxAB基因设计引物和探针建立的荧光PCR检测方法能够检测出O1和O139群霍乱弧菌的同时也能检测O141群霍乱弧菌和拟态弧菌^[11]。DALSGAARD等研究表明霍乱弧菌O141含有TCP基因和CTX前噬菌体^[12]。GUHATHAKURTA等研究表明，非O1和O139群霍乱弧菌也含有编码毒素表达调控蛋白的基因（toxR）^[13]。CHOWDHURY等指出，拟态弧菌含有O1型霍乱弧菌中编码肠毒素的zot基因^[14]。因此针对这些毒力基因建立的检测方法可能造成假阳性。

O抗原是自然界中最具多样性的分子之一，它决定着霍乱弧菌的血清学分类，具有高度的特异性。Hoshino 等以rfb和ctxA作为靶基因设计引物建立了O1和O139群霍乱弧菌的普通PCR检测方法，试验中所有O1和O139群霍乱弧菌均为rfb阳性^[10]。王晓梅根据O1群和O139群霍乱弧菌抗原编码基因rfb序列设计引物，利用SYBR Green染料，建立同时检测霍乱弧菌O1群和O139群的实时荧光PCR检测方法^[15]，该方法特异性为100%。

O139群霍乱弧菌是O1群霍乱弧菌的变种，其中，O139群霍乱弧菌的rfb基因由wbf基因取代^[10,16]。本试验确定rfbM、wbfR基因序列片段分别作为O1群和O139群霍乱弧菌的模板设计引物和探针建立同时检测O1和O139霍乱弧菌的Taq-Man实时荧光PCR检测方法，其中，Taq-Man实时荧光PCR检测方法由于引物和探针的双重保险，特异性更强。BLAST结果也显示我们选取的rfbM、wbfR基因片断高度保守，实验结果也证明了基于rfbM、wbfR基因的FQ-PCR检测特异性为100%。

本研究所建立的荧光PCR检测方法克服了普通PCR检测方法的缺点，而且针对特异性更强的编码O抗原的基因设计引物探针，能够同时检出O1和O139群霍乱弧菌，检测限达到了个位细胞，特异性强，能够有效地克服假阳性和漏检，操作简单需时短，将为O1群和O139群霍乱弧菌进行流行病学调查提供有力的工具，适用于进出口检验检疫、食品安全检测、病原体的临床诊断（疾病的临床早期诊断，病原微生物的含量分析等）、基础理论研究（SNP筛查，基因分型等）等领域,应用前景广阔。

 

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