青年科学工作者论坛2010年第3期

张伟 孙宗科 鲁波 王友斌 丁培 郑萍 陈西平¹

 中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所，北京 100021

摘要 ：目的 研究4-甲基伞形酮辛酯（MUCAP）试验检测水中沙门菌的灵敏度、特异度和检出限以及该方法的实际应用效果。方法 采用“前增菌+选择性增菌+MUCAP初筛+氧化酶实验+血清学实验”的方法，对加标水样和实际环境水样进行检测。结果 MUCAP试验的灵敏度为100%，特异度为80.8%，检出限为1CFU/100ml。结论 采用MUCAP实验的方法可以有效的检出水样中的沙门菌，并将实验时间由原来的72h缩短为48h。

关键词 ：沙门菌检测 MUCAP试验

中图分类号：                  文献标识码： A

 

Institute for Environment Hygiene and Health Related Product Safety, Chinese Center

for Disease Control and Prevention, Beijing 100021, China

Abstract：Objective  To study the sensitivity, specification, detection limit and the practical use of MUCAP method for the detection of salmonella in water.  Methods A comprehensive method of pre-enrichment +selective cultivation + initial screening with MUCAP + oxidase test+ serological test was applied to check salmonella in water samples spiked with bacteria and environmental water samples. Results the sensitivity of MUCAP method was 100%, the specification was 80.8%, and the detection limit was 1CFU/100mL.  Conclusion MUCAP method can effectively identify salmonella in water and the testing time was shortening from 72h to 48h.

Key words：Salmonella，Detection，MUCAP test

 

沙门菌属(Salmonella)是一大群寄生于人和动物肠道中的形态、培养特点、生化反应和抗原构造相似的革兰阴性杆菌，是肠杆菌科中的一个属。其分布广泛，易于繁殖，可对食品、水源等造成污染。沙门菌感染是近年来发生的食源性及水源性食物中毒的重要原因之一，在环境水体尤其是污水中多有检出。

沙门菌传统的检测方法是经过选择性培养后进行生化鉴定，一般需要72h，耗时长且操作复杂，因此快速检测沙门菌诸如ELISA^[1]、PCR^[2]等方法近来受到广泛关注，其中MUCAP试验因其操作简便且灵敏度高而受到了微生物学家的重视^[3]。其原理是沙门菌可以产生辛酯酶，能够分解4-甲基伞形酮辛酯（MUCAP），释放出荧光底物4-甲基伞形酮，在366nm紫外光下产生蓝色荧光，根据这一特性，可以快速检测水中是否存在沙门菌。

本文对MUCAP试验检测水体中沙门菌的灵敏度、特异度和检出限做了研究并用实际水样对该方法的实际检测能力进行了验证。

 

1.1.1菌株  试验菌株来自本实验室保藏的标准菌株和从环境中分离的菌株，包括：甲型副伤寒沙门菌（A群），鼠伤寒沙门菌（B群），猪霍乱沙门菌（C群），肠炎沙门菌（D群），山夫登堡沙门菌（E群）等13株沙门菌和大肠埃希菌等其他细菌共39株，见表1和表2。

1.1.2培养基  缓冲蛋白胨水、亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC增菌液）、连四硫酸盐增菌液（TTB增菌液）、BS琼脂培养基、SS琼脂培养基等均购自OXOID公司。

1.1.3试剂 MUCAP购自北京泰利华科技开发中心。

将细菌划线接种于SS琼脂上，37℃培养24h，在单个菌落上滴加一滴MUCAP试剂，5min内在366nm紫外灯下有蓝色荧光产生的为阳性结果，否则为阴性。

1.3.1 将沙门菌在营养琼脂培养基上培养24h后，刮取菌苔用磷酸盐缓冲液（PBS）配成菌悬液，并进行梯度稀释，用比浊法和平板计数法将菌液稀释到约1CFU/ml；

1.3.2取北京市东南二环护城河水，用本项研究中采用的方法测定水中的沙门菌，选用经MUCAP试验确定沙门菌为阴性的水样，并对该水样进行菌落总数计数；

1.3.3取1ml 1CFU/ml的沙门菌液加入到99ml护城河水中，混匀后用0.45mm的微孔滤膜过滤，将滤膜加入到0.1%缓冲蛋白胨水100ml中，37℃振荡培养6h，各取50ml培养液分别加入到等量双倍SC和双倍TTB中，37℃培养18h；

1.3.4取增菌后的液体划线接种于SS和BS琼脂上，37℃培养24h，在典型菌落上滴加1滴MUCAP试剂，待1~5min后，置于365nm 紫外灯下观察荧光，出现蓝绿色荧光为阳性反应；

试验重复10次。

取水样50份，分别取100ml过滤后，将滤膜加入到0.1%缓冲蛋白胨水中进行前增菌6h，之后用SC和TTB培养基选择性增菌18h，增菌后在SS和BS琼脂平板上划线接种24h，挑取可疑菌落纯培养后进行生化鉴定，并用血清学试验证实；同时对所有水样用MUCAP方法进行检测，并用氧化酶和血清学试验证实。

 

试验菌株名称	株数	阴性株数
大肠埃希菌	3	3
志贺菌	4	4
肠杆菌	2	2
弗柠檬酸杆菌	1	1
肺炎克雷伯杆菌	1	1
变形杆菌	2	2
蜂房哈夫尼亚菌	1	1
普罗菲登菌	2	2
小肠结肠炎耶尔森菌	1	1
河流弧菌	1	1
副溶血性弧菌	1	1
乙酸钙不动杆菌	1	1
粪产碱杆菌	1	1
铜绿假单胞菌	2	0
粘质沙雷菌	1	0
亲水气单胞菌	1	0
粪链球菌	1	0
合计	26	21

在本试验中，13株沙门菌MUCAP试验均为阳性，实验的灵敏度为100%（13/13），蜂房哈夫尼亚菌、粘质沙雷菌、亲水气单胞菌和铜绿假单胞菌出现MUCAP试验阳性反应，实验的特异度为80.8%（21/26），经进一步生化试验，亲水气单胞菌和铜绿假单胞菌可以通过氧化酶试验排除是沙门菌，蜂房哈夫尼亚菌和粘质沙雷菌通过血清学试验排除是沙门菌，如能结合氧化酶试验和血清学试验，将显著提高MUCAP试验的特异度见表1。

在试验中沙门菌的加标量及实验结果见表2。

注：(1)为10次实验结果的平均值，单位为CFU/100ml；(2)“+”表示10次结果中有8次及以上结果出现阳性反应

沙门菌接种量为1～2个时，接种到菌落总数为6.22×10⁴/100ml的护城河水中，经增菌、划线接种后沙门菌可以检出，认为SC增菌液、TTB增菌液可以从环境水样中有效的分离出沙门菌。考虑到实际操作中很难以获得刚好为1CFU/ml的沙门菌稀释液，本项试验中沙门菌接种量为1.6～1.9 CFU /100ml，可以认为采用缓冲蛋白胨水前增菌、SC增菌液和TTB增菌液选择性增菌的检测方法其沙门菌的检出率为1CFU/100ml。

从不同的环境中采集实际水样共50份，进行沙门菌的检测，样品检测结果见表3。

Table 3 The results of MUCAP method to check environment water sample 

 

在本项试验中所取的50件样品中，通过常规生化试验方法鉴定出11株沙门菌；用MUCAP实验法初步鉴定出13株沙门菌，经进一步生化鉴定，其中11株为沙门菌，与常规方法鉴定结果相符合，2株氧化酶实验阳性，其中1株为气单胞菌，另1株为铜绿假单胞菌。

 

在本项试验中用MUCAP试验检测本实验室保存的沙门菌和其它细菌，其中所有沙门菌MUCAP试验为阳性，其它细菌中亲水气单胞菌、铜绿假单胞菌、蜂房哈夫尼亚菌和粘质沙雷菌表现为MUCAP试验阳性。对所有阳性结果做氧化酶实验和血清学实验，其中气单胞菌属和假单胞菌属细菌可以通过氧化酶实验排除是沙门菌，蜂房哈夫尼亚菌和粘质沙雷菌可以通过沙门菌血清学实验排除。

在检测的50件实际水样中，常规方法鉴定出11株沙门菌，用MUCAP实验法初步鉴定出13株沙门菌，经进一步生化鉴定，其中11株为沙门菌，2株氧化酶实验阳性，其中1株为气单胞菌，另1株为铜绿假单胞菌，这两种细菌可以通过氧化酶实验排除。

由以上实验结果可以认为采用“前增菌+选择性增菌+MUCAP初筛+氧化酶实验+血清学实验”的方法可以有效的检出水样中的沙门菌，检出限为1CFU/100ml。采用这一方法可以避免复杂的生化鉴定步骤，并将实验时间由原来的72h缩短为48h。

 

1 黄金林,焦新安,潘志明. 直接酶联免疫吸附法和聚合酶链反应联合检测沙门菌的应用[J].中华预防医学杂志,2004,38(5):331-334.

2 刘华伟,郭蔼光,马立农,等. PCR技术在沙门氏菌快速检测中的应用[J].动物医学进展,2004,25(6):55-58.

3 褚天新,苏丽霞,路文彬. MUCAP荧光试验快速检测沙门氏族菌[J].中国公共卫生，2000,16(1):69-70.

---