青年科学工作者论坛2010年第4期

宁波地区织纹螺毒性特征探索研究

徐景野   许国章   叶鹿鸣   秦品章   胡丹标[1]   闫鹏   金春光   于梅

宁波市疾病预防控制中心，宁波 315010

摘要：目的 了解宁波地区有毒织纹螺毒素的类型、分布、消长及毒素来源。方法 小鼠生物法测定织纹螺毒性；ELISA法及HPLC等检测织纹螺石房蛤毒素（STX）、膝沟藻毒素（GTX）、河豚鱼毒素（TTX）。结果 从长期监测点采集的127份织纹螺样品，检出毒螺63份，检出率49.6%，样品的毒性高峰和低谷分别出现在1991年和1988年。不同栖息地毒螺检出率有统计学意义差异（P<0.01）。3类不同来源样品毒螺检出率及毒性也有统计学意义差异（P<0.05）。半褶织纹螺、红带织纹螺、正织纹螺带毒机率较高，且毒性强。检出织纹螺STX、GTX和TTX毒素。结论 宁波地区织纹螺毒素由TTX或贝类麻痹性毒素（PSP）中的STX和GTX组成，部分样品TTX和STX两种毒素共存。查清了宁波市织纹螺带毒情况、地域分布及织纹螺品种与毒性相关性。监测结果提示长期以来宁波市织纹螺总体保持一定的毒性，食用易引起中毒事件的发生。

关键词: 织纹螺  河豚鱼毒素  贝类麻痹性毒素

中图分类号： 文献标识码：A

Investigating the Toxicity Characteristics of Nassarius Sp. in Ningbo District

XU Jingye, Xu Guozhang, Ye Luming, QIN Pinzhang, HU Danbiao, YAN Peng, JIN Chunguang, YU Mei.

Ningbo Center for Disease control and prevention, Ning Bo  315010, China

Abstract：Objectives To study the type, distribution, the growth and decline of toxins in Nassarius Sp. and the source of toxins to acquire the basis for the control of Nassarius Sp. poisonings. Methods The toxicity of Nassarius Sp was detected by mouse bioassay. The saxitoxin (STX), gonyau toxin (GTX), and tetrodo toxin (TTX) were detected by ELISA and HPLC. Results Sixty-three poisonous Nassarius Sp. were identified in 127 samples collected from long-term monitoring sites. The detection rate was 49.6%. The detection rate of poisonous Nassarius Sp. was different in varies habitats (P<0.01).  The toxicity of Nassarius Sp. reached a peak in the year 1991 and hit the rock bottom in the year 1988.  The rate of carrying toxins and the toxicity of detected toxins (STX, GTX and TTX) in Nassarius semiplicatus, Nassa succincta A.Adams and Niotha livescens were high. Conclusion The toxins of Nassarius Sp. in Ningbo district were composed of TTX, STX or GTX, or both TTX and STX.  The surveillance proved that some toxins present in Nassarius Sp. in Ningbo district.  Poisoning could be caused by eating Nassarius Sp.

Key words: Nassarius Sp., Tetrodo toxin, Paralytic shellfish poisons

织纹螺中毒是所有海产品生物毒素中毒事件中，被公认对公共健康的冲击最大的^[1] ，由于织纹螺毒素的毒性强、发病快、死亡率高，且尚无特效药，为人们所关注。1978年宁波市首次证实了地产织纹螺能引起食物中毒^[2]，在以后的30多年中曾多次发生，死亡多人，已成为织纹螺中毒的常发地区。多年来宁波政府及有关部门明令禁止食用和销售织纹螺，但由于织纹螺味道鲜美，加上市民有长期食用习俗，仍有偷食织纹螺引起中毒的事件发生。虽然对织纹螺中毒的治疗、流行病学研究和预防进行了深入的研究，但对致人类严重的神经麻痹中毒症状的毒素有效成分了解甚少，为此，我们对织纹螺毒性特征进行研究，探索了解宁波地区有毒织纹螺毒素的类型、分布、消长及毒素来源等。

1 材料与方法

1.1长期监测点的设立

根据宁波市海域特征和织纹螺地域分布情况，选择地处甬江流域水系出海口的镇海区城关和中段的蟹浦；象山港流域水系出海口的北仑区新碶、高塘，以及象山港内陆段的宁海县西店、梅林和桥头湖，奉化市的桐照等地为长期监测点。

1.2 标本来源与采集

1986~2003年间，每年6~7月于上述监测点采集织纹螺样品为长期监测点样品；采自于象山县的织纹螺样品为新产螺点样品；由卫生监督所采集或缴获的分别为中毒样品和市场样品，采集时间、来源均为随机。

1.3 仪器与试剂

酶标仪、洗板机由奥地利ASYS HITCH提供；ELISA法定量STX测定试剂盒由德国R-Biopharm GmbH公司生产；Waters 1525高效液相色谱仪、Waters 2475双扫描荧光检测器由Waters公司提供；PCX5200柱后衍生仪由Sigma公司提供。

1.2 检测方法

1.2.1小鼠生物法测定贝类麻痹性毒素   样品的预处理参照出口贝类麻痹性贝类毒素（paralytic shellfish poisons，PSP）检验方法和AOAC中小鼠生物测试方法^[3-4]进行。经预实验后，将原液作适当稀释，取18~22g ICR种系小白鼠3只，分别腹腔注射1ml样品稀释液，若小鼠在5~7min内死亡，重复进行一次，取中间死亡时间，根据Sommer氏表查得相应的鼠单位（MU），换算成每100g肉中MU含量，以表示毒性的强度。

1.2.2 ELISA法石房蛤毒素定量测定  按AOAC方法萃取织纹螺麻痹性石房蛤毒素(saxitoxin，STX)，严格按试剂盒说明书进行检测，用STX标准液作曲线，在450nm波长下比色，以PSP浓度的半对数为X轴，吸光度为Y轴，绘制成曲线图，根据样品的A值查得STX（μg/100g肉含量）。

1.2.3高效液相色谱法（HPLC）检测STX、膝沟藻毒素（gonyau toxin，GTX）、河豚鱼毒素( tetrodo toxin，TTX) ^[5] 织纹螺去壳，取其肌肉和中肠腺400.0g，加入3倍体积的1%醋酸甲醇溶液，用高速组织捣碎机搅拌打碎5min，在4000r/min下离心10min，上清液到入真空旋转蒸发瓶中，残渣用上述方法重复提取3次后弃去。提取液在60℃下浓缩至近100ml。水层缓缓倒入已经活化的活性炭柱中进行吸附，柱滴速控制在2ml/min，待提取液全部过柱后滴至近干，用20%乙醇配制成含1%醋酸的解吸液50ml进行解吸，收集全部解吸液在40℃下氮气吹干，残留物用1mol/L氢氧化钠调节pH5.5的少量水溶解，倒入Bio-Gal P-2柱，用3000ml水洗涤1次，用2000ml的0.03mol/L甲酸洗脱，洗脱液在真空旋转蒸发器中60℃浓缩至干燥，残留物用少量水溶解，溶解物加入到GPC中，GPC柱换成Bio-Rex70，流动相以甲酸:水，程序梯度0~0.03mol/L甲酸运行30min（可以视85%毒素流出起始点调节），流速为0.5ml/min，收集第8~20min分割液，并采用冷冻干燥，最终用1%醋酸溶解定容至0.5ml，经0.45μ膜过滤脱气后上机测定，标准溶液做同样处理。

1.2.4 毒性判断标准  1个MU是使一只重20g的小鼠在15分钟内死亡所需腹腔注射的剂量。根据出口贝类麻痹性贝类毒素和美国FDA的贝类麻痹性毒素标准^[7]，每100g肉中PSP含量≥400MU则判为对人有毒害的毒螺，不可食用。PSP μg的计算：μg PSP/100g肉=中位数校正鼠单位（CMU）/ml×毒素转换系数（CF）×稀释倍数（DF）×200，每100g肉中PSP≥80μg则判为毒螺，HPLC TTX最低检出限为2.1μg，GTX最低检出限1.7μg，STX最低检出限4.2μg，并以此标准来判定本市织纹螺毒性强弱。

1.3 统计方法

用SPSS10.0软件统计数据，多组秩和检验分析其相关性与Χ²分析其差异的显著性。

2 结果

2.1宁波市织纹螺毒性

用小鼠生物法对宁波市不同区域的8个织纹螺栖息地进行了长期毒力监测，结果从127份织纹螺样品中检出毒螺63份，检出率49.61%；不同栖息地毒螺检出率分别是镇海区31.43%，北仑区39.29%，宁海县73.08%，奉化市25.00%；经统计分析，这4处栖息地的毒螺检出率有显著差异(X²=20.18>X²_0.01(3)=11.34，P<0.01)。象山未检出。为探讨不同织纹螺栖息地相关性，对18年连续监测结果进行秩和检验(多个样本均数比较)，4栖息地间差异有显著性；双变量相关分析(Kendall’s tau-b),奉化与宁海，奉化与镇海存在相关性(tau-b= 0.380，P<0.05；tau-b=0.507，P<0.05)。18年监测结果见表1，宁波市织纹螺各年度毒性见图1。

表1 长期监测点的织纹螺毒素含量

Table 1 Nassarius Sp. toxicity content in long-term inspecting spots    MU/100g肉

图 1   1986~2003年宁波市各年份织纹螺毒素平均毒性

Figure 1 Nassarius Sp. average toxicity in Ningbo City during 1986 to 2003

2.2 不同来源织纹螺毒性

从中毒样品、市场样品与新产螺点3类130份不同来源的织纹螺样品中，检出有毒的织纹螺37份，检出率为28.46%。中毒样品毒螺检出率最高，占毒螺的97.29%，其毒性也是最强的，检出的毒素含量最高达21 600MU/100g肉。而新产螺点样品中，均未检出有毒织纹螺，与其他样品比较差异有显著性(Χ²=86.743，P<0.05)，中毒样品与市场样品、新产螺点样品间差异有显著性(Χ²=62.215和44.609，P<0.05)，市场样品和新产螺点样品间差异无显著性(Χ²=0.562，P>0.05)，结果见表2。

表2    3种来源织纹螺样品的毒性分布及范围

Table 2 Nassarius Sp. toxicity distribution and range from 3 sources

样品名称	n	毒素含量范围 (MU/100g肉)	毒素平均量 (MU/100g肉)	毒螺份数	毒螺检出率 (%)
市场样品	54	175~488	186	1	0.77
中毒样品	46	175~21600	8560	36	27.7
新产螺点样品	30	175~182	178	0	0

2.3织纹螺品种与织纹螺毒性

由表3可见，采集不同来源的织纹螺样品，送宁波水产研究部门作织纹螺种类鉴定，结果为半褶织纹螺、红带织纹螺、正织纹螺、西格织纹螺（俗称小黄螺）等4个品种。长期监测点、中毒样品中以半褶织纹螺、红带织纹螺、正织纹螺为主；市场样品以西格织纹螺为多；新产螺点主要是半褶织纹螺和正织纹螺。毒性检测显示半褶织纹螺、红带织纹螺、正织纹螺携带毒素的机率较高，且毒性强，食物中毒主要以半褶织纹螺为多。30份从市场采集的西格织纹螺样品毒性检出结果在175~256MU/100g肉之间，均未检出毒螺。

表3 各种类织纹螺带毒情况

Table 3  Different Nassarius Sp. toxicity carring conditions

织纹螺种类	N	长期监测点		中毒样品		市场样品		新产螺点
		无毒	有毒	无毒	有毒	无毒	有毒	无毒	有毒
半褶织纹螺	68	10	16	4	20	4	1	15	0
红带织纹螺	26	2	1	2	1	12	0	12	0
正织纹螺	18	1	0	0	1	7	0	3	0
西格织纹螺	30	0	0	0	0	30	0	0	0
合计	142	13	17	6	22	53	1	30	0

2.4 STX毒素检测结果

由表4可见，对155份织纹螺样品用ELISA法进行STX定量测定，结果检出STX含量≥80μg/100g肉的毒螺有16份，带毒率为10.32%，与小鼠生物法测定51份检出有毒结果相比有较大的差别，两者结果见表4。

表4  ELISA测定STX和小鼠法测定PSP比较

Tabe 4  Comparing examining STX by ELISA with examining PSP by mouse bioassay

样品来源	ELISA法		小鼠生物法
	有毒	无毒	有毒	无毒
长期监测点样品	4	21	14	11
中毒样品	12	34	36	10
市场样品	0	54	1	53
新产螺点样品	0	30	0	30
合计	16	139	51	104

2.5 织纹螺中毒的地域分布

1986~2003年在宁波市辖11个县（市、区）中，有6个县（市、区）有织纹螺中毒报告，共发生21起，其中宁海中毒8起，食螺者38人，中毒20人，死亡8人；北仑区中毒7起，食螺者30人，中毒14人，死亡2人；奉化、鄞县、镇海、江东中毒6起，食螺者139人，中毒25人，死亡8人。研究发现，织纹螺中毒发生呈明显的地域特征，中毒几乎发生在临近海涂并盛产织纹螺的地区，按中毒起数依次排列为：宁海、北仑、奉化、鄞县和镇海。市中心老三区（江东、江北、海曙）不临近生长织纹螺的海涂，所以仅江东区发生1起，是由流入高毒力的织纹螺引起的小型暴发。有14起织纹螺中毒是由当地居民自捕自食引起的（66.66%），居民购买并食用织纹螺引起中毒仅7起（33.33%）。

2.6 织纹螺毒素成分

由表5可见，HPLC对15份小鼠生物法检测为有毒和36份无毒织纹螺进行毒素，结果从15份有毒织纹螺中确定14份有毒，其中检出PSP类毒素的STX和GTX 4份，检出率为26.67%，TTX毒素8份，检出率为53.33%，同份样品中同时检出STX和TTX两类毒素2份，检出率为13.33%，36份无毒织纹螺均未检出毒素，与小鼠生物法符合率为93.33%。

表5 HPLC、ELISA和小鼠生物法检测织纹螺毒素的结果

Table 5  Result of examining Nassarius Sp. toxicity by method of HPLC, ELISA and mouse bioassay

3讨论

3.1织纹螺的毒性

通过对多种来源的织纹螺样品检测，从257份织纹螺中检出有毒织纹螺100份，占总数的38.9%，由此可见，本市织纹螺带毒的严重性，食用该类食品极易发生中毒。研究发现有毒织纹螺的携带率以中毒样品为最高，长期监测点样品次之，市场样品和新产螺点样品最低，该结果与中毒发生规律相吻合；不同品种的织纹螺样品在毒性上也存在着差异，受检的半褶织纹螺、红带织纹螺、正织纹螺等大多检出毒性或较强毒性，而同科的西格织纹螺则未检出毒性，该结果与台湾、日本等地报道相一致^[6]。

3.2地域与织纹螺毒性

长期观察结果显示宁波市的织纹螺各年份总体上保持着一定的毒力，经秩和检验宁海、北仑、镇海、奉化4地的织纹螺毒性存在差别，镇海区织纹螺毒性在上升，奉化市织纹螺毒性在下降，其产生和消除是动态性的，消长曲线呈锯齿状，毒素的产生有高峰年份，也有回落的情况，无规律性和可预测性。说明其具有消长性，其毒力的强弱与地域环境等因素密切相关。从地域上分析，各长期监测点在地理位置上有较大差别，毒螺的检出上也存在差别，其检出率以宁海最高，北仑次之，镇海、奉化第三，象山最低。分析其原因，位于出海口的镇海、北仑、奉化由于水流急，海涂环境昼夜变化较大，有毒藻类易被冲散或稀释，再加上织纹螺自身的消长性分解，所以该几处的织纹螺虽被毒化但一直保持较低的毒性，而宁海则反之，致使织纹螺毒化时间长、积蓄量大，显示了较强的毒性。根据宁波市织纹螺毒性特征，可分为长期带毒的高带毒栖息地区（宁海），中带毒地区（镇海、北仑），低带毒地区（奉化）和无毒地区（象山），研究织纹螺毒性特征有助于查清毒素来源，探讨毒化的影响因素，有利于控制织纹螺中毒。对于织纹螺毒性的无规律性和不可预测性有进一步探讨的必要。

3.3织纹螺毒素来源

织纹螺毒素的来源至今尚未明确。国内外学者认为织纹螺本身无毒性、可食。本市沿海地区居民历来就有食用习惯也可证明这一点。织纹螺的毒素来源与其生存的食物链相关，是通过摄食这些有毒藻类和产毒细菌等，在自身的滤过性作用下，浓缩并积蓄在体内，使螺体带毒，据调查宁波市沿海有毒织纹螺系受毒化所致^[7]。织纹螺的PSP毒素与邻近海域环境的恶化和“赤潮”中有毒藻类有关^[8]，在我国海域已报道存在产STX和GTX等PSP毒素的毒藻，塔玛亚历山大藻（Alexandrium. tamarense）、微小亚历山大藻（Alexandrium. miutum）、链状亚历山大藻(Alexandrium.catenella) 和链状裸甲藻（Gymnodinium catenatum）等多种^[9]。宁波市地处东海是我国近岸型“赤潮”多发区域，象山港及尾部又是受“赤潮”灾害的重点地区，其水体交换差、富营养化严重及气候环境等条件适宜“赤潮”有毒生物的生存，使宁海地区织纹螺长期带毒。结果间接证实了本市织纹螺毒性与“赤潮”有毒藻类生物的相关性，且毒性的差异与地域有一定的关联性，进一步诠释了本地织纹螺毒性主要源自环境。1999~2003年镇海区蟹浦监测点织纹螺毒力呈现持续升高，该地区的织纹螺平均毒性与宁海不相上下，查相关资料证实期间当地海域虽受“赤潮”的侵袭，存在有毒赤潮生物种类，但均未检出赤潮毒素，同时也未造成大面积养殖水产品死亡，而全市其他监测点的织纹螺毒性也无明显的反跳现象发生，由此可见织纹螺的毒素来源并不是单一的“赤潮”有毒藻类生物，本次从纹螺中检出TTX及其衍生物，结果证实宁波地区的织纹螺已受到TTX污染。有报道认为，TTX毒素来源于海洋放线菌等^[10],通过摄食河豚鱼尸体、卵或摄食环境中产毒细菌，甚至与产毒细菌共存这种毒化织纹螺的途径^[11]，同时，也不能排除织纹螺自身产生某些毒素的可能性^[12]，值得我们关注,其在织纹螺体内形成积蓄的机理有待于我们进一步研究探讨。

3.4 织纹螺毒素成分分析

对织纹螺毒素的成分研究报道甚少，由于中毒症状与PSP相似，长期以来国内外学者认为织纹螺毒素就是PSP，而PSP的主要成份是STX，包括了STX1-4及GXT等近20种衍生物，是一类烷基氢化嘌呤化合物，类似于具有两个胍基的嘌呤核，其基本结构为多叠六元环，致病的活性基团是7、8、9位的胍基及附近C₁₂位的羟基^[13]。本研究用STX试剂盒检测织纹螺毒素，检出带STX的毒螺16份，检出率为10.32%，小鼠生物测法检出毒螺51份，检出率33.54%，两上符合率仅为29.58%，STX毒螺检出率明显低于小鼠生物测法，表明织纹螺毒性物质中除STX外，尚存在其他麻痹性毒素。进一步分析发现，样品中TTX及其衍生物含量较高，STX和GTX相对较低，说明宁波市织纹螺中毒素以TTX为主，进一步诠释了宁波市织纹螺中毒潜伏期长的问题。

参考文献

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