青年科学工作者论坛2011年第3期

红细胞膜带3蛋白水平与中老年人生理状况相关分析

常文露  孙永叶 汪求真 杜卫 吴学谦 马爱国¹

青岛大学医学院营养研究所，青岛 266021

摘要：目的 本研究通过对红细胞膜带3蛋白水平与中老年人生理状况相关因素关系的分析，了解带3蛋白在不同生理状态下表达的差异。方法 采取整群随机抽样的方法收集中老年人体检资料及血样218例，其中男性80例，女性138例。制备红细胞膜，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分析红细胞膜带3蛋白水平。不同分组间带3蛋白水平的比较采用独立样本t检验或方差分析，相关回归分析采用Pearson 相关和线性回归。结果 红细胞膜带3蛋白水平与体力活动水平（r=0.149）呈正相关（P＜0.05），与收缩压（r=-0.156）呈负相关（P＜0.05）。带3蛋白水平与性别、年龄、BMI、舒张压无相关关系（P值均＞0.05）。中等体力活动者带3蛋白含量为24.09%，明显高于轻体力活动者23.42%(P＜0.05)。收缩压升高者带3蛋白含量为23.33%，明显低于正常人水平24.20%(P＜0.05)。结论 带3蛋白水平的升高伴随着体力活动的增加和收缩压的降低。

关键词:红细胞膜 带3蛋白 中老年人 收缩压 体力活动

中图分类号： 文献标识码：A

Correlation of band 3 protein in erythrocytes with physiological status of middle-aged and elderly people

Chang Wenlu , Sun Yongye , Wang Qiuzhen , Du Wei , Wu Xueqian , Ma Aigou

Institute of Nutrition Research；Qingdao University Medical College；Qingdao 266021

ABSTRACT : Objective To analyze the correlation of band 3 protein of erythrocytes with physiological conditions of middle-aged and elderly people, and to investigate the expression of band 3 protein under different physiological status. Methods Cluster randomized sampling method for selecting subjects .Physical examination data and blood samples of 218 middle-aged and elderly people (80 males and 138 females) were collected.  SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was used to analyze band 3 protein in erythrocyte membrane.  The difference of band 3 protein in different groups was analyzed by T Test and One-Way ANOVA.  Correlation and regression of band 3 protein with physiological status was analyzed by Pearson correlation and linear regression. Results There was a significantly positive correlation（r=0.149）between the level of band 3 protein and physical activity (P＜0.05), and a negative correlation（r=-0.156）between the level of band 3 protein and systolic blood pressure (P＜0.05). The correlation of band 3 protein with gender, age, BMI and diastolic blood pressure（P＞0.05) is not significant. The band 3 protein level of workers with medium activity was 24.09%, which was significantly higher than that of light activity workers (23.42%) (P＜0.05). The subjects with hypertension were proved to have a significantly lower level of band 3 protein (23.33%) than normal individuals (24.20%) (P＜0.05). Conclusions The level of band 3 protein was positively correlated with physical activity and negatively correlated with systolic blood pressure.

KEY WORDS Erythrocyte membrane；Band 3 protein；Middle-aged and elderly people； Systolic blood pressure；Physical activity

带3蛋白（band 3 protein）是红细胞膜上含量最为丰富的蛋白质，约占膜蛋白含量的25%^[1]，其主要介导Cl^-/HCO₃^- 的跨膜转运，故又称阴离子交换蛋白1(anion exchanger，AE1)。每个红细胞膜上约有10⁶个拷贝^[1-2] ，它的分子量约为101kD，由911个氨基酸组成，属于阴离子交换蛋白家族中的一员。近十几年来，国内外对于带3蛋白的结构与功能的研究日益深入。带3蛋白有以下生理功能，（1）参与Cl^–/HCO₃^–交换，（2）参与O₂与CO₂的运输，（3）维持红细胞的形态，（4）参与红细胞内的糖酵解调节。另外，带3蛋白可以识别和清除衰老红细胞，对血型的决定也十分重要，最新的研究结果表明带3蛋白参与细胞增殖和凋亡过程^[3]。运动与氧化应激、红细胞膜流动性以及红细胞功能有密切相关，因此，我们推测体力活动与红细胞膜带3蛋白关系密切。红细胞膜带3蛋白水平与衰老的关系，国内外研究甚少，周翔等^[4]的研究结果显示血清和组织中过氧化脂质含量随着年龄的增长而增加，脂质过氧化反应对细胞膜和亚细胞器有损伤作用。有研究证明高血压患者红细胞变形能力降低^[5]、红细胞膜流动性下降，但高血压时是否存在带3蛋白的变化及其变化机制有待于我们进一步研究。为深入了解体力活动、年龄、血压对红细胞膜带3蛋白的变化的影响，我们通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对中老年人红细胞膜蛋白进行分析，探讨在不同的生理状态下带3蛋白水平的变化。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

采取整群随机抽样的方法，在受检者签署知情同意书的情况下，以调查问卷的形式收集莱西市夏各庄45岁以上中老年人体检资料和血样（由当地医生抽取）218例，其中，男性80例，占总数36.7%，女性138例，占总数63.3%。年龄45～100岁，平均年龄为65.41岁。

1.2 调查及检测方法

1.2.1 一般情况 采用问卷的形式记录受检者的性别、年龄、活动水平。年龄每10岁为一组，即40~49，50~59，60~69等。活动水平按照中国营养学会推荐标准分为以下3组：轻体力劳动为75%时间坐或站立，25%的时间站着活动，如办公室工作或售货员等；中等体力劳动为25%时间坐或站立，75%时间特殊活动，如电工安装、机动车驾驶或车床操作等；重体力劳动为40%时间坐或站立，60%的时间从事特殊职业活动，如体育运动、舞蹈或炼钢等。

1.2.2 体格检查 测量受检者的身高、称量体重并计算出BMI；测量血压。身高、体重的测量方法按照《中国成人超重和肥胖症预防控制指南（试行）》。根据国际生命科学学会中国办事处中国肥胖问题工作组提出的标准，BMI分为：＜18.5是体重过低，18.5~23.9为正常体重，24.0~27.9为超重，≥28为肥胖。血压测定标准：收缩压（SBP）≥140mmHg和（或）舒张压（DBP）≥90mmHg为高血压^[6]。

1.3 实验方法

1.3.1 实验仪器 电子天平（精确度为万分之一），Sigma冷冻高速离心机（3K30），迷你双垂直电泳槽（DYCZ-24D），双稳定时电泳仪（DYY-6C），微量加样器，EPSON生物图像分析系统（perfection 4990 PHOTO）等。

1.3.2 实验步骤

1.3.2.1制备凝胶 （1）准备玻璃板，洗净晾干。将一个"U"型的硅橡胶带夹在两块长短不一的玻璃片中间，玻璃片之间形成一个2~3mm厚的间隙，制胶时，将胶灌入其中。按表1配制7%分离胶溶液。

表1  凝胶溶液配制成分表

Table 1  Ingredients of gelatin solution

溶液成分	7%分离胶溶液（ml）	5%浓缩胶溶液（ml）
30%凝胶贮备液	2.3	-
10%凝胶贮备液	-	2.5
3.0mol/L Tris-HCl缓冲液	1.25	-
0.5mol/L Tris-HCl缓冲液	-	1.25
10% SDS	0.1	0.05
1% TEMED	0.8	0.4
蒸馏水	5.45	0.75
10%过硫酸铵溶液	0.1	0.05
总体积	10.0	5.0

（2）小心将分离胶注入备好的玻璃间隙中，高度距玻璃板上缘约2cm。轻轻在顶层加入几毫升去离子水，以阻止空气中的氧对凝胶聚合的抑制作用。室温下放置30分钟左右，使其完全聚合凝固，用滤纸吸干凝胶顶层的水。

（3）按表1配制好5%浓缩胶溶液，以连续平稳的流速注入分离胶上端，至玻璃板的顶端，插入梳子。以上整个过程应小心避免产生气泡。

1.3.2.2点样（1）红细胞膜制备  采集受试对象新鲜肝素抗凝血，采用低渗破膜法制备红细胞膜样本：取新鲜血液1ml，4℃下以3000r/min分离心10分钟，使红细胞沉淀后，用吸管小心吸尽血浆及沉淀在红细胞表层的绒毛状沉淀层。用PBS缓冲液（4℃）稀释红细胞沉淀，离心（3000r/min×10min），弃上清液及沉淀在红细胞表层的白细胞、血小板等，得下层的红细胞沉淀。如此重复3次。红细胞沉淀物中按1:10比例加入预冷的pH7.4，10mmol/L的Tris-HCl缓冲液，摇匀，使之悬浮溶血，置于4℃冰箱中1~2小时，使之完全溶血。然后于4℃，12000r/min离心10min，重复洗涤离心3~5次得乳白色RBC膜悬液。将最后一次离心所得到的红细胞悬浮在2~4ml pH 7.4的等渗PBS缓冲液中。用相差显微镜检查膜样品是否纯净^[7]。膜蛋白含量的测定采用Lowry法^[8]。（2）将洗好的红细胞膜与2倍样品缓冲液等体积混匀，一起100℃水浴加热3min。（3）浓缩胶聚合后，小心拔去梳子，将凝胶放入电泳槽上，在上下槽中加入电泳缓冲液，并用电泳缓冲液冲洗梳孔，注意缓冲液与凝胶两端不要有气泡，气体可用尖端弯曲的滴管排出。（4）将制备好的样品混合液加入梳孔中。样品每孔加样20ml，做好标记和记录。

1.3.2.3电泳  起始电压为20V，当染料全部进入分离胶后，将电压调至80V，继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部，距下端约1cm时关闭电源，停止电泳。

1.3.2.4染色 卸下电泳胶板，用刮勺小心撬开玻璃板，使两者分离。切去浓缩胶，将分离胶用蒸馏水冲到染色缸内，可任切一小角，对整块凝胶进行方位标记。倒掉蒸馏水，量取溴酚蓝迁移距离后，将凝胶浸泡于考马斯亮蓝染色液中4～5个小时。

1.3.2.5脱色 取出凝胶，用水漂洗几次，然后加入脱色液，根据情况更换数次脱色液，脱色至背景透明，条带显示清楚。

1.3.2.6扫描、定量分析 利用Quick Scan生物图像分析系统扫描凝胶（图1），运用EPSON生物图像分析系统分析扫描凝胶图像中红细胞膜中带3蛋白相对与红细胞膜总蛋白的百分含量（%）（图2）。

图1  红细胞膜蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图

Figure 1  SDS - polyacrylamide gel electrophoresis of erythrocyte membrane protein

图2  红细胞膜蛋白电泳扫描图谱

Figure 2  Electrophoresis scanning map of erythrocyte membrane protein

1.4 统计学分析

数据均采用SPSS 11.0统计软件进行分析。经SPSS分析样本均来自正态分布总体且方差齐同。各指标分组之间带3蛋白水平的关系均用±s表示。其中性别、血压、收缩压、舒张压各分组间与带3蛋白水平的关系均为两组均数之间差别的比较，采用独立样本t检验。年龄、BMI与带3蛋白水平的关系均为两组以上均数之间差别的比较，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）。相关回归分析均采用Pearson相关分析和线性回归。以上所有检验将P＜0.05定为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 受检者年龄、性别及活动水平与带3蛋白水平相关分析

由表2可见，受检者基本情况中男、女之间，不同年龄组之间之间的带3蛋白水平未见明显差异（P＞0.05）。不同体力活动水平带3蛋白水平不同，中等体力活动带3蛋白水平为24.09%，明显高于轻体力活动水平23.42%(P＜0.05)。

表2 年龄、性别及活动水平与带3蛋白水平的关系

Table 2  Relationship between age,gender,activity level and band 3 protein levels

注：(1)与轻体力活动组比较,P＜0.05

相关分析显示性别与带3蛋白水平呈正相关，r=0.001,无统计学意义（P=0.986）。年龄与带3蛋白水平均呈负相关，r=-0.090,无统计学意义（P=0.184）活动水平与带3蛋白水平呈正相关，即随着活动水平的增加带3蛋白水平升高，其相关系数r=0.149（P=0.030）。

2.2 BMI水平及血压与带3蛋白水平相关分析

由表3可见，BMI值超重者占全部受检人群16.06%，肥胖者占6.88%。高血压率为71.10%，收缩压与舒张压升高者占总体的61.47%和53.70%。

高血压患者（收缩压+舒张压）带3蛋白水平为23.42%明显低于血压正常者24.25%（P＜0.05）、单纯收缩压升高者带3蛋白水平为23.33%低于正常者24.20%（P＜0.05）。 受检者BMI值、高血压患者（收缩压+舒张压）、舒张压各个分组之间带3蛋白水平的差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 BMI水平及血压与带3蛋白水平的关系

Table 3 Relationship between BMI, blood pressure and band 3 protein

注：（1）与正常组比较P＜0.05，（2）与正常组比较P＜0.05

相关分析显示BMI与带3蛋白水平呈正相关，r=0.138,无统计学意义（P=0.155）。舒张压与带3蛋白水平均呈负相关，r=-0.108,无统计学意义（P=0.116）。收缩压与带3蛋白水平呈负相关，即随着收缩压的升高带3蛋白水平降低，相关系数r=-0.156，有统计学意义（P=0.023)，其回归方程Y=-0.0142X+25.712。对收缩压做相关性分析如图3。

Figure 3  Negative correlation between band 3 protein and systolic blood pressure

3 讨论

在人红细胞膜上，带3蛋白是含量最丰富的蛋白质，由于带3蛋白的重要生理作用以及和多种疾病的发生相关，而被公认为细胞膜上最重要的蛋白质。本研究运用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分析中老年体检者红细胞带3蛋白水平，通过对中老年人体检的生理指标检查与带3蛋白水平关系的分析，了解到带3蛋白的水平随着生理状态的改变而改变。

本研究结果提示带3蛋白水平随着活动水平的增加而升高，中等体力活动带3蛋白水平为24.09%，明显高于轻体力活动水平23.42%。体力活动过程中机体对氧的需求增加，同时刺激机体产生大量自由基，运动的能量消耗与机体抗氧化能力密切相关，随着体力活动能耗的增加机体抗氧化酶如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶等的活性增强，它们足以清除运动过程中产生的自由基，减轻在运动过程中引起的生物膜脂质过氧化损伤，红细胞膜受损相对减轻，因此，随着体力活动的增加红细胞膜带3蛋白水平升高。国内外对体力活动与红细胞膜关系的研究较少，对有氧运动的研究较多，有研究证明，有氧运动的增加可明显降低体内脂质过氧化反应，增强机体清除自由基的能力，降低自由基对人体的危害^[3]，此时红细胞膜也会发生相应变化，红细胞膜受损相对减轻，带3蛋白水平升高^[9]，这与我们的研究结果一致。

收缩压就是当心室收缩射血时，动脉血压迅速升高，在心室收缩的中期，血压所达到的最高值。临床观察发现，随着年龄增长而表现的单纯收缩压增高，更易发生中风和冠脉急性事件。在50岁以上的成人，收缩压超过140mmHg，是比舒张压升高更为重要的心血管病危险因素^[10]。国内外对血压与带3蛋白水平关系的研究甚少。本研究结果显示，单纯收缩压升高者带3蛋白水平为23.33%低于正常者24.20%。收缩压和舒张压与带3蛋白水平均呈负相关。原发性高血压、各种继发性高血压患者均存在氧化应激增强，体内生成过量的活性氧簇( reactive oxygen species, ROS)，与此同时体内抗氧化酶含量降低且活性下降，如SOD、谷胱甘肽氧化酶、过氧化氢酶，血液中抗氧化维生素如A、C和E水平下降，氧化程度超出抗氧化的能力，体内氧化与抗氧化作用失衡使得机体脂质过氧化反应增强，包括红细胞膜在内的生物膜受自由基攻击发生氧化损伤，红细胞膜蛋白诸如带3蛋白、带4.1蛋白、锚蛋白等成为首要攻击的靶点，发生降解^[11]，带3蛋白水平下降。

年龄、肥胖程度与人体生理状况有着密切的关系，本研究结果显示，带3蛋白水平与年龄、肥胖程度等无相关关系。许多研究表明，带3蛋白与体内氧化应激水平有着密切的关系，随着体内氧化应激水平的增强，红细胞膜蛋白的巯基在脂质过氧化作用下被氧化后，蛋白发生交联，易被降解^[12]，带3蛋白水平下降。随着年龄的增加，机体在新陈代谢过程中不断地产生自由基，体内诸如维生素E等抗自由基脂质过氧化作用的物质逐渐减少，自由基不能及时有效地清除，在体内发生堆积，引起细胞膜、线粒体等氧化损伤^[13]。我们的研究结果显示年龄与带3蛋白呈现一定的负相关趋势（r=-0.09）但无统计学意义，考虑到我们的研究对象为大样本，虽没有显著性但此结果有一定意义。肥胖患者体内氧化应激、脂肪细胞因子水平和激素发生改变，如血浆超氧化物歧化酶（SOD）、脂联素较正常人降低，血清丙二醛（MDA）、瘦素升高^[14]，雌激素水平升高。其中，SOD 水平的降低和MDA水平的升高是体内氧化应激水平升高的标志，但与此同时有研究证明雌激素具有抗氧化特性，它通过影响ERK、p38的磷酸化过程保护脂质生物膜免受活性氧的攻击^[15]。因此，我们研究显示肥胖与红细胞膜带3蛋白无明显相关关系。

综上所述，带3蛋白与人体生理状态密切相关。本研究显示，带3蛋白水平与体力活动、收缩压的水平密切相关，即随着有氧活动的增加带3蛋白水平升高，随着收缩压的升高带3蛋白水平下降。当机体生理状态发生改变时，带3蛋白的水平和结构也在发生着变化。近年来，国内外有关带3蛋白和疾病关系的研究日益增多，但是大样本量的生理状况检查并分析其与带3蛋白关系的研究尚未见报道。本研究对带3蛋白水平与人体生理状态的关系进行了初步的分析探讨，为带3蛋白检测技术发展成为重要的生理与健康状况的评价指标提供了重要的科学依据。

参考文献

1  LOW P S.Structure and function of the cytoplasmic domain of band 3:center   of erythrocyte membrane-peripheral protein interactions[J].Biochim Biophys Acta，1986,864(2):145-167.

2  STECK T L，KANT J A.The band 3 protein of the human red cell membrane:a review[J].J Supramol Struct，1978,8(3):311-324.

3  AKEL A，WAGNER C A，KOVACIKOVA J.Enhanced suicidal death of erythrocytes  from gene-targeted mice lacking the Cl-/HCO3- exchanger AE1[J].Am J Physiol Cell Physiol，2007 ,292(5):C1759-1767.

4  姜招峰，周翔.老年大鼠自由基代谢的研究[J].老年学杂志，1990,10(5):308-309.

5  龚侃，杨美英，任秋萍,等.老年高血压病患者红细胞变形能力与LPO、血浆SC5b-9水平的关系[J].心脏杂志，2002,14(5)：415-416.

6  中国高血压防治指南修订委员会. 2004 年中国高血压防治指南(实用本)[J] .  高血压杂志,2004,12(12):483-486.

7  张龙翔，张庭芳，李令媛.生化试验方法和技术[M].北京：高等教育出版社，1997,7:11-14.

8  LOWRY O H，ROSEBROUGH N J, FARR A L， et al. Protein measurement with the Folin phemol reagent[J].J Biol Chem,1951,193(1):265-275.

9  李开刚，冯连世，洪平,等.大强度训练及回复后大鼠红细胞膜蛋白的变化[J].中国运动医学杂志，2001,20（3）：244-247.

10 何秉贤.保持心脏健康的途径[J].心血管病防治知识,2008,5:28.

11 任绪义，张建鹏.红细胞膜锚蛋白研究进展[J].国外医学输血及血液学分册，2007,25(3):198-199.

12 潘孝贵，崔小珠，陈文鹤.红细胞膜带3蛋白与运动研究展望[J].天津体育学院学报，2002,17（1）：52-54.

13 范徳义，石华英，肖菊荣.血浆维生素E水平与原发性高血压、脑梗死及年龄的关系[J].中国医师进修杂志，2008,31(2):24-26.

14 沈兴平、邹森彪、吴豪杰,等.肥胖患者氧化应激和脂肪细胞因子变化[J].细胞与分子免疫学杂志,2008,24(7):721-724.

15 裴新，陆地，周宇冠,等.雌激素对H₂O₂诱导PCl2细胞氧化应激的保护作用研究[J].云南大学学报，2010,32（5）：608-612.