达能营养中心第五届学术研讨会论文集
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贾青 阴文娅 黄承钰 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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关键词：酶—重量法 膳食纤维 食物 摄入量 中图分类号：R151.3 文献标识码：A Determination of total dietary fiber in food and food products of Tibetan by enzymatic－gravimetric method Jia Qing, Yin Wenya, Huang Chengyu Department of Nutrition and Food Hygiene, School of Public Health, Sichuan University , Chengdu 610041，China Abstract: In order to establishing accurate and appropriate Dietary Reference Intakes (DRIs) of dietary fiber for Chinese residents, a phosphate buffer enzymatic－gravimetric method adopted by AOAC was established in our laboratory. On the basis of dietary survey and body metabolism balance experimentation, representative cereals and vegetables of Tibetan were collected and fruits and flavorings were purchased. The total dietary fiber (TDF, g/100g edible part) of 13 samples successively were: lobster sauce 14.21, red pepper sauce 9.69, rye flour 8.19, wheat flour 5.81, banana 4.26, potato 3.70, dough slice 2.71, apple 2.11, rice 1.29, lettuce 0.93, white melon 1.12, radish 1.19, cabbage 0.98. The results indicated that the method can be determined for TDF in several kinds of food. The values were higher by this method than that by neutral detergent method. The relative standard deviation (RSD) ranged from 1.55％ to 5.10 ％. The repeatability was good , and the method are suitable for many foods. The intake of TDF was 23 g/d for Tibetan male adults, cereals and vegetables accounting for 65.6％ and 34.4％ respectively. So increasing intake of fruits and beans and bean products was quite essential for rational nutrition to them. Key words: enzymatic－gravimetric method , dietary fiber , food , intake 膳食纤维按其溶解性分为可溶性膳食纤维（Soluble dietary fiber, SDF）和不可溶性膳食纤维 (Insoluble dietary fiber, IDF) 。根据AACC 2000年6月的最新定义：膳食纤维系指植物性食物的可食部或在人体小肠内不能被消化吸收而能够在大肠内完全或部分被发酵的碳水化合物类似物，包括多糖、单糖、木质素和相关植物成分，它能促进有利的生理效应如润肠通便、降低血胆固醇浓度和血糖浓度[1]。最近，学者又将抗性淀粉（Resistant Starch）、低聚果糖（Oligofructose）、菊粉（Inulin）、甲壳素（Chitin）等成分也归入膳食纤维范畴。目前，膳食纤维的测定方法可分为两大类：重量法和成分分析法。重量法是一种常规的膳食纤维分析法，可以测定总膳食纤维（Total dietary fiber, TDF）、可溶性膳食纤维和不可溶性膳食纤维，成分分析法则可以定量分析其中每一种中性糖和总的酸性糖（糖醛酸）[2]。 膳食纤维重量法有传统的粗纤维法、酸性洗涤剂法和中性洗涤剂法以及近期发展起来的酶—重量法。粗纤维法损失了大部分的不可溶性膳食纤维和全部的可溶性膳食纤维，其含量远低于真正的总膳食纤维；酸性洗涤剂法只能测定纤维素和木质素[2]；中性洗涤剂法只能测定不可溶性膳食纤维，所测数值与总膳食纤维含量有较大差异，两者之间可计算一个较粗略的换算系数[3]。为了制定准确的适合我国居民的膳食纤维参考摄入量，迫切需要建立新的检测方法。酶—重量法是当前国际上广泛采用并被AOAC认可的方法，在国内尚处于起步阶段。本文采用酶—重量法测定藏族代表性食物中总膳食纤维，并与中性洗涤剂法比较，提供食物总膳食纤维的参考数据，进而计算藏族成年男子总膳食纤维的实测摄入量。 1 材料和方法 1.1 原理 准确称取双份样品，分别用耐热α－淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶酶解样品以去除淀粉和蛋白质，酶解后的样品用乙醇沉淀，将过滤的残渣用乙醇和丙酮冲洗，干燥后称重。通过校正残渣中蛋白质和灰分含量即得总膳食纤维（TDF）含量。 1.2 仪器 膳食纤维测定仪（包括水浴摇床和过滤系统）、Kjeltec 2200自动蒸馏仪（瑞典Foss Tecator公司），电阻炉，天平（0.1mg），干燥箱，干燥器。 1.3 试剂 耐热α－淀粉酶溶液：cat No .A3306；蛋白酶：cat No. A3910, 当天用磷酸缓冲液配制成50mg/ml的蛋白酶溶液；葡萄糖苷酶溶液：cat No .AMG A9913；硅藻土：Celite 545AW, No.C8656, 以上试剂均来自Sigma公司。磷酸缓冲液：0.08 mol/L, pH值为6.0±0.2；乙醇、丙酮均为分析纯；试验用水均为去离子水。 1.4 样品收集 1.4.1 谷类和蔬菜 选取四川世居地藏族居民30户（要求：住户全家为藏族，住户家中至少有一名18 ～ 50周岁的成年男子），采用称重法和24小时回忆法相结合，进行3日膳食调查，确定藏族成年男子的代表性膳食的食物种类和数量，编制3日食谱。从某藏文学校选择15名藏族健康成年男性志愿者参加人体代谢平衡试验，试验期共14天，分为适应期（第1天～第3天）、正式试验期（第4天～第12天）和试验后期（第13天～第14天）。在试验期间，专门到藏族住地购买食物，请藏族师傅按设计的食谱为受试者制备试验膳，试验膳每3天一次循环，要求受试者尽量吃完副食，主食可任意食用。在9天正式试验期间，进食前、后精确称重食物，计算每个受试者净食物摄入量，并按双份饭法收集食物样品。 1.4.2 水果和调味品 购自成都某超市。 1.5 测定步骤 1.5.1 样品制备固体样品 若样品粒度>0.5mm，研磨后过40～60目筛。高脂肪样品：若脂肪含量>10％，用石油醚（25ml/g)去除脂肪，洗3次。高碳水化合物样品：若碳水化合物含量>50％，用85％乙醇（10ml/g)去除糖分，洗3次，然后在40℃干燥箱中干燥过夜。 1.5.2 酶解处理 称取双份（1.000±0.005)g样品（精确至0.1mg)于膳食纤维测定专用孵瓶中，加入50ml磷酸缓冲液，搅拌至样品完全分散。 加入100μl耐热α－淀粉酶，盖上铝箔，低速搅拌，80℃水浴30min，移出孵瓶，冷却至60℃，用刮勺将孵瓶边缘的网状物以及底部的胶状物刮离，使样品完全酶解，并用蒸馏水冲洗孵瓶壁和刮勺。 加入0.275mol/L的NaOH调整pH至7.5±0.2,加入100μl蛋白酶溶液，盖上铝箔，60℃持续摇荡，水浴30min。 移去铝箔，60℃下加入0.325mol/L的HCl调整pH至4.0～4.7。搅拌，同时加入100μl萄葡糖苷酶溶液，盖上铝箔，60℃持续摇荡，水浴30min。 1.5.3 过滤 在每份样品中加入预热至60℃的95％乙醇，乙醇与样品的体积比为4∶1。室温沉淀1h。用15ml 78％乙醇将硅藻土润湿和重新分布在预先称重的坩埚中。抽吸硅藻土使之形成平整的过滤层。用78 ％乙醇和刮勺转移所有内容物微粒到坩埚中，分别用15ml的78％乙醇、95％乙醇和丙酮冲洗残渣各2次。105℃干燥坩埚5h，将坩埚置干燥器中冷却1h至室温后称重，精确至0.1mg。用其值减去坩埚和硅藻土的干重，即得残渣重。 1.5.4 蛋白质和灰分的测定 取双份样中的一份残渣用自动蒸馏仪测定蛋白质；另一份残渣置电阻炉中525℃灼烧5h，在干燥器中冷却1h至室温后称重，精确至0.1mg。用其值减去坩埚和硅藻土的干重，即得灰份重。 1.6 计算 1.6.1 总膳食纤维（TDF,g/100g）={[（R1＋R2）/2]－P－A}/[（M1＋M2）/2]×100 R1、R2：双份样品残渣质量 P、A：分别为蛋白质和灰分质量 M1、M2：双份样品质量 1.6.2 用Microsoft EXCEL 2000进行数据统计分析。 2 结果 2.1 精密度 以糌粑、白萝卜和大白菜为代表性样品，采用同样方法分别测定3次，每次测定6个平行样，结果见表1。 表1 代表性样品总膳食纤维的测定相对标准偏差
由表1结果可知该方法精密度高，重现性好。 2.2 测定结果 13个样品的测定结果见表2，豆豉、辣椒酱、糌粑和小麦粉的含量较高；莴笋、白瓜、白萝卜和大白菜的含量较低。表2同时列出了中性洗涤剂法及国外文献报道结果，中性洗涤剂法的数据来自食物成分表[4]，国外文献报道是干燥后的样品测定结果。 表2 测定结果及相关比较 g/100g食部
注：(1)括号内数值为干品含量; 稻米和糌粑以干品测定，大白菜和苹果以鲜品测定 ，折算所需水分含量查食物成分表。 由表2可知，酶—重量法所测值高于中性洗涤剂法；将用本方法测定干品含量与国外文献报道相比，基本接近。 2.3 实测摄入量 根据食物总膳食纤维含量、生熟比和受试者平均每人每日熟食摄入量即可计算藏族成年男子每人每日总膳食纤维摄入量，结果见表3，藏族成年男子平均每人每日总膳食纤维的实测摄入量为23g。 表3 藏族成年男子总膳食纤维摄入量(1)
注：(1)糌粑的TDF含量以熟食计，其余食物的TDF含量以生食计 3 讨论 3.1 测定方法 实验发现酶解过程至关重要。方法建立初期曾选用国产酶代替上述三种酶，未得到稳定结果，特别是耐热α－淀粉酶与国产酶有较大不同，该酶能在高温下保持酶活力不变，而国产酶经高温失活，不能完全去除淀粉；此外，国产蛋白酶和葡萄糖苷酶的纯度较低，不能彻底酶解蛋白质和淀粉，造成测定结果偏高。因此，上述三种酶不能轻易代替。 准确称重也是该方法的关键环节，干燥及灰化后的称重必须是将坩埚置于干燥器中冷却1h至室温立即进行, 否则称重结果将产生较大误差从而影响样品批间和批内的相对标准偏差。 酶－重量法有操作方便、重现性好等优点，可以分析谷类、蔬菜、水果、豆类及豆制品和保健食品，经过改良以后可以测定可溶性膳食纤维和不可溶性膳食纤维，满足食品标签对膳食纤维含量的要求。但仪器和试剂成本高，故本实验室尚未在较短时间内测定样品的可溶性膳食纤维和不可溶性膳食纤维。 本测定没有加标准品做回收试验来验证方法的准确度，目前也尚未见加标测定的文献报道，国外报道主要通过实验室间和实验室内的重现性加以验证。与杨晓莉等的报道一致[8]，经空白试验发现空白含量极低，故本次测定去除了空白测定。 3.2 总膳食纤维的实测摄入量 美国FDA推荐的总膳食纤维摄入量为20 ～ 35 g/d，英国国家顾问委员会建议的总膳食纤维摄入量为25 ～ 30 g /d，亚洲营养学者认为总膳食纤维摄入量以24 g/d为宜[3]。本研究表明，23 g/d的总膳食纤维摄入量为制定藏族成年男子的膳食纤维参考摄入量提供了可靠的有意义的依据。由表3可知，总膳食纤维实测摄入量仅由谷类和蔬菜提供，分别占总摄入量的65.6％和34.4％，因此，在谷类和蔬菜基础上适当增加水果和豆类及豆制品的摄入对藏族成年男子的合理营养是非常有必要的。 4 参考文献 1 Prosky L.Dietary fiber. J AOAC Int，2001，84：222 2 Ziegler EE, Filer LJ. 现代营养学.见：闻芝梅，陈君石等译.第7版. 北京：人民卫生出版社，1998，86—87 3 中国营养学会.中国居民膳食营养素参考摄入量. 北京：中国轻工业出版社，2000，395—396 4 中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所.食物成分表. 北京：人民卫生出版社，1991，2 5 Mongeau R, Brassard R. Enzymatic－gravimetric determination in foods of dietary fiber as sum of insoluble dietary and soluble fiber fractions: summary of collaborative study. J AOAC Int,1993,76：923—925 6 Prosky L, Asp NG. Determination of insoluble dietary fiber and soluble dietary fiber in foods and products : collaborative study. J AOAC Int,1992,75：360—366 7 Li BW, Cardozo MS. Determination of total dietary fiber in foods and products with little or no starch ,nonenezymatic－gravimetric method: collaborative study. J AOAC Int,1994,77：687—689 8 杨晓莉,杨月欣.食品中总的不溶性及可溶性膳食纤维的酶—重量测定法.卫生研究，2001,30：377—379 |