达能营养中心第五届学术研讨会论文集

高键 薛安娜
复旦大学医学院附属中山医院营养科，上海 200032

关键词：同型半胱氨酸　ECV304细胞　细胞凋亡

　　中图分类号：R151.2 TS201.2 文献标识码:A
Study on the apoptosis induced by homocysteine
Gao Jian,Xue Anna
Zhongshan Hospital,Fudan University, Shanghai 200032, China
　　Abstract: Objectives:This study focused on the homocysteine－induced apoptosis of the ECV304 cell line, a spontaneously transformed immortal human endothelial cell line. Methods: The cytotoxicity of Hcy on the ECV304 cell line was measured by MTT assay. The apoptosis induced by Hcy was observed by morphologic methods, such as H.E. staining, Acridine Orange fluorescence staining, and transmission electron microscopy (TEM). DNA agarose gel electrophoresis and flow cytometry were used in combination to confirm the apoptosis. Results: The results show that Hcy(1～10mmol/L) produced dose－dependent and time－dependent suppression of ECV304 growth. Morphological evidences indicate that the ECV304 cell line revealed characteristic changes of apoptosis after treatment with 5.00mmol/L Hcy for 48 hours. With DNA agarose gel electrophoresis and flow cytometry, characteristics of apoptosis were evident after treatment with 5.00mmol/L Hcy for 36 hours. Conclusions: Hcy can inhibit the growth of ECV304 and induce the ECV304 cell line apoptosis.
Key words: homocysteine,ECV304,apoptosis

1 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所

　　同型半胱氨酸（Hcy）是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中一个重要的中间产物，高同型半胱氨酸(Hcy)血症是致动脉粥样硬化的独立危险因子。叶酸及VB6、VB12等营养素通过参与蛋氨酸和半胱氨酸代谢调节血中同型半胱氨酸的浓度。由于各种因素导致的血中Hcy浓度升高被认为是独立于其它已知的危险因素(高血压、高胆固醇血症、吸烟、肥胖等)的致动脉粥样硬化的危险因子[1,2]。近年来的研究发现，Hcy可损伤血管内皮细胞[3]，促进血管平滑肌细胞的增殖[4]，改变血液系统的抗凝状态及血小板功能[5]，促进低密度脂蛋白的氧化等[6]。 Hcy实际上参与了动脉粥样硬化斑块形成的各个阶段。本研究旨在探讨Hcy通过诱导细胞凋亡而损伤血管内皮细胞的机制。

1　材料与方法

1.1　细胞培养

　　人脐带静脉内皮细胞株（ECV304细胞），由正常人脐带静脉内皮细胞自发转化而成，呈典型的单层镶嵌排列，有接触抑制，可无限传代，不需要另加特殊的细胞生长因子。血管内皮细胞特有的Weibel－Palade 小体检测阳性，病毒颗粒检测阴性。ECV304细胞生长于完全M199培养基（含10％胎牛血清，20mmol/L Hepes、100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素），培养条件为37℃、5％CO2、饱和湿度。细胞传代时以0.25％的胰酶消化，稀释成1×105/ml的细胞悬液接种。

1.2　试剂与仪器

　　同型半胱氨酸、碘化丙啶(PI) 、MTT和Hepes为Sigma公司产品；M199培养基为GIBCOBRL公司产品；胰酶为Hyclong公司产品；DNA提取试剂盒为Promag公司产品；其余试剂均为国产分析纯或优质纯。超净工作台，CO2孵箱（美国VWR Scientific Inc, 1720型），516MC型自动酶标仪，流式细胞仪（美国Canlter公司EPICS型），透射电子显微镜（日本JEOL公司JEM－1010型），激光共聚焦扫描电子显微镜（美国Meridian公司Ultima212型）。

1.3　方法

1.3.1　MTT法测定Hcy对ECV304细胞增殖的抑制作用　取对数生长期细胞消化成单细胞悬液，调节细胞浓度为1×104/ml，接种于96孔细胞培养板，每孔接种100μl，分为9个剂量组，每组8个平行孔。接种24h后，细胞贴壁生长，弃上清，此时加入含不同浓度的Hcy完全M199培养基每孔100μl，继续培养12、24、48h后每孔加MTT 20μl（5mg/ml）。继续培养4h，弃上清，加DMSO 200μl/孔，震荡摇匀，自动酶标仪于490nm测各孔吸光度。考察Hcy对ECV304细胞增殖的抑制作用时，以其抑制率（IR）表示。

对照组A值－给药组A值

细胞抑制率IR（％）=×100％

　　 对照组A值

1.3.2　苏木精—伊红（HE）染色　将盖玻片置于平皿中，传入细胞，使细胞达到1×104/ml，接种24h后细胞在盖玻片上贴壁生长，弃上清，换含5mmol/L Hcy的完全M199培养基，继续培养48h后取出盖玻片进行染色观察。

1.3.3　吖啶橙荧光染色法　调节细胞浓度为1×105/ml，接种于25ml细胞培养瓶。接种24h后，细胞贴壁生长，弃上清，加入含5mmol/L Hcy的完全M199培养基，继续培养48小时后取出消化成单细胞悬液,调节细胞浓度为5×106/ml。取95μl的细胞悬液，加5μl的吖啶橙染液混匀。置室温5～10min。吸一滴混合液点于洁净的载玻片上，直接用盖玻片封片。在激光共聚焦扫描电子显微镜下观察并摄片。

1.3.4　电镜观察　调节细胞浓度为1×105/ml，接种于100ml细胞培养瓶。接种24h后，细胞贴壁生长，弃上清，加入5mmol/L Hcy的完全M199培养基，继续培养48小时后取出制作电镜样品。用自制细胞刮子将细胞刮下，收集于1.5ml的离心管。5％的戊二醛固定，1％锇酸固定，50％～100％乙醇，100％丙酮逐级脱水，环氧树脂Epon821浸透12h，60℃24h聚合。常规超薄切片，经50％乙醇饱和，醋酸双氧铀－枸橼酸铅双重染色。在透射电镜下观察细胞形态、细胞膜、细胞器及细胞核的变化。

1.3.5　琼脂糖凝胶DNA电泳　调节细胞浓度为1×105/ml，接种于100ml细胞培养瓶。接种24h后，细胞贴壁生长，弃上清，加入5mmol/L Hcy的完全M199培养基，继续培养12、24、36、48h后取出提取DNA。采用Promag公司的DNA提取试剂盒，按说明书操作。DNA 电泳： 1.5％琼脂糖铺板，加入EB(终浓度为0.5μg/ml)。取样品20μl（DNA约为100～300ng/孔）加入6×上样缓冲液，混匀，为上样液。Marker采用Biolab公司100bp DNA Ladder。电压15V/cm（50V，50mA）电泳4h，紫外灯下观察并拍照。

1.3.6　流式细胞仪测定　调节细胞浓度为1×105/ml，接种于100ml细胞培养瓶。接种24h后，细胞贴壁生长，弃上清，加入5mmol/L Hcy的完全M199培养基，继续培养12、24、36h后进行PI染色并测定。消化成单细胞悬液，离心，弃上清， PBS洗细胞一次，用300目筛网过滤2次。预冷70％乙醇固定，4℃保存。染色前离心，弃固定液，PBS洗细胞。加入200μl Rnase A，37℃水浴30min。加入800μml PI染液，混匀，至4℃避光30min。记录激发波长488nm处红色荧光。

2　结果

2.1 MTT法测定Hcy对ECV304细胞增殖的抑制作用

　　如附表所示，1～10 mmol/L剂量的Hcy对ECV304细胞的生长有抑制作用，且随剂量的增加，作用时间的延长，抑制作用亦增强。 2.2　苏木精—伊红（HE）染色

　　光学显微镜下正常细胞为多角形，单层镶嵌排列，细胞核呈蓝黑色，胞浆呈淡紫色（如图1）。凋亡细胞（5mmol/L Hcy作用48h）单个散在分布，表现为核染色质致密浓缩，核固缩（如图2）。

2.3　吖啶橙荧光染色法

　　在激光共聚焦扫描电子显微镜下观察，正常细胞为圆形或椭圆形，细胞结构完整，细胞核为均匀绿色荧光（如图3）。凋亡细胞可见细胞核固缩，染色质周边化，在核膜内侧形成新月体，或核碎裂成片段，分布在核膜周边。还可见到出芽形成的凋亡小体（如图4）。

2.4　电镜观察

　　与正常细胞相比，在5mmol/L的Hcy作用48h后，可见较多凋亡细胞，其形态特征是细胞体积变小，细胞质密度增高，线粒体及内质网结构不清晰，核变小，染色质浓缩并聚集成块（如图5～图6）。

2.5　琼脂糖凝胶DNA电泳

　　实验中可见正常细胞DNA条带停留在加样孔附近，5mmol/L Hcy作用12、24和48h时形成一条弥散条带，36h时可见明显的“DNA阶梯” （如图7）。

2.6　流式细胞仪测定

　　在5mmol/L Hcy作用12～36h后，在DNA荧光直方图上，凋亡细胞出现二倍体峰（G1细胞）的减少，在G1峰左侧出现亚二倍体细胞群的峰形，而且随着Hcy作用时间的延长，亚二倍体峰逐渐变大。随着Hcy作用时间的延长，凋亡指数由0.7％上升到了17.7％。

3　讨论

　　Hcy是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中的一个重要的中间产物，它将含硫氨基酸、还原性叶酸及VB6、VB12等联系起来，其代谢处于再甲基化作用和转硫化作用两个代谢的交叉点。遗传因素、营养缺乏等原因可导致血中Hcy升高，造成高同型半胱氨酸血症。近年来的研究表明，同型半胱氨酸是一种具有细胞毒性和神经毒性的因子[7]。

　　实验结果提示，Hcy对ECV304细胞的增殖有明显的抑制作用。随剂量的增加，作用时间的延长，抑制作用亦增强，存在着剂量－反应关系。 　　光学显微镜观察（HE染色）、荧光显微镜观察（吖啶橙荧光染色）以及电镜观察细胞超微结构的结果都发现，5mmol/L的Hcy在作用48h后出现了典型的细胞凋亡特征。在琼脂糖凝胶DNA电泳中，5mmol/L的Hcy在作用36h后出现了典型的“DNA Ladder",即DNA被核酸内切酶降解为180～200bp整倍数的寡核小体片段，而在12、24、48h均为弥散的条带。在细胞凋亡特征性的“DNA Ladder"出现后12h才出现明显的细胞形态学改变，这表明DNA断裂的出现要早于形态学方面的变化。细胞凋亡的另一个特征性的表现是在流式细胞仪检测中，在DNA荧光直方图上可呈现明显的亚二倍体核型峰的特征。研究中发现凋亡细胞出现亚二倍体峰与DNA电泳出现“DNA Ladder"具有同步性，均在5mmol/L的Hcy作用36h后出现。综合细胞形态学与DNA电泳及流式细胞仪检测的结果，可以确认5mmol/L Hcy可以诱导ECV304细胞的异常凋亡，这可能是高同型半胱氨酸血症造成血管内皮细胞损害的重要机制之一。

4　参考文献

1　Graham IM ,Daly LE ,Refsum HM ,et al. Plasma homocysteine as a risk factor for vascular disease. JAMA ,1997,277:759－781

2　Hankey GJ, Eikelboom JW. Homocysteine and vascular disease. Lancet, 1999 ,354:407－413

3　Doshi Sn, Goodfellow J, Lewis MJ, et al. Homocysteine and endothial function. Cardiovascular Res, 1999, 42:578－582

4　田学军，周爱儒，汤健，等. 同型半胱氨酸对大鼠血管平滑肌增殖的作用.中国生物化学与分子生物学报，1998,14（1）：108－112

5　Nishinaga M, Ozawa T, Shimada K. Homocystein,a thromdogenic agent, suppresses anticoagulant heparan sulfate expression in cultured poricine aortic endothelial cell. J Clin Invest, 1993,92:1381－1386

6　Andrew O,Sudesh K,Sood MJ, et al. Homocysteine－induced endoplasmic reticulum stress and growth arrest leads to specific changes in gene express in human vascular endothlial cells. Blood, 1999, 94(3):959－967

7 高炜. 全国高同型半胱氨酸血症与疾病学术研讨会纪要.中华医学杂志，1999，79(6):406－410