达能营养中心第五届学术研讨会论文集
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冯 翔 苏宜香 郭 艳 何志谦 |
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关键词：脂肪酸 血脂 免疫功能 中图分类号：R151 文献标识码：A The effects of dietary fatty acid composition on the lipid metabolism and immune function in mice Feng Xiang, Su Yixiang, Guo Yan，He Zhiqian Faculty of Medical Nutrition, School of Public Health,Sun Yat－sen University, Guangzhou 510089, China Abstract:The effects of various dietary SFA: MUFA: PUFA ratios (1:1:1 and 1:1.7:1.2) and n－6 PUFA to n－3 PUFA ratios (1～10:1) on lipid metabolism and immune function in mice were investigated. The results showed that when the fat mass in the diet was kept at normal level (7.84g/100g), the n－6/n－3 PUFA ratio which could maintain relatively lower serum lipids level was 1－5：1 when the SFA: MUFA: PUFA ratio was 1:1.7:1.2; While the desirable n－6/n－3 PUFA ratio was 1:1 when the SFA: MUFA: PUFA ratio was 1:1:1. The results also showed that the n－6/n－3 PUFA ratio was 1－5：1 when the SFA: MUFA: PUFA ratio was 1:1.7:1.2；While there were no significant difference found among different n－6/n－3 PUFA ratios when the SFA: MUFA: PUFA ratio was 1:1:1. The results suggested that when the SFA: MUFA: PUFA is 1:1.7:1.2 in typical Chinese diet, the optimal n－6/n－3 ratio, which can keep normal lipid metabolism and immune status, is between 1－5:1. Key words: fatty acid, lipid metabolism, immune function 随着工业化、城市化和膳食结构等环境因素的改变，心血管疾病、肿瘤等相关疾病发病率迅速上升，膳食脂肪摄入量及脂肪酸构成，尤其是多不饱和脂肪酸中n－6/n－3的比例越来越受到关注。 膳食脂肪酸并非独立存在于膳食中，膳食脂肪酸构成比，尤其是n－6与n－3比值对血脂代谢及免疫功能有不同影响。已有的多数研究采用了极高的脂肪供能比，研究的内容多单一涉及血脂代谢或免疫系统，因此所推荐的膳食脂肪酸构成比也有较大的差异[1,2]。对维持正常血脂代谢和免疫功能所必需的膳食脂肪酸构成比，尤其是n－6与n－3比值至今尚无定论。本研究以正常脂肪摄入量及常用脂肪酸构成比推荐值(S:M:P为1:1:1)和我国居民实际摄入脂肪酸构成比现状(1:1.7:1.2)为基础，观察了不同n－6/n－3构成比的膳食对动物血脂代谢及免疫功能的影响。 1 材料与方法 1.1 饲料的配制 本实验使用的饲料配方采用小鼠常备饲料配方，每百克饲料中含面粉20g、去胚玉米粉39g、麸皮10g、酪蛋白15g、食盐1g、酵母粉1g、碳酸钙粉1g、鱼肝油粉1g、鱼粉5g，以及核黄素4mg，经测定其脂肪含量为0.84％。在各个实验组的饲料配方中，基础饲料的成分不变，另加7g不同的混合食用油，用来满足实验设计对不同膳食脂肪酸构成比的需要。各组饲料所用食用油的百分含量如表1所示。 实验饲料提取脂肪后，各组饲料的脂肪含量平均为7.84％，气相色谱检测各组饲料的脂肪酸构成，结果如表2所示。 1.2 实验动物分组及饲养 二级雌性BALB/C小鼠，3～4周龄，体重10.8±2.65克，由中山医科大学实验动物中心提供。实验开始前予以普通饲料饲养一周，以适应环境，然后按体重随机分组，每组10～12只，分别按照实验设计喂饲10种不同脂肪酸构成比的饲料。本实验分两部分进行，每部分包含5组，其中一组为对照组，另四组为实验组，每组饲料的脂肪含量相同，而脂肪酸构成不同。实验设计中每组饲料的脂肪酸构成如表3。 Ⅰ－0组和Ⅱ－0组为对照组，其脂肪酸构成比与普通饲料脂肪酸构成相符。实验Ⅰ饲料SFA/MUFA/PUFA的比值接近1：1.7：1.2，实验Ⅱ饲料SFA/MUFA/PUFA的比值接近1：1：1，实验Ⅰ和实验Ⅱ的1～4组内n－6/n－3PUFA的比值约从1：1～10：1逐渐增加，达到了实验设计的要求。 小鼠分笼饲养，每笼5只，每天自由摄入单蒸水，每三天记录一次进食量，每两周记录一次体重变化，实验期10周。 实验期末处死动物前，禁食12小时，摘除眼球取血。取血后，移入无菌缓冲间，用75％酒精消毒腹部，在无菌条件下取出脾脏，分离脾淋巴细胞。 1.3 指标检测 1.3.1 一般指标检测 喂养期间称重并记录小鼠体重变化及进食量，计算体重周平均增长量和日平均进食量。 1.3.2 血脂检测 用日立7170全自动生化分析仪检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL－C)和高密度脂蛋白胆固醇（HDL－C）。TC采用CHOD－PAP酶法，TG采用GPO－PAP酶法，LDL－C和HDL－C采用直接法，并计算TC/HDL－C和LDL－C/HDL－C的比值。 1.3.3 脾淋巴细胞增殖活性（MTT法）[3] 无菌取脾，制成单个细胞悬液，调整细胞数为4×106/ml。取其加入96孔平底培养板，分8孔加入，每孔200μl，其中4孔加入50μg/ml的刀豆素(ConA) 25μl作为实验阳性孔，另4孔不加ConA作为阴性对照孔，置于CO2培养箱，37℃培养48小时。在细胞培养结束前4小时，于96孔平底培养板上每孔加入5mg/ml的MTT 10μl，在细胞培养结束前2小时，于96孔培养板上加入100μl缓冲液后测定光密度。用刺激指数（Stimulation Index，SI）来反映T淋巴细胞的增殖能力。SI=ConA刺激的阳性孔的平均光密度值/ ConA未刺激的阴性孔的平均光密度值。 1.3.4 白介素－2、4（IL－2, IL－4）测定 取上述淋巴细胞悬液，按每孔1ml加入24孔平底培养板，每孔再加入50μg/ml的ConA100μl，置于CO2培养箱，37℃培养48小时，培养结束时，吸取培养板中的淋巴细胞培养上清，无菌分装入0.5ml EP管中，放入－20℃的冰箱中保存，用于IL－2和IL－4含量的检测。IL－2和IL－4含量用ELISA检测试剂盒检测。 14 统计分析 数据以x±s表示，采用SPSS10.0软件包建立数据库并统计处理，进行Oneway－ANOVA分析，多组间均数进行方差齐性检验，方差不齐时，进行变量变换，组间两两比较采用LSD检验。 2 结果 2.1 实验I（SFA/MUFA/PUFA为1：1.7：1.2）结果 2.1.1 一般状况 小鼠的日平均进食量、周平均体重增加值、脏器系数经ANOVA分析各组间无显著性差异（P>0.05）。 2.1.2 血脂检测结果 小鼠血清TC、LDL－C和HDL－C检测结果如表4所示，5组的ANOVA分析表明，均具有显著性差异（P<0.05或P<0.01）。组间两两比较的LSD检验表明，血清TC、LDL－C和HDL－C含量在Ⅰ－1、Ⅰ－2、Ⅰ－3和Ⅰ－4组均显著低于对照Ⅰ－0组（P<0.05）。TC/HDL－C和LDL－C/HDL－C比值在Ⅰ－1、Ⅰ－2、Ⅰ－3和Ⅰ－4均显著低于对照Ⅰ－0组。血清TC/HDL－C比值在Ⅰ－3和Ⅰ－4组显著高于Ⅰ－1和Ⅰ－2组（P<0.05）。 2.1.3 脾淋巴细胞增殖功能检测结果 小鼠脾淋巴细胞的增殖功能检测结果如表5所示，5组的ANOVA分析表明，刺激指数具有显著性差异（P<0.01），组间两两比较的LSD检验表明，Ⅰ－3和Ⅰ－4组显著低于Ⅰ－0、Ⅰ－1和Ⅰ－2组（P<0.05）。 2.1.4 IL－2,IL－4含量测定 小鼠淋巴细胞培养上清的IL－2含量检测结果如表6所示，5组的ANOVA分析表明，IL－2含量具有显著性差异（P<0.05），组间两两比较的LSD检验表明，Ⅰ－1和Ⅰ－2组显著高于对照Ⅰ－0组（P<0.05）。小鼠淋巴细胞培养上清的IL－4含量检测结果如表6所示，5组的ANOVA分析各组间无显著性差异（P>0.05）。 2.2 实验II（SFA/MUFA/PUFA为1：1：1）结果 2.2.1 血脂检测结果： 表7结果说明，5组小鼠血清TC、TG、LDL－C和HDL－C以及TC/HDL比值均具有显著性差异(p<0.01)， LSD检验表明，血清TC和LDL－C水平在1组均显著低于2、3和4组(P<0.05)。 2.2.2 脾淋巴细胞增殖功能检测结果 小鼠T淋巴细胞的增殖功能检测结果如表8所示，5组的ANOVA分析表明，脾淋巴细胞刺激指数（SI）5组间不具有显著性差异。 2.2.3 淋巴细胞培养上清的IL－2和IL－4含量检测结果 小鼠淋巴细胞培养上清的IL－2和IL－4含量检测结果如表9所示，5组的ANOVA分析表明，IL－2和IL－4含量均不具有显著性差异(P<0.05)。 3 讨论 膳食脂肪酸的结构如碳链长度、饱和程度、空间构象及衍生物的不同对机体本身的血脂成分、细胞膜功能及细胞因子等均有不同作用，从而对心血管疾病、动脉粥样硬化以及机体的免疫功能产生影响。近几年来，对脂肪酸的研究重点逐渐转移到各类脂肪酸的膳食构成比及其在体内平衡的重要生理意义。 关于膳食中SFA、MUFA和PUFA的摄入现状，目前报道较少。广州地区膳食调查结果S/M/P比值为1:1.6～1.7:1.2[4]，与我国部分地区膳食调查的S/M/P比值（1:1.6:1.1）接近[5]。日本一项关于10～11岁女孩的膳食调查表明，脂肪供能比为34％，其中SFA占11％，MUFA占12％，PUFA占11％[6]。 膳食中脂肪酸的种类及其构成比对机体的血脂代谢和免疫功能有着重要影响，然而目前的研究基本上是偏重于单一因素，缺乏整体方面的研究。关于脂肪酸构成比，各国的推荐值也不尽相同。英国和美国都曾提出SFA、MUFA和PUFA三者之间的比值应为1:1:1[7]，而日本学者认为此三者比例应为1:1.5:1[8]。中国营养学会制订的膳食营养素参考摄入量（DRIs）推荐SFA/MUFA/PUFA的比值为<1：1：1[9]。关于n－6/n－3PUFA的比例，加拿大和日本推荐比值为4，而英国学者提出该比值应为6。世界卫生组织和联合国粮农组织也建议食用油中亚油酸和亚麻酸的合理比值为5～10[10]。至今对于二者的合理比值仍有争论，由于我国居民膳食中SFA比例随经济的发展而逐步升高，n－6PUFA来源比较广泛，而n－3系脂肪酸来源相对受限制。因此，适合我国国情的膳食脂肪酸构成比至今尚无明确定论。 本研究结果表明，SFA/MUFA/PUFA为1:1.7:1.2的情况下，当膳食中n－6PUFA/n－3PUFA比值升高时，即膳食中n－3PUFA的含量降低时，血清TC、LDL－C和TC/HDL－C水平亦升高，其中TC和TC/HDL－C水平在n－3PUFA含量较高的Ⅰ－1（n－6/n－3为1.34：1）和Ⅰ－2组（n－6/n－3为4.57：1）显著低于n－3PUFA含量较低的Ⅰ－3和Ⅰ－4组（P<0.05）。SFA/MUFA/PUFA为1：1：1时，当膳食中n－6PUFA/n－3PUFA比值升高时，血清TC及LDL－C水平随着升高，其中n－3PUFA含量最高的Ⅱ－1组(n－6/n－3为0.72：1)显著低于其他三组（P<0.05）。结果提示，在膳食总脂肪摄入正常状况下，n－6/n－3PUFA比值在1～10：1范围内，SFA/MUFA/PUFA为1：1.7：1.2时， n－6/n－3PUFA比值介于1～5：1之间，能维持血脂在较低水平；SFA/MUFA/PUFA为1：1：1，n－6/n－3PUFA比值约为1时，其血脂也在较低水平。 这一研究结果与前人[11,12]研究结果相一致。值得注意的是，大多文献所获得的有关血脂水平随膳食中n－6PUFA/n－3PUFA比值的升高而升高的结果，其研究前提是高脂膳食(约20g/100g)，而本研究所采用的是正常脂肪膳食(7.84g/100g)，二者结果的一致性表明，在正常脂肪供能比的前提下，n－3及n－6PUFA的适当增加，有利于维持较低的血脂水平。 本研究结果表明， SFA/MUFA/PUFA为1：1.7：1.2时，脾淋巴细胞的刺激指数（SI）和IL－2水平在n－6/n－3PUFA比值较低的Ⅰ－1组（n－6/n－3为1.34：1）和Ⅰ－2组（n－6/n－3为4.57：1）均显著高于n－6/n－3PUFA比值较高的Ⅰ－3（n－6/n－3为8.54：1）和Ⅰ－4组（n－6/n－3为10.03：1）（P<0.05）。SFA/MUFA/PUFA为1：1：1时，不同n－6/n－3比值的各组脾淋巴细胞刺激指数（SI）以及IL－2和IL－4水平均无显著性差异。结果提示，在膳食总脂肪摄入为7.84g/100g，SFA/MUFA/PUFA为1：1.7：1.2时，n－6/n－3PUFA比值介于1～5:1时，细胞免疫功能相对较强；当SFA/MUFA/PUFA为1：1：1，n－6/n－3PUFA比值在1～10:1范围，不同的n－6/n－3比值对细胞免疫功能无显著影响。 与以往的实验研究膳食鱼油和富含n－3PUFA的植物油对免疫功能的具有抑制作用以及在高脂膳食的情况下，细胞免疫功能随n－6PUFA/n－3PUFA比值的升高而升高的实验结果不同。在本实验设计的前提下，n－3PUFA含量较高的Ⅰ－1和Ⅰ－2组以及Ⅱ－1和Ⅱ－2组对免疫功能没有表现出抑制作用，这可能与本研究中所用n－3PUFA数量较少有关，有文献报道，鱼油含量多是在20－25g EPA＋DHA/100g总脂肪酸，才表现出免疫抑制的结果[13,14]，本研究的EPA和DHA的含量在Ⅰ－1和Ⅱ－1组最高，分别为总脂肪的7.48％和13.43％；此外，饲料中脂肪供能比的差异也可能是引起实验结果差异的另一原因。 综合上述膳食脂肪酸构成对血脂和免疫功能影响的研究结果，尽管本研究为动物实验，要从本实验结果外推到人类，还要进行深入的实验研究，并要通过进一步的流行病学实验去证实。但是本实验从动物的选择（选择杂食类小鼠和人类的膳食构成较为接近），到膳食总脂肪量及脂肪酸不同构成比例的设计都尽量去接近人类膳食脂肪的摄入模式，为膳食脂肪酸构成的研究及推荐摄入比值的建立提供了一定的基础。 在模拟目前我国居民典型膳食SFA/MUFA/PUFA的平均摄入水平接近于1：1.7：1.2的前提下，从保持较低血脂水平和不降低免疫功能两方面考虑，膳食中n－6PUFA/n－3PUFA的比值在1～5：1之间比较适宜。这一比值与2000年中国营养学会推荐的n－6PUFA/n－3PUFA比值为4～6：1[9]，日本学者建议的4：1[15]，美国学者推荐的2.3：1[16]较为接近。结合目前我国食用油资源，可以适当增加烹调油中n－3系亚麻酸的摄入，如大豆油、低芥酸菜子油和亚麻子油等或通过增加富含n－3系长链多不饱和脂肪酸的鱼类或鱼油的摄入来达到这一比值。 以过去较多推荐的SFA/MUFA/PUFA比值1：1：1为前提，从既能保持较低的血脂水平而又不对免疫功能产生抑制作用两方面考虑， n－6PUFA/n－3PUFA比值约为1：1较适宜。随着工农业革命的发展，由于油类的氢化加工工艺使植物油中所含有的n－3PUFA（ALA）降低，由于家畜养殖多用含n－6PUFA较多的谷类作为饲料使肉类食品中的n－3PUFA降低，从天然食物中很难获得n－6PUFA/n－3PUFA比值约为1的膳食。因此，在膳食SFA/MUFA/PUFA的摄入水平为1：1：1的前提下，要达到n－6PUFA/n－3PFUA比值约为1：1似乎不太实际。 美国心脏协会（AHA）曾向健康人群推荐膳食中SFA、MUFA和PUFA的供能比分别占总能量的10％，10％和10％。上述推荐值在实施30多年后，AHA又建议在总脂肪供能比安全可行的前提下，允许MUFA占总能量的15～16％，SFA、MUFA和PUFA的供能比分别占总能量的10％，15％和10％[17]。由于PUFA摄入过量存在的潜在危害，目前并不主张推荐摄入量超过10％[18]。本研究结果也提示，从维持正常血脂水平和免疫功能角度考虑，当目前中国居民典型膳食中SFA/MUFA/PUFA接近1：1.7：1.2时，n－6/n－3PUFA的比值在1～5：1之间较为适宜，与AHA的建议也相吻合。 4 参考文献 1 Chang NW and Huang PC. 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