达能营养中心第五届学术研讨会论文集
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李勇 |
文章编号：1000－8020（2002）S0－0052－04 摘要：目的 旨在探讨父母双方MTHFR基因型与后代发生先天性心脏病风险之间的关系。方法 采用成组病例－对照研究方案，收集来自辽宁省内沈阳、本溪、大石桥市、抚顺、大连等十余个市县研究对象肘静脉血液，用PCR－RFLP方法确定MTHFR基因型。结果 两组父、母亲单独比较其基因型构成、等位基因频率，无显著性差异；父母各种基因型组合两两比较也未见统计学差异。将父母的等位基因合在一起，则病例组的T等位基因频率（58.76％）显著高于对照组(50.77％),P<0.05,OR值1.30；父母双方均是纯合突变会增加后代患先天性心脏病的危险，P<0.05,OR值为3.84；通过计算后代纯合突变的概率，发现后代纯合突变的概率越大，患CHD的风险性越大。结论 父母双方的MTHFRC677T基因型对后代先心病的发生具有同等重要的作用，父母遗传给后代的一对突变等位基因（TT）是CHD发生的危险因素之一。 关键词：5，10—亚甲基四氢叶酸还原酶 先天性心脏病 病例－对照 中图分类号：R151．2 R591 文献标识码：A 先天性心脏病（简称先心病，congenital heart disease，CHD）是婴幼儿心脏疾患中最常见的疾病。它是指出生时就存在的心血管结构或功能异常，是由于胎儿时期心血管发育异常或发育障碍以及出生后应退化的组织未能退化造成的心血管畸形。除少数先心病是由单基因突变和染色体畸变引起外，大多数先心病是由遗传因素和环境因素相互作用引起的多基因遗传病。 同型半胱氨酸代谢酶(homocystein,Hcy)是甲硫氨酸代谢中产生的一种含硫醇的氨基酸，其代谢处于再甲基化作用和转硫化作用这两个代谢途径的交叉点。参与HCY代谢的关键酶之一，5，10－亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10－methylenetetrahydro－folate reductase ,MTHFR)， 催化5，10－亚甲基四氢叶酸还原为5－甲基四氢叶酸，后者是体内主要的甲基供体，参与核酸合成的一碳单位转移。5,10－亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)对决定Hcy水平有重要的作用,该酶的缺陷可导致5－甲基四氢叶酸合成减少,使Hcy不能甲基化为蛋氨酸而造成堆积。MTHFR由MTHFR基因编码,该基因677C→T突变可以使Hcy升高达3倍以上,导致中、高度的Hcy血症[1]。本研究旨在探讨父母双方MTHFR基因型与后代发生先天性心脏病风险之间的关系。 1 研究方法 1.1 样本量确定 用Epi 2000计算样本量，α=0.05,1－β=0.8，选取北方人群暴露率为30％，OR=2，按1：2（对照：病例）成组匹配病例－对照研究设计，需要病例组父母185对，对照组父母92对。本次研究得到病例组父母174对，对照组97对，基本满足设计要求。 1.2 研究对象 CHD父母年龄为25～35岁，均来自辽宁省的各个市县，包括抚顺、沈阳、盖洲市、阜新县、灯塔市、庄河市、大连金洲、大连开发区、大连市、瓦房店市等地。对照是与病例同一地区的生育健康孩子的健康成人。 1.3 资料收集 在护士采集外周血液的同时，由负责医生填写登记表，登记表包括父母、孩子的姓名、年龄、民族等一般情况及病例组母亲的异常孕产育史、孕期患病、服药、接触射线、农药等可导致孩子患先心病的因素。 1.4 基因型检测 用盐析法提取血液中的DNA,PCR－RFLP方法检测基因型。PCR反应所用的引物为5' －TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA－3'（sense）， 5'－AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG－3'(antisense)。PCR反应条件参考文献[2]。将PCR产物用限制性内切酶Hinf I于37℃消化过夜后,在12％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。 1.5 统计分析 用SPSS For Windows 11.0统计软件和Epi Infor2000软件进行统计分析，分析内容为：（1）分别比较父亲和母亲的MTHFR第677位基因型、C和T等位基因频率，计算OR值和95％可信区间，进行Mantel－Haenszel，χ2检验；（2）比较两组父母组合MTHFR基因677位C和T等位基因频率是否有差异；（3）计算两组父母可能生育纯合突变胎儿概率的比值。 2 结果 2.1 病例组和对照组父母基因型构成比的比较 分别比较病例、对照组父亲及母亲基因型构成比是否有显著性差异，如表1所示两组父母的基因型构成比在统计学上无显著差别。 2.2 两组父母MTHFR基因677位C和T等位基因频率比较 如表3、4所示，两组父母亲的等位基因频率在统计学上无显著差别。 2.3 病例组与对照组父母组合的等位基因频率比较 如表5所示，两组等位基因频率有差别，说明父母二人所含有的T等位基因数目越多，后代患先心病的可能性越大。 2.4 病例组与对照组父母基因型组合的比较 对两组中父母基因型的各种组合（TT/TT，TT/CT，TT/CC，CT/CT，CT/CC，CC/CC）构成比进行比较（见表6）。总的说来，父母的各种基因型组合在病例与对照组中没有显著性差异，但父母双方均是纯合突变的样本数量要高于对照组，将父母双方均是纯合突变的组合的构成比进行χ2检验，结果有统计学差别（χ2=5.10，P=0.024），OR为3.84（1.04～16.79）。 2．5 病例组与对照组中后代发生纯合突变的概率 病例组与对照组的亲代将两个突变等位基因TT都传递给后代的差异的比较（见表7）。 对照组后代纯合突变总概率: P1=(37×0＋27×0.25＋30×0.5＋3×1)/（37＋27＋30＋3）= 0.255 病例组后代纯合突变总概率: P2=(47×0＋51×0.25＋57×0.5＋19×1)/（47＋51＋57＋19）=0.340 二者比值：P2/P1=1.33，说明后代是纯合突变的概率越大，患先心病的风险性也就越大。进行两样本率的比较，P=0.00014,有统计学差异。 3 讨论 从1995年首先阐述神经管畸形与MTHFR C677T纯合突变有关开始[3,4]，相继有多项研究表明MTHFR677TT基因型是神经管畸形、冠心病、高血压等疾病的一个危险因子，但MTHFR677TT与先心病之间的关系的研究却鲜有报道。动物实验显示同型半胱氨酸可诱导鸡胚先天性心脏畸形发生[5]。影响先心病发生的因素包括环境和遗传，前者既有母亲在怀孕期间所处的外环境还有胎儿所处的母亲本身提供的发育环境。如果母亲是MTHFR677TT基因型，可能导致体内同型半胱氨酸水平升高，进一步影响胎儿心脏正常发育。遗传因素，孩子所得到的遗传信息一半来自父亲，一半来自母亲，而且越来越多的研究资料表明来自父母双方的同源染色体或等位基因存在着功能上的差异（即遗传印记）[6]，在此意义上讲，父亲与母亲的作用同等重要。本研究的目的就是探讨父母MTHFRC677T基因型对后代患先心病的影响。 本研究对父亲和母亲的基因型构成及MTHFR基因677位C和T等位基因频率进行单独比较，结果显示没有统计学差异；将父母双方合在一起，比较两组等位基因频率，发现病例组父母总的T等位基因频率(58.76％)显著高于对照组(50.77％)，提示先心病胎儿从父母遗传得到的T等位基因数目可能要高于正常胎儿；此研究还将父母的各种基因型组合，两两比较其在两组中比例，也未见有统计学差异，但病例组父母均为纯合突变的比例显著高于对照组（P<0.05），提示与父母双方为其他种组合方式相比，如果父母都是纯合突变，孩子患先心病的几率要大一些。 本次研究还计算了两组后代继承亲代等位基因T发生纯合突变的可能性。MTHFR是常染色体遗传，父母双方只要有一个为正常型，后代一定不会是纯合突变型TT；父母双方均为杂合子，后代有0.25的可能是纯合子；父母一方为纯合子一方为杂合子，后代则有0.5的可能是纯合子，当父母均为纯合子时，后代一定是纯合子。据此计算得病例组后代中发生纯合突变的总概率为0.340，对照组为0.255， P<0.05，有统计学差异差别（P<0.05）。提示孩子MTHFR677TT基因型与先心病发生有关。此结果与Junker等人进行的病例一对照研究相符。Junker等人对114名CHD病人228名健康对照的MTHFR的677位点的基因型与先心病之间的关系作了研究，认为MTHFR677TT基因型与先天性心脏结构畸形的发生显著相关 [7]。 由于未见父母MTHFR677TT基因型与先心病关系的报道，此次研究结果还无法与国内外相关的研究进行比较。此次研究存在几点不足：（1）病例组父母是调查期间存活的先心病患儿双亲，不包括那些由于先心导致流产、死胎、出生后死亡的患儿父母，同时病例组样本来自医院、妇幼保健院等医疗机构，存在选择偏倚；（2）由于要根据知情同意原则采集样本，对照是健康孩子的父母，有可能不合作，导致对照组样本数偏少；（3）按心脏畸形的类型或父母基因型组合进行分层，每一层的样本数量不足。 4 参考文献 1 Thomas G,Deloughery,Adam Evans BS,et al.Common mutation in methylene－ tetrahydrofolate reductase correlation with homocysteine in metabolism an late－onset vascular disease. Circulation, 1996,94: 347－354 2 Frosst P,Blom HJ,Milos R,et al.A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylene－ tetrahydrofolate reductase. Nat Genetic, 1995,10:111－113 3 Whitehead AS,Gallagher PM,Mills JL, et al.A genetic defect in 5,10 methylene －tetrahydrofolate reductase in neural tube defects.Q J Med,1995,88:763－766 4 Van der Put NM,Steegers－Theuissen RP,Frosst P,et al. Mutated methylene－ tetrahydrofolate reductase as a risk factor for spina bifida. Lancet,1995,346: 1070－ 1071 5 李勇，李松，陈光慧,等. HCY－2 基因和同型半胱氨酸与鸡胚先天性心脏畸形发生的关系.中华医学杂志，2000，2(80):131－134 6 李璞.医学遗传学. 北京：中国协和医科大学出版社，1999，36－38 7 Junker R,Kotthoff S, Vielhaber H. Infant methylenetetrahydrofolate reductase 667TT genotype is a risk factor for congenital heart disease .Cardiovasc Res，2001,(51)：2510－2514 表1 病例组与对照组父亲基因型构成比较(1) 组 别 CC n 占(%) CT n 占(%) TT n 占(%) 合计 N 占(%) 对照组 21 21.6 54 55.7 22 22.7 97 100 病例组 25 14.4 99 56.9 50 28.7 174 100 注：（1）χ2=2.82, P=0.244 表2 病例组与对照组母亲基因型构成比较（1） 组 别 CC n 占 (%) CT n 占 (%) TT n 占 (%) 合计 N 占(%) 对照组 20 20.6 55 56.7 22 22.7 97 100病例组 29 16.7 90 51.7 55 31.6 174 100 注：（1）χ2=4.90,P=0.086 表3 两组父亲MTHFR基因677位Ｃ和Ｔ等位基因频率比 较(1) 组别 C等位基因n T等位基因n 合计N(%) 对照组 96 98 194（100） 病例组 149 199 348（100） 注：（1）OR=1.31(0.91,1.89)；χ2=2.23,P=0.135
表4 两组母亲MTHFR基因677位Ｃ和Ｔ等位基因频率比 较（1） 组别 C等位基因n T等位基因n 合计N(%) 对照组 95 99 194（100） 病例组 148 200 348（100） 注：（1）OR=1.30(0.90,1.87)；χ2=2.09,P=0.487 表5 病例组与对照组父母等位基因频率的比较（1） 组别 C等位基因 T等位基因 染色体总数（ 2n） T等位基因频率（%） 对照组父母 191 197 388 50.77 病例组父母 297 399 696 58.76 注：（1）OR=1.30(1.01,1.68)；χ2=4.32,P=0.037
表6 病例、对照父母基因型组合构成比（1） 组别 TT和TT CT和TT TT和CC CT和CT CT和CC CC和CC 总计 对照组 3 30 8 27 25 4 97 病例组 19 57 10 51 30 7 174 合计 22 87 18 78 55 11 271 注：（1）χ2=7.633， P=0.178 表7 病例组和对照组后代为纯合突变的概率的比较 突变频率 病例组 对照组 OR 值 95％CI P值 0 47 37 － － － 0.25 51 27 1.49 0.75-2.95 0.221 0.5 57 30 1.50 0.77-2.91 0.202 1 19 3 4.99 1.25-23.03 0.009 |