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摘要：大豆异黄酮（Soy Isoflavone）是主要存在于豆类植物中的一类具有特殊生理功能的化合物，其结构与雌激素相似，故能够与雌激素受体相结合，从而表现出两种重要的生物学活性：雌激素样活性和抗雌激素样活性。流行病学调查研究表明大豆异黄酮具有改善妇女更年期综合征症状，抑制妇女绝经后骨量快速丢失的作用。本研究利用去卵巢大鼠作为更年期动物模型，进行了大豆异黄酮的安全性检验；首次在中国北方地区通过严格筛选试验对象，从多方面进行大豆异黄酮防治更年期综合征及其引发的绝经后骨质疏松的作用研究，并从细胞因子水平上探讨大豆异黄酮防治绝经后骨质疏松的作用机理，主要结论如下：（1）大豆异黄酮对切除卵巢后的大鼠的各脏器，尤其是对大鼠的子宫萎缩无明显影响，病理学检查无明显病理改变；（2）大豆异黄酮显著降低了更年期妇女的Kupperman评分，显著改善了妇女更年期症状；（3）通过超声方法检测试验对象骨密度，结果表明大豆异黄酮可显著增加更年期妇女的胫骨骨密度；（4）酶联免疫学方法检测试验对象血清中白细胞介素-6和肿瘤坏死因子，结果表明大豆异黄酮可能是通过降低这两种细胞因子的水平来防治绝经后骨质疏松的。
关键词：大豆异黄酮 植物雌激素 安全性检验 更年期综合征 骨质疏松
大豆异黄酮（soy isoflavone） 是一类植物雌激素，主要有金雀异黄素（染料木黄酮，genistein）和大豆苷原（daidzein）两种，其结构与雌激素相似，故能够与雌激素受体（Ers）结合，从而表现出两种重要的生物学活性：雌激素活性和抗雌激素活性。女性更年期，世界卫生组织定义为围绝经期、绝经期和绝经后期。这是女性从性成熟期逐渐进入老年期的过渡阶段，是人体衰老进程中一个重要而且生理变化特别明显的阶段[2,3]，更年期妇女综合征已成为影响妇女健康的严重问题，其中绝经期骨质疏松症是其主要并发症。至今为止，国内外已经进行了很多有关大豆异黄酮与更年期妇女综合征之间关系的流行病学研究[4-5 ]。围绝经期症候群其发生情况和严重程度在个体上因人而异。雌激素水平降低，对成骨细胞的刺激减弱，使骨形成和骨吸收平衡失调，导致绝经妇女骨吸收超过骨形成而导致骨钙丢失，骨的快速丢失导致骨质疏松症，是绝经后骨质疏松发病的最重要的原因。绝经后妇女骨质疏松发病率是同龄男性的6倍，其直接后果是骨折，严重影响生活质量。目前，对于外源性雌激素抑制骨吸收，降低骨的重建率，可阻止绝经后妇女骨量丢失已得到证实。雌激素补充疗法还可以保持腰椎、髋部、前臂等的骨量，可减少全身各部位骨折发生危险约50%。而大豆异黄酮有类雌激素作用，具有选择雌激素受体与之结合发挥拮抗作用，阻止雌二醇DNA的激活和蛋白质结合，避免了上述并发症。所以许多人提倡膳食中大豆制品的摄入来吸收植物雌激素以防治妇女更年期综合征及其并发症骨质疏松。现在很多研究[8,9]把大豆异黄酮作为雌激素替代物防治绝经后骨质疏松症。有关大豆异黄酮减少骨丢失的人体研究报道结果不一[10-12 ]，有关机制也未明[13 ]。
勿庸置疑，增加大豆及大豆制品的摄入有益于人体健康。随着社会的老龄化，绝经女性的健康已引起全社会的关注，雌激素替代疗法（ERT）虽疗效确定，但是长期应用雌激素的安全性（乳癌发生率及已患癌症复发率的影响，子宫癌、胆结石及深部静脉血栓的可能性）、可耐受性（因子宫出血停药）等问题仍在研究之中，使患者感到不安，而且绝经女性不愿接受ERT，因此大豆异黄酮在女性雌激素依赖性疾病中具有很好的应用前景。本项研究通过人群膳食干预试验，在中国北方地区首次进行了大豆异黄酮对妇女更年期综合征的作用研究，主要通过Kupperman评分调查服用大豆异黄酮后更年期症状的改善情况，测定受试者骨密度、性激素水平、血脂水平，从细胞因子（IL-6和TNF-α）水平上探讨大豆异黄酮改善更年期妇女骨质密度的可能机制，并且通过切除卵巢后的更年期动物模型考察大豆异黄酮的安全性。
（一）大豆异黄酮对妇女更年期综合征及绝经后骨质疏松的作用
一、材料与方法
1、研究对象
选择４５岁～５５岁之间，绝经５年以内且有更年期综合征症状的围绝经期妇女９０人为研究对象，排除停经五年以上者或５５岁以上者；妊娠或哺乳期妇女、过敏体质者；晚期畸形、残废、丧失劳动力；合并有心血管、脑血管、肝、肾和造血系统等严重原发性疾病、精神病患者；长期服用其它相关药物、保健食品不能立即停用者；不符合纳入标准，未按规定食用，无法判定疗效和资料不全影响效果和安全性判定者。
2、方法
２１ 治疗及分组
９０人随机双盲分为两组，大豆异黄酮９０ ｍｇｄ组和安慰剂对照组，每组４５人。试验期限六个月，两组在年龄、绝经年限、体重、孕产次等指标分布上无显著性差异。
２２ 检测指标
妇女更年期综合征采用国际统一评价标准Ｋｕｐｐｅｒｍａｎ评分调查问卷进行评价；采用Ｓｕｎｌｉｇｈｔ超声定量骨密度测定仪（以色列生产）测量受试对象桡骨远端和胫骨中段骨密度（ＢＭＤ）；采用７Ｓ９型全自动生化分析仪（美国Ｂｅｃｋｍａｎ公司生产）测定血清钙、血清磷和碱性磷酸酶，方法分别是离子电极法、磷钼酸法和硝基苯速率法。
3、大豆异黄酮服用方案
大豆异黄酮本实验室自制，为从大豆豆胚中提取，经低温喷雾干燥获得。经ＨＰＬＣ法测定大豆异黄酮含量为８５％，按比例配以淀粉混和制成每粒含大豆异黄酮２２５ｍｇ的胶囊。根据国内外研究资料，防治更年期综合征和骨质疏松的大豆异黄酮剂量一般在５０～９０ｍｇｄ１４。全部试食对象每日口服大豆异黄酮胶囊２次，每次２粒（即每人每天共摄入大豆异黄酮９０ｍｇ）。安慰剂胶囊主要由淀粉制成。
4、统计方法处理
所有结果均以均数χ±标准差（χ±ｓ）表示，采用ＳＡＳ ６１２统计软件进行统计分析。
二、结果
1、更年期症状改善情况（Kupperman评分）（见表1和表2）
Ｋｕｐｐｅｒｍａｎ评分法根据曹泽毅主编１５《 中华妇产科学》（下册）绝经过渡期和绝经后疾病中评分方法。
服用大豆异黄酮六个月后，从自身比较来看，剂量组试验对象全部１２项指标均得到改善，评分减少有统计学意义 ，对照组除了潮热出汗、失眠和泌尿系感染外其他指标也有所改善；从服用大豆异黄酮６个月后组间比较来看，除抑郁、眩晕、疲乏和头痛这几项外，在其他８项指标上剂量组都比对照组有明显改善，具有统计学意义。
2、各部位BMD的变化（见表3和图1）
服用大豆异黄酮胶囊六个月后，剂量组受试对象骨密度相比于基础值有增加的趋势，胫骨骨密度有显著性差异，但桡骨骨密度无显著性差异。而对照组受试对象的桡骨骨密度和胫骨骨密度与基础值相比没有增加，均无显著性差异。
3、骨代谢指标的变化情况（见表4）
服用大豆异黄酮胶囊六个月后，两组受试对象的血清钙均上升，且有显著性差异；血清磷变化不大；血清碱性磷酸酶有下降趋势，剂量组下降明显，有显著性差异。
4、血清性激素测定结果
从本试验结果（表5）可以看出，服用大豆异黄酮6个月后，两组试验对象的LH、FSH水平均呈下降趋势，剂量组的LH水平下降明显，差别有统计学意义。两组的E2水平均下降明显（p<005），但对照组下降的幅度更大（见图2，3）。从剂量组雌二醇水平下降趋势上来看，前三个月E2下降明显，与基础值相比有统计学意义，后三个月E2水平下降趋于缓和，六个月和三个月时相比差别无统计学意义（见表6、7），分析这可能是由于大豆异黄酮对人体雌激素的作用需要一段时间，随着作用时间的延长，提高雌激素水平的作用也越明显。相反，对照组雌二醇水平没有看到这种趋势，而是呈现直线下降趋势。
5、骨代谢指标测定结果（见表8）
服用大豆异黄酮胶囊六个月后，两组受试对象的血清钙均上升，且有显著性差异；血清磷变化不大；血清碱性磷酸酶有下降趋势，剂量组下降明显，有显著性差异（p<005）。
骨代谢指标反应灵敏、无创伤性，不仅可了解骨丢失和转换的速率，而且在骨质疏松症患者用药后的疗效评价、疗效监测方面也有其重要作用。在反映骨形成的代谢指标中，血清中碱性磷酸酶的活性可以反映骨形成的活跃程度，在绝经后10年内血清中碱性磷酸酶所占的比例可以升高至77%，一般认为血清碱性磷酸酶的升高是伴随着骨吸收的亢进而出现的代偿性骨形成增加引起的，在本实验中，剂量组试验对象的血清碱性磷酸酶明显降低，有统计学意义，反映了大豆异黄酮对骨吸收的抑制作用。
6、血清中细胞因子水平测定结果
从表9和图4可见，服用大豆异黄酮6个月后，对照组受试对象血清中两种细胞因子的水平变化不大，没有显著性差异；而服用大豆异黄酮的剂量组受试对象血清中IL-6和TNF-α的水平均下降明显，有显著性差异（ｐ＜００５）。组间比较来看（见表１０），试验前两组ＩＬ－６和ＴＮＦ－α的水平没有显著性差异，而六个月试验结束后，两组的ＴＮＦ－α水平存在明显差异，剂量组下降明显。
（二）大豆异黄酮对去卵巢大鼠更年期模型的安全性研究
一、材料与方法
1 试剂
受试样品（大豆异黄酮）：日本国立健康营养研究所提供，总大豆异黄酮含量为４０２０％。
2 实验动物来源：
４月龄雌性Ｗｉｓｔａｒ大鼠，购自黑龙江省药品检验所动物室，一级动物，体重２００ｇ～２５０ｇ，共８０只。
3 动物实验设计
３１ 动物喂养
雌性Ｗｉｓｔａｒ大鼠购回后，在动物室内用普通饲料喂养１周，再用自行配制的基础饲料喂养３天后，根据动物体重随机分为７组。实验期间，大鼠单笼饲养，每日定量喂食，每周定时称量大鼠体重一次，记录给食量、撒食量，
饮水量不限。动物室温度２０℃±２℃，相对湿度为４５％±１０％，通风良好。
３２ 绝经期骨质疏松动物模型建立
本研究采用腹部手术切除双侧卵巢的方法，使大鼠体内雌激素水平下降，造成大鼠更年期骨质疏松模型。术后喂养一周，根据体重重新分组，使各组体重一致。实验周期８周。
３３ 实验动物分组情况
本实验将大鼠分为７组，分别是：
正常大鼠对照组（Ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ）：喂饲基础饲料
假手术对照组（Ｓｈａｍ ｇｒｏｕｐ）：喂饲基础饲料
去卵巢组包括：去卵巢对照组（Ｏｖｘ ｇｒｏｕｐ）：喂饲基础饲料
高剂量大豆异黄酮组（Ｈ－ＳＩ）：大豆异黄酮含量０４％
中剂量大豆异黄酮组（Ｍ－ＳＩ）：大豆异黄酮含量０２％
低剂量大豆异黄酮组（Ｌ－ＳＩ）：大豆异黄酮含量００５％
雌激素对照组（ＥＣ）：己烯雌酚含量００６％
二、结果
1 对大鼠体重的影响
由表１１可以看出，实验前，各组大鼠的平均体重没有显著性差异。在实验进行过程中，雌激素对照组的大鼠体重从实验开始就呈明显下降趋势，第二周时与对照组和去卵巢对照组相比就有显著性差异（ｐ＜００１），此后，这一差异保持到实验结束。其他各大豆异黄酮剂量组大鼠体重与去卵巢对照组相比均无显著性差异。
2 对脏/体比值的影响
实验结束时，摘取大鼠的肝、脾、肾、子宫称重，计算各脏器与体重的比值，结果见表１２。
3 各组大鼠病理组织学检查
从大鼠各脏器病理组织学检查结果来看，各组大鼠的肝脏和脑都没有明显的病理改变。雌激素组的子宫发生了明显的病理学改变：内膜上皮细胞增生，细胞呈高核状，腺体数量增多，子宫内膜间质细胞肥大，间质疏松。大豆异黄酮高剂量组的子宫内膜上皮有时可见细胞高度不一，腺体数量及间质无明显变化。
讨论
本研究首次在国内尤其是北方地区全面的进行了在固定饮食条件下，大豆异黄酮对更年期妇女综合征症状、四肢骨骼密度、性激素水平等的研究工作，并且通过切除卵巢后的动物模型实验验证了大豆异黄酮对更年期妇女的安全性。本项研究严格筛选了研究对象，在主观症状评定上对Kupperman评分的所有12项指标都进行了严格的评定。从结果可以看出服用大豆异黄酮的剂量组试验对象在所有12项指标上都有改善，有统计学意义；对照组大多数症状也得到改善，可能是由于安慰剂产生的主观效应的缘故。可以看出大豆异黄酮在改善更年期综合征症状上的作用很明显，尤其是改善潮热出汗和失眠上作用尤为突出。通过定量超声方法检测试验对象骨密度，结果表明大豆异黄酮可显著增加更年期妇女的胫骨骨密度。另外，大豆异黄酮可降低更年期妇女体内FSH、LH的水平，抑制E2水平的下降。酶联免疫学方法检测试验对象血清中IL-6和TNF-α，结果表明大豆异黄酮可能是通过降低这两种细胞因子的水平来防治绝经后骨质疏松。
综上所述，大豆异黄酮防治妇女更年期综合征及其并发症绝经后骨质疏松症的动物实验及临床试验不同地区研究者的研究结果还不太一致，其可能原因如下：首先，大豆异黄酮的最佳摄入量还未有统一标准，上述研究中大豆异黄酮的用量往往是主观性的。而且不同研究者实验用大豆异黄酮来源及成分存在较大差异，有的是食物来源，有的是大豆异黄酮，还有的是大豆异黄酮中的某一单体，所观察到的结果有可能受食物中的成分及大豆异黄酮中单体成分之间比例的影响。第二，大豆异黄酮代谢吸收受肠道菌群、膳食以及内源性雌激素水平的影响，因此，即使大豆异黄酮摄入量相同，不同个体血浆异黄酮浓度也有很大的差异。第三，不同研究者的实验设计方案不同，尤其是临床试验结果受研究对象和观察例数等诸多因素的影响。虽然对大豆异黄酮防治绝经后骨质疏松症作了不少研究，但仍需大量长期的人体研究以彻底证明其临床有效性和安全性。大豆异黄酮对骨代谢调节作用的机制不明之处还很多，还需进一步深入探讨。现已证实，除防治骨质疏松症外，大豆异黄酮对绝经后妇女还发挥着多重有益的作用。因此，大豆异黄酮及其衍生物是一类具有良好开发和应用前景的保健品及药物。
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作者简介：崔洪斌，迟晓星 | 