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摘要：目的 建立优化外周血核黄素及其衍生物水平的HPLC微量测定方法，探讨其对核黄素营养状况变化的灵敏性、特异性，同时为建立我国成年人正常外周血核黄素及其衍生物水平提供初步数据。方法 通过大鼠核黄素缺乏与补充实验，比较血浆、红细胞核黄素及其衍生物对于核黄素营养状况变化反应的灵敏性、特异性；进一步通过人体试验，验证动物实验的结果。结果 建立了外周血核黄素及其衍生物水平的HPLC微量测定方法；大鼠核黄素缺乏后，尿核黄素排出量迅速下降，血浆核黄素水平也显著下降，随之血浆、红细胞核黄素衍生物也呈下降趋势，补充核黄素后，上述指标趋于恢复；核黄素营养不良的人体志愿者补充核黄素后，血浆核黄素水平也迅速恢复。结论 血浆核黄素是评价核黄素营养状况的灵敏指标，适宜应用于核黄素营养状况的评价。
关键词：核黄素；营养评价
核黄素（ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ）又称维生素Ｂ２，在体内以黄素腺嘌呤二核苷酸（ｆｌａｖｉｎ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＦＡＤ）、黄素单核苷酸（ｆｌａｖｉｎ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＦＭＮ）两种衍生物形式在体内作为辅酶参与氧化还原反应，与能量代谢密切相关；另外，核黄素在体内还参与维生素Ｂ６和烟酸等的代谢［１２］。
我国居民传统的膳食结构不尽合理，核黄素摄入不足一直是我国居民膳食中存在的重要营养问题之一。全国第三次营养调查结果显示我国居民的核黄素平均每标准人每日摄入量仅为０．８ｍｇ，是１９８８年制定的ＲＤＡ的５８．４％，全国第四次营养调查结果出现了类似结果。自上世纪５０年代以后，有关核黄素营养状况评价方法的研究有了较大的进展，国外一些实验室相继研究建立了灵敏的红细胞谷胱甘肽还原酶活性系数法。国内顾景范等通过对国外方法的改进，建立了适合我国国情的全血谷胱甘肽还原酶活性系数（Ｂｌｏｏｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ， ＢＧＲＡＣ）测定方法３，该法目前已经广泛应用于国内核黄素代谢和营养状况评价的研究之中。但是，ＢＧＲＡＣ作为核黄素营养状况的评价指标仍然为间接性的评价指标，从理论上而言，外周血或组织脏器的核黄素水平才是核黄素营养状况直接性的评价指标。由于过去核黄素的测定需要采用繁琐复杂的微生物法或荧光法，不能区分核黄素及其衍生物，难于应用于实际工作中大批量样品的测定，也难于满足研究工作深入的需要。随着高效液相色谱（Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ）技术的不断发展和应用，生物样品中微量核黄素的准确测定已经成为现实。我们曾采用ＨＰＬＣ技术建立了大鼠外周血核黄素的测定方法，初步试验结果显示动物喂养核黄素缺乏饲料后，外周血核黄素水平急剧下降，下降幅度明显大于ＢＧＲＡＣ的下降幅度４。因此，有必要进一步探讨血浆核黄素及其衍生物应用于核黄素营养状况评价的可能性。
１．ＨＰＬＣ测定方法的建立与优化 1.1 血浆核黄素及其衍生物的测定
根据以往建立的血浆核黄素ＨＰＬＣ测定方法４，我们进一步探讨了将该法同时应用于测定核黄素衍生物ＦＡＤ、ＦＭＮ的可能性，结果显示核黄素、ＦＡＤ、ＦＭＮ标准（均购自Ｓｉｇｍａ公司）分离效果较好。进一步研究我们发现ＦＭＮ、ＦＡＤ经样品前处理后（乙腈、三氯甲烷处理）， ＦＭＮ、ＦＡＤ标准合并成一个新的色谱峰。
根据上述方法摸索结果，我们在样品测定过程中，标准同样也经乙腈、三氯甲烷处理，样品测定时得到ＦＭＮ峰实际上为ＦＭＮ与ＦＡＤ的衍生峰，合并计算为核黄素衍生物，以ＦＭＮ标准计算，核黄素则以核黄素标准单独计算。本法血浆ＦＭＮ回收率为９１．８±８．３％（８次），血浆核黄素回收率为１０１．４±４．８％（６次）。ＦＭＮ日内、日间ＲＳＤ（％）分别为４．４％、９．４％，核黄素日内、日间ＲＳＤ（％）分别为６．７％、１０．２％。ＦＭＮ、核黄素最低检测限分别为２．０ ｎｍｏｌＬ、２．５ｎｍｏｌＬ。
1.2 红细胞核黄素及其衍生物的测定
冷的生理盐水洗涤红细胞三次，以蒸馏水按１∶４比例悬浮红细胞，采用超声波细胞破碎仪破碎红细胞制备溶血液，然后以处理血浆样品的方法处理之，最后离心后取上清液进行ＨＰＬＣ分析。同时测定溶血液中血红蛋白（Ｈｂ）含量，以溶血液Ｈｂ含量校正红细胞核黄素、核黄素衍生物（ＦＭＮ＋ＦＡＤ）的含量。以本法测得红细胞ＦＭＮ、核黄素的回收率分别为９０．９±４．５％、１０４．９±３．８％。
２．核黄素缺乏与补充动物试验
2.1 材料与方法
２．１．１ 动物与分组
健康雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠，２月龄，体重１６０～１８０ｇ，按体重随机分为正常对照组、正常对喂组和核黄素缺乏组，每组１０只动物。正常对照组饲ＡＩＮ－９３Ｇ配方含核黄素饲料，核黄素缺乏组饲ＡＩＮ－９３Ｇ配方无核黄素饲料，正常对喂组与核黄素缺乏组相对喂，饲料为ＡＩＮ－９３Ｇ配方含核黄素的饲料。除了正常对喂组外，其余动物均自由摄食，不限饮水，实验周期４周。于实验开始以及每周末，收集三天尿样，采大鼠空腹眼眶血，肝素抗凝，离心分离血浆和红细胞，测定相关指标。进入第５周，核黄素缺乏组动物改饲ＡＩＮ－９３Ｇ配方含核黄素饲料，以观察补充后恢复效果。
２．１．２ 指标测定
动物每周体重、每日摄食量－称量法
ＢＧＲＡＣ－ＮＡＤＰＨ法
血红蛋白－氰化高铁血红蛋白法
红细胞还原性谷胱甘肽（ＧＳＨ）－ＤＴＮＢ显色法，以南京建成生物公司试剂盒测定
血浆丙二醛（ＭＤＡ）－ＴＢＡ比色法
血浆核黄素及其衍生物－ＨＰＬＣ法
红细胞核黄素及其衍生物－ＨＰＬＣ法
2.2 结果
２．２．１ 实验期间动物摄食量、体重的变化
与正常对照组动物相比较，核黄素缺乏后２周内动物摄食量变化不明显，２周后才开始下降。各组动物体重出现了相似的变化，但是正常对喂组动物下降幅度小于核黄素缺乏组，说明核黄素缺乏组动物体重下降的原因并不完全是摄食量下降造成，核黄素缺乏进一步加重了动物体重下降幅度。自由摄食后，核黄素缺乏组与正常对喂组动物摄食量均大于正常对照组，核黄素缺乏组动物体重有所恢复，但是，仍然显著低于正常对照组，正常对喂组动物体重接近正常对照组动物。
２．２．２ 血浆ＭＤＡ水平
实验期间，各组之间血浆ＭＤＡ水平无显著差异（表２），说明核黄素缺乏对体内脂质过氧化没有显著影响，但是，在氧化应激情况下，核黄素缺乏影响如何尚需探讨。
２．２．３ 红细胞ＧＳＨ水平
结果显示动物核黄素缺乏３周后红细胞ＧＳＨ水平显著下降，正常对喂组动物红细胞ＧＳＨ水平也有所下降，说明摄食量减少也是造成红细胞ＧＳＨ水平下降的原因之一。改喂含核黄素的正常饲料后，核黄素缺乏动物红细胞ＧＳＨ水平恢复较快。
２．２．４ 尿核黄素排出量
核黄素缺乏一周后，动物尿核黄素排出量显著迅速下降，４周末，核黄素缺乏动物的尿核黄素排出量仅为正常对照组动物的１．６％。对喂组动物尿核黄素排出量也有显著下降，表明摄食量减少也影响到尿核黄素排出量。改喂含核黄素的正常饲料后，核黄素缺乏动物的尿核黄素排出量一周后尚没有完全恢复到正常对照组动物的水平。
２．２．５ 全血谷胱甘肽还原酶活性系数
动物摄入核黄素缺乏饲料后，ＢＧＲＡＣ呈升高趋势，但是，与正常对照组相比较，核黄素缺乏组动物ＢＧＲＡＣ仅升高了２３．１％。改喂含核黄素的正常饲料后，ＢＧＲＡＣ很快恢复。正常对喂组动物摄食量减少对ＢＧＲＡＣ影响不是十分明显。
２．２．６ 血浆核黄素浓度
动物摄入核黄素缺乏饲料后，血浆核黄素浓度下降显著，４周末仅为正常对照组的８．１％，改喂含核黄素的正常饲料后，血浆核黄素浓度迅速回升。正常对喂组动物尽管摄食量有所下降，但是，血浆核黄素浓度下降不明显（表１）。
２．２．７ 血浆核黄素衍生物（ＦＭＮ＋ＦＡＤ）浓度
动物摄入核黄素缺乏饲料后，血浆核黄素衍生物浓度呈下降趋势，但是，变化幅度明显小于血浆核黄素浓度变化。改喂含核黄素的正常饲料后，血浆核黄素衍生物浓度迅速回升。正常对喂组动物尽管摄食量有所下降，但是，血浆核黄素衍生物浓度下降不明显（表２）。
２．２．８ 红细胞核黄素浓度
核黄素缺乏以及补充恢复后动物红细胞核黄素浓度的变化与血浆核黄素浓度变化相类似，４周末缺乏组动物红细胞核黄素浓度仅为正常对照组的４４．５％。正常对喂组动物实验期间尽管摄食量有所下降，但是，红细胞核黄素浓度下降不甚明显（表３）。
２．２．９ 红细胞核黄素衍生物（ＦＭＮ＋ＦＡＤ）浓度
核黄素缺乏以及补充恢复后动物红细胞核黄素衍生物浓度的变化与血浆核黄素衍生物浓度变化相类似，但是，下降幅度要小于核黄素浓度下降的幅度。正常对喂组动物尽管摄食量有所下降，但是，红细胞核黄素衍生物浓度下降不明显（表４）。
３ 现场人体试验
３．１ 一般营养状况及核黄素营养状况的调查
我们采用记账法对某人群（６０人）进行了为期６天的膳食调查，包括一个周末，该人群以健康男性青年为主，年龄为（２１±３）岁，集中供膳，平时担任繁重的训练与工作任务，属重度劳动强度。
结果显示该人群维生素Ｂ２的摄入情况也不容乐观，为参考摄入量的８５．７％，上述情况估计与该人群食物消耗构成不尽合理有关。尿核黄素含量有１人处于缺乏状态（占１．７％），１８人处于不足状态（占３０％），其余均处于正常状态（占８．３％）。ＢＧＲＡＣ有４人处于不足状态（占６．７％），其余均处于正常状态（占９３．３％）。
６０个调查对象血浆核黄素浓度数据呈偏态分布，血浆核黄素衍生物浓度也呈偏态分布，若将调查对象中尿Ｂ２含量与ＢＧＲＡＣ缺乏与不足状态者排除，再将剩下尿Ｂ２含量与ＢＧＲＡＣ正常者的数据转换成正态分布，按正态分布法进行正常值可信范围的估计，然后再将结果转换成原始数据，结果见表５，其中，血浆核黄素８０％可信正常值范围与国外Ｈｕｓｔａｄ等的报道正常值范围（中位数１０．５ｎｍｏｌＬ，８０％可信范围５．４～２８．４ｎｍｏｌＬ）十分接近。
３．２ 干预试验
选择在调查中ＢＧＲＡＣ高于１．１２以上者１０名作为干预对象，另选择１０名ＢＧＲＡＣ低于１．１０以下者１０名作为对照对象，干预对象服用核黄素片剂，共６天，为了排除其它维生素缺乏或不足的可能干扰，干预与对照对象均同时加服维生素Ｂ１、Ｂ６、Ｃ片以及ＡＤ和Ｅ胶丸。干预试验结束后，采取空腹血，收取一定量晨尿，测定有关指标。
结果显示，干预前两组尿核黄素含量、ＢＧＲＡＣ均有显著差别，干预后，干预组尿核黄素含量显著升高，两组ＢＧＲＡＣ也没有显著差别，说明核黄素干预效果明显，由表６可知，核黄素干预后，能够显著提高血浆核黄素浓度水平，但是，对于其衍生物（ＦＡＤ＋ＦＭＮ）浓度升高效果不明显，提示核黄素衍生物水平的升高比较缓慢，此与动物实验中的结果一致。
４ 结论
４．１ 我们改进了原有的ＨＰＬＣ测定血浆核黄素的方法，重复性及回收试验结果良好。
４．２ 核黄素缺乏后，大鼠血浆核黄素浓度、尿核黄素排出量迅速下降，血浆核黄素衍生物含量、红细胞核黄素及其衍生物也出现下降趋势，但是，下降幅度小于血浆核黄素浓度及尿核黄素排出量的下降幅度；ＢＧＲＡＣ呈升高趋势，变化幅度也明显小于尿核黄素排出量及血浆核黄素浓度的变化幅度；核黄素缺乏动物红细胞ＧＳＨ含量也显著减少。补充核黄素恢复后，动物血浆核黄素浓度水平恢复迅速。上述结果说明血浆核黄素浓度是一个评定核黄素营养状况的敏感指标。
４．３ 我们对某核黄素营养不良人群进行了核黄素干预，结果显示，服用核黄素后能够显著增加尿核黄素排出量，同时，也显著提高血浆核黄素浓度水平，但是，对于其衍生物（ＦＡＤ＋ＦＭＮ）浓度没有显著影响，说明核黄素营养状况的恢复需要一定的时间，此与动物实验结果相一致。
４．４ 通过计算，我们初步建立了我国青年人群血浆核黄素正常参考浓度，８０％可信正常值下限为５．９７ｎｍｏｌＬ，中位数为９．７０ｎｍｏｌＬ。
参考文献
１葛可佑 翟凤英 阎怀成 等． ９０年代中国人群的膳食与营养状况． 营养学报 １９９５，１７：１２３．
２中国营养学会． 中国居民膳食营养素参考摄入量． 北京：中国轻工业出版社，２０００．
３顾景范 陈玉珍 王宗印． 全血谷胱甘肽还原酶活性系数评价实验性核黄素缺乏的研究． 营养学报 １９８１，３：２５１－２６０．
４韦京豫 郭长江 杨继军 等． 高效液相色谱法测定大鼠血浆和全血核黄素含量． 色谱 ２００３，２１：３７５．
５Ｈｕｓｔａｄ Ｓ，ＭｃＫｉｎｌｅｙ ＭＣ，ＭｃＮｕｌｔｙ Ｈ，ｅｔ ａｌ． Ｒｉｂｏｌａｖｉｎ，ｆｌａｖｉｎ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ａｎｄ ｆｌａｖｉｎ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ ａｔ ｂａｓｅｌｉｎｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｌｏｗ－ｄｏｓｅ ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００２，４８：１５７１．
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